李靜玲，柯坤彬，王振丞，秦德強，李 顥

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，云南 昆明 650032）

高鈣尿及低枸櫞酸尿是含鈣腎結(jié)石的最重要因素[1]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)CASR（鈣敏受體）和VDR（維生素D 受體）基因多態(tài)性與含鈣腎結(jié)石的形成相關(guān)[2-3]。另外有研究發(fā)現(xiàn)PTH 可與G 蛋白偶聯(lián)受體PTH1R（重組人甲狀旁腺激素1 受體）結(jié)合，通過P38α-MAPK 信號通路調(diào)節(jié)VDR 的水平[4]。但是既往研究CASR、VDR 和PTH1R 主要參與腫瘤等代謝性疾病之中[5-6]，在尿石癥中的研究主要集中在體外細胞實驗及動物模型[7-8]。我們此次課題通過對腎結(jié)石患者（實驗組）及腫瘤患者（對照組）正常腎髓質(zhì)進行qPCR、WB 實驗及免疫熒光實驗，發(fā)現(xiàn)了CASR、VDR、PTH1R 基因在人體腎髓質(zhì)中表達，且實驗組CASR、VDR蛋白的表達水平顯著高于對照組，實驗組PTH1R蛋白的表達水平低于對照組。于是我們首次提出了CASR 和VDR 基因可能通過PTH1R 信號通路參與了人體內(nèi)含鈣腎結(jié)石的發(fā)生機制。

1 資料與方法

1.1 實驗樣本

選取2020 年9 月至2021 年10 月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院13 例單側(cè)腎癌在手術(shù)時獲得了新鮮的正常腎髓質(zhì)10 mg 為對照組，15 例結(jié)石導(dǎo)致積水腎行單側(cè)腎切除術(shù)時獲得新鮮腎髓質(zhì)10 mg 為實驗組。這些患者除外結(jié)核、近期服用糖皮質(zhì)激素或雄激素及甲狀旁腺功能亢進等代謝性疾病患者，該研究符合赫爾辛基宣言的標準，所有研究對象均為自愿參加本次研究，并簽署知情同意書，本研究承諾對研究對象的個人信息嚴格保密。筆者收集了患者的臨床資料，包括：年齡、性別、腫瘤大小，結(jié)石大小及位置、結(jié)石成分分析結(jié)果（其中13 例為草酸鈣腎結(jié)石，1 例為磷酸鈣結(jié)石，1 例為碳酸磷灰石），影像學(xué)CT、B 超、ECT 等資料、診斷時的腎功能、Ca2+水平。

1.2 實驗方法

1.2.1 實時熒光定量Q-PCR應(yīng)用微量RNA 提取試劑盒（天根）提取實驗組和對照組病人腎髓質(zhì)的總RNA，使用分光光度法測定提取的RNA 的量和純度，通過每個樣品中使用2 μg RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR qPCR Master Mix（Q712-02）測定CASR、VDR 的mRNA 表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡（western-blot）取積水腎腎髓質(zhì)組織為實驗組，腎腫瘤周邊正常腎髓質(zhì)組織樣本為對照組，分別把組織剪成細小的碎片，持續(xù)液氮充分研磨組織至粉末狀，按照每20 mg組織加入200 μL 高效RIPA 組織裂解液（Solarbio，4 ℃保存），按每1 mL RIPA 加入10 μL PMSF（-20 ℃保存），冰上裂解30 min，裂解后樣品離心3 min（12 000 g），取上清，加4×上樣緩沖液，煮沸10 min，待冷卻后上樣。配制10%的SDSPAGE 膠，按照maker、對照組、實驗組進行上樣，每孔上樣15 μL 蛋白，5 U maker，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，SDS-PAGE 加入相應(yīng)的一抗鼠抗CaSR 抗體（Santacruz，1∶1 000）、一抗鼠抗；VDR（Proteintech，1∶5 000）、一抗兔抗；PTH1R（Santa SC-12722，1∶1 000）、一抗兔抗，均以GAPDH 作內(nèi)參（abmart P30008M，1∶2 000）。均用TBST 洗滌3 次，每次10 min。加入相應(yīng)二抗（CST 7074，CST 7076，1∶2 000），37℃孵育2 h，用TBST 洗膜3 次，每次10 min，用ECL 發(fā)光法檢測目的條帶的表達，用imagej win 64 軟件分析內(nèi)參，調(diào)整內(nèi)參一致。抗體序列見表2。

