莫曉瑋 唐凱銳 王靜

〔摘要〕 目的 探討黃芩湯對潰瘍性濕熱證小鼠腸道菌群的影響。方法 將C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為空白對照（NC）組、模型（DSS）組、黃芩湯（HQD）組，每組7只。除NC組正常飼養(yǎng)外，其余2組均給予高脂高糖飲食，同時(shí)暴露在溫度32 ℃、濕度90%環(huán)境中，每天持續(xù)16 h，連續(xù)15 d后，自由飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉水7 d。HQD組給予黃芩湯（9.1 mg/kg），NC組、DSS組均給予同體積蒸餾水灌胃7 d，期間觀察小鼠一般情況，評價(jià)其疾病活動指數(shù)（disease activity index， DAI）。處死小鼠后，取中段結(jié)腸評價(jià)小鼠病理改變，取盲腸內(nèi)容物進(jìn)行16S rDNA高通量測序。結(jié)果 與NC組比較，DSS組小鼠DAI評分顯著增高，結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)受損，腸道菌群多樣性降低，變形菌（Proteobacteria）、擬桿菌屬（Bacteroides）、大腸埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus torques）相對豐度顯著提高，厚壁菌門（Firmicutes）、布勞特氏菌屬（Blautia）、毛螺菌屬（Lachnospiraceae NK4A136 group）相對豐度顯著下降;經(jīng)黃芩湯治療后，能顯著減輕模型小鼠的疾病活動，修復(fù)其結(jié)腸的病理損傷，逆轉(zhuǎn)腸道菌群的紊亂。結(jié)論 黃芩湯可能通過提高菌群多樣性及調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎濕熱證小鼠菌群豐度，提升腸黏膜的完整性以發(fā)揮生物屏障功能，從而發(fā)揮治療作用。

〔關(guān)鍵詞〕 潰瘍性結(jié)腸炎;濕熱證;黃芩湯;腸道菌群;菌群多樣性;菌群相對豐度

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.008

Effect of Huangqin Decoction on intestinal flora in mice with damp-heat

syndrome of ulcerative colitis

MO Xiaowei， TANG Kairui， WANG Jing*

（College of Traditional Chinese Medicine， Jinan University， Guangzhou， Guangdong 510632， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the effect of Huangqin Decoction on the intestinal flora of mice with damp-heat syndrome of ulcerative colitis. Methods C57BL/6 male mice were randomly divided into blank control （NC） group， model （DSS） group and Huangqin Decoction （HQD） group， with seven mice in each group. Except for the normal feeding in the NC group， the other two groups were given a high-fat and high-sugar diet， and were exposed to a temperature of 32 °C and a humidity of 90% for 16 h a day. After 15 consecutive days， they were given free access to 2.5% dextran sulfate sodium water for 7 d. The HQD group was given Huangqin Decoction （9.1 mg/kg）， NC group and the DSS group were given the same volume of distilled water for 7 d. During the period， the general condition of the mice was observed and their disease activity index （DAI） was evaluated. After the mice were sacrificed， the middle colon was taken to evaluate the pathological changes of the mice， and the content of the cecum was taken for 16S rDNA high-throughput sequencing. Results Compared with the NC group， the DAI score of the mice in DSS group was significantly increased， the colonic mucosal structure was damaged， and the diversity of intestinal flora was decreased， the relative abundances of Proteobacteria， Bacteroides， Escherichia-Shigella， Parabacteroides， and Ruminococcus torques were significantly increased， and the relative abundances of Firmicutes， Blautia， and Lachnospiraceae NK4A136 group were significantly decreased. The treatment of Huangqin Decoction can significantly reduce the disease activity of mice after modeling， repair the pathological damage of its colon and reverse the disturbance of intestinal flora. Conclusion Huangqin Decoction may play a therapeutic role by increasing the diversity of the flora and regulating the abundance of the flora in mice with damp-heat syndrome of ulcerative colitis， and improving the integrity of the intestinal mucosa to exert the function of biological barrier.7E0DD87B-56B0-4708-AA1B-C0DF1EB86194

〔Keywords〕 ulcerative colitis; damp-heat syndrome; Huangqin Decoction; intestinal flora; flora diversity; relative abundance of flora

