紫蘇油多層乳液的制備及乳液油脂體外消化特性

廖 一，孫禹凡，彭新輝，王 琪，武利春，閆世長(zhǎng)，劉冠男，朱華平，齊寶坤,*，李 楊,3,4,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000；2.科技部中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心，北京 100045；3.哈爾濱市食品產(chǎn)業(yè)研究院，黑龍江 哈爾濱 150000；4.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150000）

紫蘇是唇形科一年生草本植物，廣泛分布于中國(guó)和日本等亞洲國(guó)家，一般通過(guò)紫蘇籽冷榨的方法獲得紫蘇油。紫蘇油中含有豐富的-3系列不飽和脂肪酸，其中-亞麻酸極為豐富。研究表明，紫蘇油能夠提供人體必需脂肪酸，有降低膽固醇、調(diào)節(jié)血壓、防癌和抗衰老等諸多功效。但由于紫蘇油含有大量不飽和脂肪酸，導(dǎo)致其在貯藏過(guò)程中極易被氧化，尤其在環(huán)境變化情況下（如貯藏運(yùn)輸和添加到食品中）會(huì)加速氧化，限制其在食品中的應(yīng)用。因此，紫蘇油的包封增強(qiáng)其在食品中的穩(wěn)定性具有重要意義。

層層自組裝技術(shù)是指利用某種相互作用（如靜電引力、共價(jià)鍵、氫鍵等）將2種以上的高分子材料在模板物質(zhì)表面逐層交替沉積，形成多層界面膜的一種技術(shù)，靜電力則是自組裝中最常見的一種作用力，利用靜電層層自組裝技術(shù)制作多層乳液能對(duì)芯材有更好的保護(hù)，許多研究表明，多層乳液比傳統(tǒng)單層乳液具有更好的穩(wěn)定性。

目前關(guān)于以大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）和多糖作為乳化劑形成多層乳液的報(bào)道較多，但大部分集中于探究形成單層或多層乳液的穩(wěn)定性以及遞送活性物質(zhì)的生物可及性等研究，然而在消化過(guò)程中，以層層自組裝技術(shù)形成的單層和多層乳液對(duì)于乳液油脂的消化影響尚不明確。因此，深入了解界面層對(duì)于乳液油脂在胃腸道的消化過(guò)程有助于改善SPI在酸性條件下的功能特性，提高其在乳液遞送系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，進(jìn)一步開發(fā)特定屬性，如改善蛋白功能特性、抑制脂質(zhì)氧化和脂質(zhì)緩慢遞送的功能性產(chǎn)品。

本實(shí)驗(yàn)以SPI作為乳化劑制備單層乳液，利用層層自組裝技術(shù)使單層乳液表面分別吸附殼聚糖（chitosan，CS）、海藻酸鈉（sodium alginate，SA）制備雙層和三層乳液，通過(guò)粒徑電位、微觀形態(tài)等乳液表征方法確定乳化劑的用量，對(duì)比上述3種乳液的物理穩(wěn)定性和紫蘇油的氧化穩(wěn)定性。構(gòu)建體外消化模型，利用pH-stat全自動(dòng)滴定儀比較3種乳液對(duì)于脂質(zhì)消化速率和消化程度影響，最終以氣相色譜法測(cè)定紫蘇油乳液消化前后的脂肪酸組成的變化，以期為不飽和脂肪酸遞送體系的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI 山東仟聚元生物科技有限公司；紫蘇油河北家豐植物油有限公司；CS、SA、胃蛋白酶（≥2 500 U/mg）、胰酶（≥250 U/mg）、膽鹽 上海源葉生物科技有限公司；尼羅紅、尼羅藍(lán)、卡爾科弗盧爾熒光增白劑染液 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；Zetasizer 2000激光粒度粒形分析儀 美國(guó)麥奇克公司；JJ-1增力電動(dòng)攪拌器 江蘇金城國(guó)勝儀器廠；BX53科研級(jí)正置顯微成像系統(tǒng) 日本奧林巴斯公司；Sp2激光共聚焦顯微鏡 德國(guó)萊卡公司；TU-1800紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；905型全自動(dòng)電位滴定儀 瑞士萬(wàn)通中國(guó)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 壁材分子所帶電荷性質(zhì)測(cè)定