表2 抗體序列表Tab.2 Antibody sequence

1.2.3 免疫熒光免疫熒光從外科手術(shù)獲得的福爾馬林固定的石蠟包埋的組織樣品用于免疫熒光。將5 μm 厚的切片安裝在涂有聚賴氨酸包被的載玻片上，用二甲苯脫蠟，并通過梯度乙醇溶液再水化成蒸餾水。PBS 漂洗，抗原修復(fù)，將切片浸入pH=6.0 的檸檬酸鹽緩沖液中，微波加熱至沸騰，中檔微波處理10 min，自然泠卻。5%羊血清封閉，室溫60 min。加合適濃度的一抗（CASR、VDR、PTH1R），4 ℃冰箱過夜。PBST 漂洗，加二抗山羊抗小鼠IgG H&L（Cy3 ?）于組織上進行標記，避光，37 ℃，1 h。PBST 漂洗，吸去多余的水分，每個組織上滴加50 μL 左右的抗淬滅封片劑（含DAPI）封片，使用丹吉爾全息掃描顯微鏡下觀察，掃描。使用Case Viewer 軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用IBM SPSS Statistics 25 進行軟件分析，CASR、VDR、PTH1R 的mRNA 的相對水平表示為平均標準偏差，通過非參數(shù)檢驗檢測積水腎與腎腫瘤臨近正常腎髓質(zhì)間CASR、VDR 和PTH1R表達水平的差異性。為了評估CASR、VDR、PTH1R 表達及臨床病理變量之間的關(guān)系，實驗結(jié)果分為兩組，上調(diào)和下調(diào)。當積水腎腎髓質(zhì)組織中CASR mRNA 水平高于腎腫瘤臨近正常腎髓質(zhì)組織時，可認為CASR mRNA 表達在積水腎中上調(diào)，否認可認為下調(diào)。臨床病理特征和CaSR、VDR、PTH1R 等基因表達之間的聯(lián)系用非參數(shù)檢驗進行分析，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 積水腎腎髓質(zhì)組織中及腎腫瘤正常腎髓質(zhì)組織

積水腎腎髓質(zhì)組織中及腎腫瘤正常腎髓質(zhì)組織中的CASR、VDR、PTH1R 等mRNA 表達，筆者使用了q-PCR 每個樣本，繪制出qPCR 箱線。

CASR、VDR、PTH1R 等在腎髓質(zhì)中表達的QPCR 差異性箱線圖見圖1。研究人群分為2 組，腎腫瘤患者為對照組，腎結(jié)石患者為實驗組。q-PCR 結(jié)果提示CASR、PTH1R 基因 mRNA 在積水腎髓質(zhì)及腎腫瘤正常髓質(zhì)表達水平的差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。VDR 的mRNA 在積水腎髓質(zhì)及腎腫瘤正常髓質(zhì)表達水平的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖1。

圖1 CASR、VDR、PTH1R 的q-PCR 箱線圖Fig.1 Q-PCR box plot of CASR，VDR，PTH1R

2.2 腎實體髓質(zhì)組織中的CASR、VDR、和PTH1R 基因

筆者對每一個腎實體髓質(zhì)組織中的CASR、VDR、和PTH1R 基因均進行了WB，其中CASR、VDR、PTH1R 均出現(xiàn)了目的蛋白條帶的表達，見圖2。

CASR、VDR、PTH1R 基因在積水腎髓質(zhì)及腎腫瘤正常髓質(zhì)蛋白質(zhì)差異性表達的WB（Western Blot）。其中1，3，5=對照組（腎腫瘤正常腎髓質(zhì)樣本），2，4，6=實驗組（積水腎腎髓質(zhì)組織樣本），GAPDH 為內(nèi)參?？梢妼嶒灲M腎結(jié)石患者的CASR、VDR 基因的表達較對照組腎腫瘤患者上調(diào)，而PTH1R 基因表達下調(diào)，見圖2。

圖2 CASR、VDR、PTH1R 的蛋白質(zhì)免疫印跡圖Fig.2 Western blot of CASR，VDR，and PTH1R

2.3 CASR、VDR 和PTH1R 基因在腫瘤正常腎實體組織和積水腎實體組織中的表達

筆者的實驗對CASR、VDR 和PTH1R 基因在腫瘤正常腎實體組織和積水腎實體組織中的表達做了免疫熒光標記，筆者的免疫熒光結(jié)果證實了CASR、VDR 和PTH1R 在腎實體髓質(zhì)組織中均有表達，見圖3。