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis， UC）是慢性非特異性的腸道炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉伴黏液膿血便、里急后重等，且伴有其他非特異性全身癥狀。該病發(fā)病機(jī)制尚不明確，但越來越多的證據(jù)表明，腸道微生態(tài)失調(diào)可能會觸發(fā)人體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致UC高炎癥反應(yīng)的發(fā)生[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，在UC活動期，濕熱證患者較為常見[2]。黃芩湯（Huang Qin Decoction， HQD）是《傷寒論》治療濕熱型下痢的良方，目前臨床上多用來治療UC濕熱證型[3]。本研究擬從病證結(jié)合的角度建立UC濕熱證小鼠模型，通過檢測腸道菌群，探討HQD治療UC濕熱證可能存在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 ?實(shí)驗(yàn)動物及高脂高糖飼料 ?C57BL/6雄性小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK（京）2019-0008，SPF級，6～8周，體質(zhì)量（22±2） g。室溫20～24 ℃，濕度為65%～70%，自由進(jìn)食飲水。高脂高糖飼料購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心，主要包含20%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉、10%酪蛋白、0.6%磷酸氫鈣、0.4%石粉、0.4%預(yù)混料、52.2%基礎(chǔ)飼料，總能量4.4 kcal/g。

1.1.2 ?藥品及試劑 ?葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium， DSS）購自MP Biomedicals公司，貨號：160110，使用前用蒸餾水配制成2.5%濃度。HQD顆粒，購自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，按照黃芩湯臨床用量（黃芩9 g、白芍6 g、甘草6 g、大棗12枚，1枚大棗重約4 g）的比例，用蒸餾水配制。按照小鼠與人體表面積折算等效劑量，小鼠的用藥劑量為9.1 g/kg。

無水乙醇（貨號：100092683）、二甲苯（貨號：10023418）、中性樹膠（貨號：10004160）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;HE染液套裝（Servicebio，貨號：G1003）。

1.1.3 ?主要儀器 ?MGC-300H型人工氣候培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;nova-seq6000型測序儀（美國Illumina公司）;Donatello型脫水機(jī)（DIAPATH）;JB-P5型包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）;RM2016型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）;JB-L5型凍臺（武漢俊杰電子有限公司）;KD-P型組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）;Giotto型染色機(jī)（DIAPATH）、Nikon Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡、NIKON DS-U3型成像系統(tǒng)均購自日本尼康公司。

1.2 ?研究方法

1.2.1 ?造模與給藥方法 ?SPF級C57BL/6雄性小鼠，隨機(jī)分為空白對照（NC）組、模型（DSS）組、黃芩湯（HQD）組，每組7只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，NC組以普通飼料喂養(yǎng)，自由飲用純凈水。參照預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)方法采用多因素法（飲食加環(huán)境配合灌服DSS水）建立UC濕熱證小鼠模型[4]。（1）濕熱證造模：每日給予小鼠足量高脂高糖飼料;同時(shí)，暴露在溫度32 ℃、濕度90%的環(huán)境下，每天持續(xù)16 h，共造模15 d。（2）UC造模：給予小鼠2.5%DSS水（隔1天更換新鮮DSS水）自由飲用7 d。更換蒸餾水和正常飼料喂養(yǎng)，休息1 d后用藥：NC組、DSS組予以同體積蒸餾水灌胃作對照，HQD組予以黃芩湯（9.1 g/kg）灌胃，每天1次，連續(xù)灌服7 d。

1.2.2 ?一般情況觀察 ?造模前后，觀察小鼠體質(zhì)量、飲食和飲水量、毛發(fā)光澤度、精神狀態(tài)、活動度、大便性狀等。

1.2.3 ?疾病活動指數(shù)（disease activity index， DAI）

分別于灌胃前第1天、灌胃后第4天和第7天時(shí)觀察小鼠大便、體質(zhì)量、活動等，進(jìn)行DAI評分。DAI=（體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）。體質(zhì)量下降包括5級（0分：體質(zhì)量沒有下降或上升;1分：1%<下降≤5%;2分：5%<下降≤10%;3分：10%<下降≤20%;4分：下降>20%）;大便性狀包括3級（0分：正常;1分：稀便;2分：腹瀉）;便血包括3級（0分：陰性;2分：潛血陽性;4分：嚴(yán)重出血）。