參考林傳舟的方法并稍作修改，稱取一定質(zhì)量的SPI和SA粉末溶解于pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，CS粉末溶解于0.1 mol/L醋酸緩沖液中，并加入0.2 g/L的疊氮化鈉抑制微生物生長(zhǎng)。將配制好的溶液用相應(yīng)溶解的緩沖液稀釋至0.01%，并用1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值（3～8），通過(guò)激光粒度儀測(cè)定不同pH值時(shí)壁材分子所帶電荷（Zeta電位）。

1.3.2 乳液的制備

1.3.2.1 紫蘇油單層乳液（SPI-E）的制備

參考Gasa-Falcon等的方法并稍作修改，在pH 7.0時(shí)，將不同SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%～2.5%）的脂質(zhì)相（紫蘇油）（體積分?jǐn)?shù)10%）和水相（體積分?jǐn)?shù)90%）以13 000 r/min運(yùn)行3 min形成粗乳液。該粗乳液在20 MPa壓力下通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行2 次循環(huán)，制得的SPI-E保存?zhèn)溆茫ńM成：10%紫蘇油，pH 7.8）。將上述SPI-E調(diào)節(jié)pH值至5.5，取5 mL樣品用pH 5.5的緩沖溶液稀釋至20 mL，將稀釋后的樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 紫蘇油雙層乳液（SPI-CS）的制備

參考Silva等的方法并稍作修改，在pH 5.5、200 r/min連續(xù)攪拌條件下，以10 mL/min的滴加速率將10 mL SPI-E添加到10 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%～2.5%）的CS溶液中。然后將形成的SPI-CS以4 000 r/min均質(zhì)2 min，以破壞形成的絮凝物，制得的SPI-CS保存?zhèn)溆茫ńM成：5%紫蘇油，pH 5.5）。取10 mL樣品用pH 5.5的緩沖溶液稀釋至20 mL，將稀釋后的樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.3 紫蘇油三層乳液（SPI-CS-SA）的制備

參考Silva等的方法并稍作修改，在pH 5.5、200 r/min連續(xù)攪拌條件下，以10 mL/min的滴加速率將10 mL SPICS添加到10 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%～2.5%）的SA溶液中。然后將形成的SPI-CS-SA利用均質(zhì)機(jī)以4 000 r/min均質(zhì)2 min，以破壞形成的絮凝物，制得的SPI-CS-SA保存?zhèn)溆茫ńM成：2.5%紫蘇油，pH 5.5）。

1.3.3 乳液粒徑及Zeta電位的測(cè)量

采用激光粒度儀測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025‰的3種不同乳液的液滴粒徑與Zeta電位，分散相和連續(xù)相的折射率分為1.456和1.330。將樣品放入樣品池中，在25 ℃條件下測(cè)定。

1.3.4 微觀結(jié)構(gòu)

1.3.4.1 光學(xué)顯微鏡觀察

采用光學(xué)顯微鏡觀察乳液液滴的大小、形狀、分布狀態(tài)：將制備好的3種乳液用pH 5.5的緩沖溶液稀釋10 倍，取10 μL稀釋后的樣品滴于載玻片上，用蓋玻片壓好靜置適當(dāng)時(shí)間，待液滴不再流動(dòng)后放大40 倍進(jìn)行觀察。

1.3.4.2 激光共聚焦顯微鏡觀察

采用激光共聚焦顯微鏡觀察乳液液滴分布情況，將制備好的3種乳液用pH 5.5的緩沖溶液稀釋10 倍，染色方法為：80 μL 1.0%尼羅藍(lán)熒光染料與1 mL樣品避光混合染色15 min后加入40 μL 0.1%尼羅紅和40 μL卡爾科弗盧爾熒光增白劑染液繼續(xù)染色15 min。將樣品放置在載玻片上并蓋上蓋玻片，對(duì)乳液進(jìn)行觀察，激發(fā)波長(zhǎng)分別為633、488 nm和355 nm。