CASR 基因表達的免疫熒光圖3 顯示，其中DAPI 核染為藍色，紅色為蛋白的陽性表達。可見CASR 基因在腎組織的髓質(zhì)和皮質(zhì)部的腎小管上皮細胞中均有表達，主要定位于腎小管上皮細胞胞質(zhì)中。其中CARS 蛋白腎腫瘤患者髓質(zhì)部和皮質(zhì)部的表達差異不明顯，而在積水腎組中髓質(zhì)部的表達強度及表達量較皮質(zhì)部的高，見圖3。

圖3 CASR 免疫熒光圖（×400）Fig.3 Immunofluorescence images of CASR（×400）

VDR 基因表達的免疫熒光見圖4，其中DAPI 核染為藍色，紅色為蛋白的陽性表達。VDR 主要定位于足細胞及腎近端小管，在腎腫瘤及腎積水患者皮質(zhì)及髓質(zhì)均有表達，且腎積水患者皮質(zhì)髓質(zhì)表達均高于腎腫瘤患者，見圖4。

圖4 VDR 免疫熒光圖（×400）Fig.4 Immunofluorescence images of VDR（×400）

PTH1R 基因表達的免疫熒光圖5 顯示其中DAPI 核染為藍色，紅色為蛋白的陽性表達。PTH1R 主要位于腫瘤患者的遠端小管，積水腎患者的近端小管，其中髓質(zhì)表達高于皮質(zhì)，且在髓質(zhì)組織中呈現(xiàn)出逐漸遞增的趨勢，在皮質(zhì)組織中呈現(xiàn)出逐漸遞減的趨勢。在腫瘤腎組織中皮質(zhì)與髓質(zhì)均為高表達，而在積水腎中可見髓質(zhì)與皮質(zhì)均為低表達，見圖5。

圖5 PTH1R 免疫熒光圖（×400）Fig.5 Immunofluorescence images of PTH1R（×400）

3 討論

在本研究中，筆者首次證實了CASR、VDR、PTH1R 基因在腎結(jié)石患者及腎腫瘤正常腎髓質(zhì)組織的mRNA 及蛋白質(zhì)表達水平。此外，通過WB（Western Blot）實驗筆者證實了CASR、VDR 腎結(jié)石患者CASR、VDR 上調(diào)，PTH1R 下調(diào)，并通過免疫熒光標記進行了進一步驗證。

CASR 基因是參與體內(nèi)高鈣尿代謝、VDR 基因是參與體內(nèi)枸櫞酸鹽代謝的關(guān)鍵基因。CASR被證實能夠通過絡(luò)合鈣抑制腎近端小管中二羧酸鹽和檸檬酸鹽的轉(zhuǎn)運，從而降低含鈣腎結(jié)石的發(fā)生發(fā)展過程，而尿液中羧酸鹽和檸檬酸鹽的增加會增加尿草酸鈣的飽和度從而形成草酸鈣結(jié)石[3]。VDR 影響NaDC1 的轉(zhuǎn)運活性，導(dǎo)致腎近曲小管對枸櫞酸的重吸收增加，進而導(dǎo)致高鈣尿的發(fā)生[4]。CASR 和VDR 相關(guān)信號可以被不同的刺激因素激活或抑制，形成各自相關(guān)的信號通路，激活或抑制不同的轉(zhuǎn)錄因子、底物蛋白，介導(dǎo)不同的生物學(xué)功能效應(yīng)。血清鈣能刺激CASR 增加claudin-14 蛋白的表達，進而抑制claudin-16/claudin-19 結(jié)合形成的鈣通道，從而減少細胞旁路中鈣的重吸收[4]。PTH（甲狀旁腺激素）和低磷血癥能刺激VD 的活性形式1，25-二羥維生素D3 的生成，1，25-二羥維生素D3 通過血流入腸道內(nèi)與VDR（維生素D 受體）結(jié)合，增加鈣的吸收[9]。當體內(nèi)血清鈣上升時，CASR 被激活，增加PTH 分泌，后者又反過來作用于1，25-二羥維生素D3，導(dǎo)致鈣磷的濾過負荷增加。而PTH增加鈣的重吸收，磷的排泄，使血清鈣升高，而后者又可抑制PTH 和1，25-二羥維生素D3 的合成[10]。