1.2.4 ?組織病理學(xué) ?于冰上剪取中段結(jié)腸約0.5 cm，用冰生理鹽水清洗后迅速固定于4%甲醛中;石蠟切片脫蠟至無水;蘇木素染色3～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗;85%、95%梯度乙醇脫水各5 min，伊紅染色5 min;無水乙醇、二甲苯脫水后，中性樹膠封片;顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.2.5 ?腸道菌群的檢測 ?按照16S rDNA測序要求，樣本處理過程如下：（1）每組5只小鼠，處死小鼠后，剖腹，快速取盲腸內(nèi)容物（1～2 g）置于凍存管，液氮速凍后，放入-80 ℃冰箱保存。（2）從樣本中提取基因組DNA后，用帶有序列條形碼barcode的特異引物擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)。引物序列為：341F：CCTACGGGNGGCWGCAG;806R：GGACTACHVGGGTA

TCTAAT。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，Illumina平臺PE250上機(jī)測序。測序后得到原始序列數(shù)據(jù)raw Reads，使用Usearch軟件對其進(jìn)行整理，獲得分類操作單元（operational taxonomic units， OTUs）豐度和OTU代表序列。7E0DD87B-56B0-4708-AA1B-C0DF1EB86194

基于OTU序列和豐度數(shù)據(jù)，開展腸道菌群多樣性分析和物種組成分析。前者主要包括α多樣性分析和β多樣性分析。從Chao、Shannon和Simpson 3個(gè)指數(shù)進(jìn)行α多樣性分析。Chao代表預(yù)測樣品中所含有的OTU個(gè)數(shù)，提示樣本的物種豐富程度。Shannon和Simpson綜合體現(xiàn)樣本中物種的豐富度和均勻度，Shannon和Simpson值越大，代表樣本中的物種分布越均勻，多樣性越高。從主坐標(biāo)分析（principal co-ordinate analysis， PCoA）、非度量多維尺度分析（non-metric multi-dimensional scaling， NMDS）和主成分分析（principal component analysis，PCA）開展β多樣性分析。PCoA主要評估各坐標(biāo)軸對菌群結(jié)構(gòu)總體差異的解釋度，菌群結(jié)構(gòu)相似度較高的樣本會聚集在一起。NMDS使用stress值評估實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，stress值越小，表示模型越可靠。PCA基于OTU列表的物種豐度信息進(jìn)行展開，提示樣品組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近，而且不同環(huán)境間的樣品往往可能表現(xiàn)出各自聚集的分布情況。物種組成分析主要進(jìn)行門、屬水平的檢測，通過相對豐度對不同組別的小鼠腸道菌群的種類變化進(jìn)行評價(jià)。整個(gè)測序及數(shù)據(jù)分析過程均由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.3 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用單因素方差分析（Dunnett），否則用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 ?一般情況觀察

NC組小鼠精神狀態(tài)良好、飲食佳、毛色光亮、活動敏捷、小便清長、大便成形。DSS組小鼠濕熱證造模時(shí)，反應(yīng)稍遲鈍、倦怠嗜睡、飲食量變化較小、毛發(fā)疏松無光澤、陰囊明顯松弛下垂、小便黃、大便稍黏膩;UC造模時(shí)，DSS組小鼠喜扎堆蜷縮，行動遲緩，活動量明顯減少，飲食飲水量明顯減少，毛發(fā)疏松無光澤，小便黃，大便逐漸稀爛并伴有日漸加重的膿液及潛血。HQD組小鼠用藥后，行動日漸靈活，飲食、飲水量逐漸增加，毛發(fā)恢復(fù)光澤，大便潛血消失并日漸成形。

2.2 ?各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)DAI評分比較

在造模結(jié)束未開始灌胃前1天，與NC組比較，DSS組和HQD組DAI評分明顯增高（P<0.01）;與DSS組比較，HQD組DAI評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在灌胃第4天，DSS組DAI評分較NC組明顯增高（P<0.01）;HQD組DAI評分較DSS組明顯降低（P<0.01）。在灌胃第7天，DSS組DAI評分較NC組明顯增高（P<0.01）;HQD組DAI評分較DSS組明顯降低（P<0.01）。詳見表1。