1.3.5 穩(wěn)定性測(cè)定

1.3.5.1 乳液乳析指數(shù)測(cè)定

將制備的3種乳液在常溫下放置30 d，乳液靜置后分為2 層，乳液上層為乳析層，下層為清液層，每5 d測(cè)定2 層的厚度變化，乳析指數(shù)按式（1）計(jì)算：

式中：為乳清層的高度/cm；為玻璃管中乳液的總高度/cm。

1.3.5.2 貯藏過(guò)程中氧化產(chǎn)物的測(cè)定

氫過(guò)氧化物值測(cè)定參考Shantha等的方法并稍作修改，采用分光光度計(jì)法對(duì)紫蘇油3種乳液中氫過(guò)氧化物含量進(jìn)行測(cè)定。0.3 mL乳液與15 mL破乳劑（異辛烷-異丙醇，3∶1，/）混合，旋渦振蕩10 s，重復(fù)3 次，每次間隔20 s進(jìn)行乳液破乳，5 000 r/min離心10 min獲得油相。取200 μmol/L上層有機(jī)相于10 mL離心管中并加入2.8 mL甲醇-丁醇（2∶1，/）混合液，緊接著加入30 μL Fe和3.14 mol/L硫氰酸銨（1∶1，/）混合液，振蕩均勻，暗反應(yīng)20 min后在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，使用過(guò)氧化氫異丙苯制備標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為=0.071 6-0.010 6，=0.992，其中為吸光度，為氫過(guò)氧化物濃度。

硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive su bstances，TBARS）值測(cè)定參考Zhang Haixia等的方法并稍作修改。將1.0 mL乳液與2.0 mL硫代巴比妥酸測(cè)試液（由15.0 g三氯乙酸，0.375 g硫代巴比妥酸，1.76 mL 12 mol/L HCl和82.9 mL超純水混合而成），混合裝入試管中，渦旋。將試管放入沸水浴中加熱15 min，加熱結(jié)束后冷卻至室溫，以300 r/min離心15 min，利用紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)532 nm處測(cè)定樣品的吸光度，使用1,1,3,3-四乙氧基丙烷制備標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為=0.232 4+0.078 0，=0.995，其中為吸光度，為TBARS值。

1.3.6 體外消化模型的構(gòu)建

參考Ding Jian等的方法進(jìn)行體外模擬消化并稍作修改。模擬胃液配方為：3.2 mg/mL胃蛋白酶，0.7% HCl溶液和2 mg/mL NaCl溶液，使用1 mol/L HCl溶液將pH值調(diào)節(jié)至2.0，將乳液與模擬胃液等體積混合與37 ℃恒溫培養(yǎng)開始胃部消化，100 r/min連續(xù)振蕩1 h。隨后將配制模擬腸液：10 mmol/L CaCl、150 mmol/L NaCl、5 mg/mL膽鹽和1.6 mg/mL胰酶的混合，將腸液與胃消化物3∶1混合，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0。在30 ℃恒溫培養(yǎng)2 h，100 r/min連續(xù)振蕩期間實(shí)時(shí)監(jiān)控pH值為7.0以模擬小腸條件進(jìn)行消化。每隔10 min（共120 min）測(cè)定消化過(guò)程中釋放的游離脂肪酸含量。

體外模擬消化過(guò)程中，在脂肪酶的作用下脂肪不斷被水解為脂肪酸，測(cè)定反應(yīng)容器中維持恒定pH 7.0所需0.1 mol/L NaOH溶液體積，按式（2）計(jì)算脂肪酸含量：

式中：（NaOH）為模擬小腸消化時(shí)間為時(shí)消耗的NaOH溶液的體積/L；（NaOH）為滴定用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的濃度0.1 mol/L；為紫蘇油總質(zhì)量/g；為紫蘇油的平均摩爾質(zhì)量（391 g/mol）。