CASR、VDR 的mRNA 在腎結(jié)石積水患者中較腎腫瘤患者中趨于上調(diào)，相反，PTH1R 的mRNA 的表達趨于下調(diào)，我們使用WB 與免疫熒光亦證實了CASR、VDR 的上調(diào)及PTH1R 的下調(diào)。這與既往國內(nèi)外研究基本一致。

CASR 可與配體鈣結(jié)合后一方面可通過Gαi/o 的G 蛋白信賴性途徑直接激活MAPK 和下調(diào)cAMP；另一方面可通過Gaq/11 途徑，調(diào)控IP3 和DAG 釋放信號，DAG 激活PKC 和Ras 后刺激P38-MAPK[17]。FGF23（成纖維細胞生長因子）通過磷酸化作用會抑制1α，25-dihydroxyvitamin-D 的合成，減少腸道對磷酸鹽的吸收，進而減少體內(nèi)磷酸鈉鹽的水平，從而調(diào)節(jié)VDR 和磷酸鹽[18]。FGF-23 可以抑制MAPK/ ERK1/2 通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并加速PTH（甲狀旁腺激素）的分泌[19]。

既往研究已經(jīng)證明了腎中CASR、VDR、PTH1R 等基因的表達，然而這些研究集中在CASR、VDR 與胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌等腫瘤代謝性疾病相關(guān)聯(lián)[5,11-14]。另一方面?zhèn)戎赜谘芯緾ASR 依賴性抑制性支配的PTH 敏感性經(jīng)細胞轉(zhuǎn)運途徑及細胞旁途徑關(guān)聯(lián)的鈣離子重吸收及分泌[15-16]。已有研究證實 CASR、VDR 和PTH1R 在腎臟中定位表達，CASR 主要表達在近端小管刷狀緣的頂端膜上[22]，VDR 主要定位于足細胞及腎近端小管[23]。PTH1R 定位于腎小管S1 節(jié)段管腔表達[24]。然而它們使用的是HK-2 細胞以及大鼠等的腎組織，而不是人類組織，因此，筆者獲得的關(guān)于人類的CASR、VDR、PTH1R 在腎中表達的數(shù)據(jù)是有限的。而在本課題研究中，q-PCR 中筆者的實驗結(jié)果僅證實了VDR 的表達在實驗組及對照組中的表達具有統(tǒng)計學(xué)差異，而CASR、PTH1R 基因的表達的差異性無統(tǒng)計學(xué)意義，這與我們的WB 跟免疫熒光實驗結(jié)果稍有不同，我們的免疫熒光實驗證實了CASR、VDR 在上述部位的表達，稍有不同的是筆者還證實了PTH1R 不僅表達在近端小管，亦表達在遠端小管。筆者的WB 跟免疫熒光均證實了CASR、VDR 等在腎結(jié)石患者中高表達，而PTH1R 低表達，q-PCR 出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)無差異性的結(jié)果一方面可能與基因的轉(zhuǎn)錄后修飾及翻譯有關(guān)[20-21]，亦也可能由于我們的樣本量較少，我們未來將在此方面作更深一步的探索性研究。

CaSR、VDR、PTH1R 在含鈣腎結(jié)石進展過程中的確切功能機制尚不清楚。需要進一步的研究來揭示CaSR、VDR 表達參與含鈣腎結(jié)石的機制。我們的實驗研究有一定的局限性，在分析結(jié)果時應(yīng)該綜合權(quán)衡考慮。一方面由于樣本數(shù)量相對較少，推斷結(jié)果時可能有一定的統(tǒng)計學(xué)差異。另一方面，結(jié)石導(dǎo)致積水腎性腎切除的患者，臨床上腎實質(zhì)較薄，皮質(zhì)髓質(zhì)界限難以分清，而選取腎腫瘤患者的正常腎髓質(zhì)為對照組而沒有選擇正常患者的腎髓質(zhì)，可能會對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，主要是考慮到選取健康人的正常腎髓質(zhì)有違倫理，所以可能存在實驗上的不足。而且我們沒有采取相關(guān)動物實驗來確定CaSR、VDR、PTH1R 等基因在腎結(jié)石中的形成的機制。另外，疾病的遺傳異質(zhì)性、環(huán)境差異、激素在結(jié)石形成中的作用、種族特征、群體之間的差異性、對照組的選擇、基因與環(huán)境的作用有可能是導(dǎo)致結(jié)果的不同，筆者應(yīng)進行增加臨床樣本量、進一步的動物模型及相關(guān)實驗信號通路研究論證，以確認積水腎樣本中CaSR、VDR、PTH1R 等表達的臨床病理特征。