2.3 ?各組小鼠結(jié)腸組織病理變化

與NC組比較，DSS組小鼠結(jié)腸黏膜損傷明顯，腺體減少或消失，大量炎性細(xì)胞浸潤，甚至出現(xiàn)異型增生。與DSS組比較，HQD組結(jié)腸黏膜隱窩結(jié)構(gòu)明顯，可見大量杯狀細(xì)胞，結(jié)腸黏膜損傷較輕，黏膜下層少量炎性細(xì)胞浸潤。詳見圖1。

2.4 ?各組小鼠腸道菌群的變化

2.4.1 ?多樣性分析 ?α多樣性分析：與NC組比較（表2），DSS組Shannon和Simpson指數(shù)均顯著降低（P<0.01）;Chao指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有下降趨勢，提示UC濕熱證小鼠腸道菌群豐富度和均勻度降低。與DSS組比較，HQD組Chao指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有上升趨勢;Shannon和Simpson指數(shù)均顯著提高（P<0.01），提示經(jīng)HQD治療后，UC濕熱證小鼠腸道菌群的多樣性顯著升高。

β多樣性分析：PCoA圖中，PCo1+PCo2（圖2a）的百分比達(dá)到68.97%，超過50%，提示分組關(guān)系較好。NMDS分析圖中，stress值為0.02（圖2b），提示模型可靠度較高。PCA分析圖中，NC組、DSS組和HQD組分布于不同的區(qū)域（圖2c），說明各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，DSS組小鼠在造模環(huán)境影響下，腸道菌群出現(xiàn)異常;經(jīng)HQD干預(yù)后，HQD組小鼠腸道菌群更趨向于NC組小鼠腸道菌群。

2.4.2 ?物種組成分析 ?在門水平（表3），與NC組比較，DSS組變形菌門（Proteobacteria）相對豐度顯著升高（P<0.01），厚壁菌門（Firmicutes）顯著降低（P<0.01）。與DSS組比較，HQD組Firmicutes相對豐度顯著升高（P<0.01），擬桿菌門（Bacteroidetes）、Proteobacteria顯著降低（P<0.01）。在屬水平（見表4），與NC組比較，DSS組擬桿菌屬（Bacteroides）（P<0.01）、大腸埃希氏菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）（P<0.01）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）（P<0.01）、瘤胃球菌屬（Rumino?

coccus torques）（P<0.01）相對豐度顯著提高，布勞特氏菌屬（Blautia）（P<0.05）、毛螺菌屬（Lachnospiraceae NK4A136 group）（P<0.01）顯著下降。與DSS組比較，HQD組能顯著提升Blautia（P<0.01）的相對豐度，顯著降低Bacteroides（P<0.01）、Ruminococcus torques（P<0.05）、Escherichia-Shigella（P<0.05）的相對豐度。7E0DD87B-56B0-4708-AA1B-C0DF1EB86194

3 討論

UC屬于中醫(yī)學(xué)“腸澼”“休息痢”等范疇。稟賦虛弱、飲食不節(jié)、外感濕熱等原因綜合作用，造成脾失健運(yùn)，濕熱壅滯腸間，與氣血相搏，氣滯血瘀，導(dǎo)致UC濕熱證發(fā)生[5]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，具有遺傳易感背景的個(gè)體，在受到環(huán)境因素（飲食、氣候、感染等）的影響下，腸道菌群結(jié)構(gòu)異常，腸黏膜屏障功能失調(diào)，免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，釋放大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，最終導(dǎo)致腸黏膜急慢性炎癥和組織損傷[6]。同時(shí)，DSS模型是UC造模中最常用的方法，且該急性結(jié)腸炎模型與人類UC發(fā)病相似，是研究UC發(fā)病機(jī)制和評價(jià)藥物療效較為理想的模型[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)基于中醫(yī)學(xué)病因和西醫(yī)病理復(fù)合因素，采用高脂高糖飲食加人工氣候箱模擬體內(nèi)外濕熱環(huán)境，復(fù)合DSS誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎，進(jìn)行C57BL/6小鼠UC濕熱證造模。針對濕熱證評價(jià)，本研究主要從小鼠一般行為狀態(tài)結(jié)合DAI指數(shù)等進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)DSS組小鼠懶動、精神變差、反應(yīng)遲緩、進(jìn)食飲水量減少、體質(zhì)量減輕、尿黃、尿少、稀便甚至水樣便等。從DAI指數(shù)和結(jié)腸病理學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行評估UC，病理可見腸黏膜充血、水腫，腸黏膜大量炎癥細(xì)胞浸潤，腺體減少或消失。綜上表明，UC濕熱證小鼠模型造模成功。