1.3.7 脂肪酸含量測(cè)定

采用氣相色譜法以紫蘇油原油作為對(duì)照組測(cè)定消化前后乳液的脂肪酸組成，參考GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測(cè)定》中脂肪的提取及脂肪酸的測(cè)定方法，分為油的甲酯化和氣相色譜法測(cè)定脂肪酸含量2個(gè)階段，使用HP-5石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差使用Origin Pro 2019b（美國(guó)Origin Lab公司）計(jì)算。統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)方差分析進(jìn)行，使用IBM SPSS 23.0（IBM公司，美國(guó)）。＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值條件下乳液壁材所帶電荷

圖1 不同pH值條件下壁材所帶電荷Fig. 1 Effect of pH on zeta potential of wall materials

蛋白質(zhì)和多糖是兩類重要的高分子材料，大豆蛋白由于自身的性能在酸性條件下穩(wěn)定性低，靜電層層自組裝技術(shù)將2種高分子材料融合形成多層乳液，增加乳滴的穩(wěn)定性。多層乳液的形成受許多因素的影響，其中pH值、壁材添加比例等是形成多層乳液的關(guān)鍵因素。

通過(guò)考察不同pH值條件下SPI、CS和SA的Zeta電位可以分析形成多層乳液產(chǎn)生聚集的原因以及蛋白質(zhì)和多糖之間的作用力，并確定多層乳液的吸附順序。如圖1所示，SPI在pH 3～6時(shí)Zeta電位迅速下降，在pH 4.4左右電荷下降至0，達(dá)到SPI的等電點(diǎn)（pI）。蛋白質(zhì)分子同時(shí)含有羧基和氨基，在pH值高于pI一側(cè)時(shí)，SPI帶有凈負(fù)電荷，在低于pI一側(cè)時(shí)，SPI帶有凈正電荷，因此可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液不同pH值改變SPI的帶電性。CS是自然界中唯一帶正電荷的多糖，圖1顯示在pH 3.0～8.0的范圍內(nèi)CS溶液正電荷數(shù)逐漸減少，在較高的酸堿度下CS失去電荷，pH值在7以上時(shí)CS溶液出現(xiàn)明顯的渾濁，歸因于CS的解離常數(shù)（p）在6.5附近。SA的p值在3.4～4.2附近，圖1顯示在pH 3.0～8.0的范圍內(nèi)SA溶液所帶電荷的絕對(duì)值逐漸增大。采用靜電層層自組裝制備多層乳液的過(guò)程中，帶正電荷或負(fù)電荷的聚電解質(zhì)交替沉積在油滴周圍，根據(jù)CS和SA在不同pH值條件下的電勢(shì)走向，為遠(yuǎn)離SPI的pI以及CS和SA的p值，使三者Zeta電位保持相對(duì)大的數(shù)值，易于實(shí)驗(yàn)操作，選擇pH 5.5作為多層乳液形成的環(huán)境條件，多層乳液乳化劑添加順序?yàn)镾PI、CS、SA。

2.2 聚電解質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定

2.2.1 SPI-E粒徑電位分析

圖2 不同SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)形成的SPI-E平均粒徑電位Fig. 2 Effect of SPI concentration on average particle size of SPI-E

為得到穩(wěn)定的多層乳液，必須保證SPI-E中的蛋白質(zhì)分子能夠使液滴表面完全達(dá)到飽和，添加量過(guò)多或過(guò)少都會(huì)使乳液失穩(wěn)。如圖2所示，SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%～2.5%范圍內(nèi)粒徑低于400 nm，當(dāng)SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%時(shí)，乳液的粒徑最?。?96.33 nm）且Zeta電位絕對(duì)值最高（-25.63 mV），當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)已經(jīng)有足夠的蛋白覆蓋在油滴周圍，空間作用力和靜電力可以穩(wěn)定油滴。當(dāng)SPI-E中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，液滴表面吸附的蛋白飽和，多余的蛋白分子在水相中產(chǎn)生吸引作用，使得乳液的粒徑顯著增大，電位絕對(duì)值顯著降低（＜0.05）。綜合考慮SPI-E粒徑和Zeta電位結(jié)果，選擇SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%進(jìn)行后續(xù)SPI-CS的制備。