正常情況下，人體胃腸道大約有100萬億菌群居住，大部分是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）[8]。健康的腸道菌群處于平衡狀態(tài)，高脂高糖飲食和濕熱環(huán)境都會誘發(fā)小鼠腸道菌群異常。連續(xù)7 d攝入10%葡萄糖的小鼠，腸道乳酸桿菌（Lactobacillaceae）相對豐度降低，阿克曼氏菌（Akkermansiaceae）相對豐度升高，再使用DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎時(shí)，比正常飲食的小鼠更容易出現(xiàn)腹瀉、直腸出血[9]，因?yàn)锳kkermansiaceae釋放的酶降解腸道黏液，損傷黏液屏障，使腸道滲透性增加;高脂飲食組小鼠腸道菌群以Lachnospiraceae和Muribaculaceae為主[10];長時(shí)間濕熱環(huán)境會破壞小鼠腸道生態(tài)平衡，Bacteroides、Parabacteroides、Mucispirillum相對豐度降低[11]。本研究發(fā)現(xiàn)：（1）UC濕熱證小鼠腸道菌群多樣性降低，物種豐富度和均勻度明顯下降，提示腸道抵御環(huán)境變化的能力減弱。經(jīng)黃芩湯治療后，腸道菌群多樣性提升，且結(jié)構(gòu)與NC組較為相似。（2）UC濕熱證小鼠腸道菌群組成改變。在門水平，主要體現(xiàn)在Proteobacteria相對豐度顯著升高，F(xiàn)irmicutes顯著降低，這與UC濕熱證患者腸道菌群異常的趨勢相同[12];在屬水平，UC濕熱證小鼠Bacteroides、大腸埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、Parabacteroides、Ruminococcus torques相對豐度顯著提高，Blautia、Lachnospiraceae NK4A136 group顯著下降;且黃芩湯能夠顯著糾正逆轉(zhuǎn)以上趨勢。

JIA、LUCKE等[13-14]研究認(rèn)為，DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎Balb/c小鼠擬桿菌科（Bacteroidaceae）豐度明顯提升且與結(jié)腸炎癥狀呈現(xiàn)正相關(guān)，UC患者的炎癥或非炎癥腸黏膜活檢都顯示擬桿菌門（Bacteroidetes）富集[14]，提示炎癥性腸病的發(fā)生可能與擬桿菌屬（Bacteroides）密切相關(guān)。腸道患者大腸埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）豐度提高[15]，主要通過把細(xì)菌毒性蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞質(zhì)來破壞腸道上皮細(xì)胞和引起免疫細(xì)胞功能失調(diào)，促使炎癥性疾病發(fā)生[16]?？乱环萚17]研究認(rèn)為副擬桿菌屬（Parabacteroides）的富集與UC濕熱證發(fā)病相關(guān)性較強(qiáng)，推測脾虛濕熱證組的UC患者腸型屬于副擬桿菌型。Ruminococcus torques通過降低腸道屏障完整性引起炎癥性腸病的發(fā)生，與炎癥因子分泌量呈正相關(guān)[18]。布勞特菌屬（Blautia）、毛螺菌屬（Lachnospiraceae NK4A136 group）都屬于厚壁菌門毛螺菌科，上調(diào)腸道調(diào)控T細(xì)胞核產(chǎn)生短鏈脂肪酸。短鏈脂肪酸是細(xì)菌發(fā)酵的主要終產(chǎn)物，為結(jié)腸上皮細(xì)胞的生成提供主要原料，維持腸道黏膜的完整性，避免炎癥發(fā)生[19-20]。因此推斷，黃芩湯可能通過減少破壞腸道黏膜完整性的菌屬、增加保護(hù)腸道黏膜完整性的菌屬來治療UC濕熱證。

綜上所述，本研究從病證結(jié)合角度采用多因素復(fù)合法建立UC濕熱證小鼠模型，并檢測其腸道菌群變化，推測黃芩湯可能通過糾正UC濕熱證小鼠腸道菌群的異常，提升腸黏膜的完整性以發(fā)揮生物屏障功能，從而減輕腸道炎癥。黃芩湯影響UC濕熱證小鼠腸道異常菌群的具體機(jī)制，有待進(jìn)一步探索驗(yàn)證。

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