2.2.2 SPI-CS粒徑電位分析

圖3 不同CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)形成的SPI-CS平均粒徑電位Fig. 3 Effect of CS concentration on average particle size and zeta potential of SPI-CS

如圖3所示，SPI-CS的粒徑電位為pH 5.5時(shí)測(cè)量，高于且接近SPI的pI，因此在未添加CS的情況下乳液體系呈現(xiàn)負(fù)電荷（-15.21 mV），液滴之間的吸引力較強(qiáng)排斥力較弱，相互吸引導(dǎo)致液滴聚集。對(duì)比圖5A可以看出，當(dāng)CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0%時(shí)乳液已經(jīng)出現(xiàn)明顯分層，證實(shí)了上述觀點(diǎn)，此時(shí)乳液粒徑較大，接近14 μm。當(dāng)添加少量的CS時(shí)，由于CS不足以覆蓋SPI-E液滴，2個(gè)或者多個(gè)帶負(fù)電的液滴共享1個(gè)CS分子，此時(shí)乳液帶電量較低（-5.18 mV），發(fā)生靜電中和效應(yīng)，形成橋連結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生聚集，但由于CS的加入增加乳液體系的黏度，促進(jìn)空間穩(wěn)定性，乳液粒徑由13.77 μm降至5.80 μm。當(dāng)CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%時(shí)，乳液中液滴的表面所帶電荷從負(fù)電荷變?yōu)檎姾?，此時(shí)陽(yáng)離子CS分子吸附在陰離子SPI-E的表面上，使CS中和原有的負(fù)電荷在表面達(dá)到飽和。當(dāng)CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加達(dá)到2.0%時(shí)，Zeta電位增大，體系重新穩(wěn)定，乳液液滴的平均粒徑下降至最低（2.10 μm），SPI-CS液滴上的正電荷隨著CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，最終液滴表面CS分子完全飽和，表面電勢(shì)達(dá)到恒定的正值。當(dāng)CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加至2.5%，水中存在無(wú)法吸附在液滴表面的CS分子導(dǎo)致?lián)p耗絮凝，乳液的穩(wěn)定性下降，因此最終選擇CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%的溶液添加至SPI-E制備SPI-CS。

2.2.3 SPI-CS-SA粒徑電位分析

圖4 不同SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)形成的SPI-CS-SA平均粒徑電位Fig. 4 Effect of SA concentration on average particle size and zeta potential of SPI-CS-SA

圖5 3種乳液外觀及光學(xué)顯微鏡圖Fig. 5 Appearance and optical microscopic images of three emulsions

從圖4和圖5J～N可以看出，SA對(duì)SPI-CS-SA的穩(wěn)定性影響與CS對(duì)SPI-CS的影響相似。SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大的過(guò)程中，SPI-CS-SA的電荷也由正電荷轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)電荷，乳液粒徑呈現(xiàn)先增加再逐漸減小的趨勢(shì)，說(shuō)明攜帶負(fù)電荷的SA與SPI-CS表面作用，在乳液外側(cè)以靜電作用力形成SPI-CS-SA保護(hù)層。在SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)粒徑顯著增加（＜0.05），這是由于少量攜帶負(fù)電荷的SA加入通過(guò)靜電屏蔽減少了液滴的帶電量，范德華力和疏水相互作用等吸引作用力超過(guò)排斥力，液滴產(chǎn)生聚集（圖5J、K），但圖5I中所有質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA形成的SPI-CS-SA外觀都非常穩(wěn)定，這是由于較厚的乳化劑包裹，液滴之間仍存在較強(qiáng)的靜電排斥和空間排斥，使SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)乳液外觀沒(méi)有明顯的分層現(xiàn)象。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%以上的SA溶液后，乳液的電荷增加幅度減小，這可能是SA聚電解質(zhì)在SPI-CS表面吸附量逐漸飽和。當(dāng)SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加至1.5%時(shí)，Zeta電位增大，乳液平均粒徑下降，體系重新恢復(fù)穩(wěn)定。當(dāng)SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加時(shí)，粒徑和電位沒(méi)有顯著變化（＞0.05），因此選擇添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的SA制備SPI-CS-SA。

2.3 乳液微觀結(jié)構(gòu)

圖6A、A顯示，單純SPI在酸性條件下的乳液液滴出現(xiàn)嚴(yán)重聚集，這與圖3現(xiàn)象一致，圖6A箭頭指向的區(qū)域可以明顯看出乳液在蛋白pI附近的pH值環(huán)境中由于靜電排斥力弱，液滴之間相互吸引導(dǎo)致乳液液滴聚集嚴(yán)重，CS和SA的加入可以有效改善乳液聚集的情況，提高SPI乳液在酸性條件下的穩(wěn)定性，這與2.2.2節(jié)結(jié)果一致。

圖6 不同乳液對(duì)激光共聚焦的影響Fig. 6 CLSM images of three emulsions

圖6 顯示乳液核心主要由紫蘇油（尼羅紅染色呈紅色，圖6A、B、C）組成，具有核殼結(jié)構(gòu)（圖6B、C），殼層主要由SPI（尼羅藍(lán)染色呈綠色，圖6A、B、C）和多糖（CS和SA被鈣氟白色染料染色呈藍(lán)色，圖B、C）組成。結(jié)果表明，SPI-CS-SA（圖6C～C）、SPI-CS（圖6B～B）乳液液滴大小分布較SPI-E（圖6A～A）的液滴更均勻，界面層呈現(xiàn)出蛋白-油脂的核殼結(jié)構(gòu)（圖6B、C），這是由于乳液液滴在多糖的靜電力作用下更加分散，使在酸性條件下的SPI-E中液滴重疊的部分舒展開。多糖溶液分布于蛋白層的外圍形成無(wú)序的厚層（圖6B、C），這是由于蛋白比多糖具有更多的有序二級(jí)結(jié)構(gòu)（-螺旋、-折疊等）。

2.4 乳液穩(wěn)定性

2.4.1 貯藏穩(wěn)定性

圖7 3種紫蘇油乳液常溫貯存30 d乳析指數(shù)Fig. 7 Creaming index of three perilla oil emulsions stored at room temperature for up to 30 days

如圖7所示，穩(wěn)定性結(jié)果與粒徑和Zeta電位結(jié)果一致。SPI-E在30 d后表現(xiàn)出最差的穩(wěn)定性，乳析指數(shù)值達(dá)35.1%，新制成的乳液放置短時(shí)間后出現(xiàn)分層現(xiàn)象（圖5A），這是由于在pI附近酸性條件下，SPI表面帶電量低，SPI-E液滴之間相互接觸而聚集，產(chǎn)生分層的現(xiàn)象。SPI-CS和SPI-CS-SA穩(wěn)定性明顯提高，30 d后乳析指數(shù)分別為15.1%和10.4%，這是由于添加多糖后帶電量增加，由于CS的線性結(jié)構(gòu)，在乳液中形成了三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此CS在酸性條件下是非常好的增稠劑。SA的加入同樣降低了液滴之間的接觸，增強(qiáng)了電荷強(qiáng)度，因此有助于紫蘇油乳液的穩(wěn)定性，結(jié)果表明在酸性條件下的多層乳液能夠更好地保護(hù)多不飽和脂肪酸乳液遞送系統(tǒng)。

2.4.2 貯藏過(guò)程中氧化物測(cè)定結(jié)果

圖8 紫蘇油乳液37 ℃避光貯藏30 d的氫過(guò)氧化物含量（A）和TBARS值（B）Fig. 8 Hydroperoxide contents (A) and TBARS values (B) of perilla oil emulsions stored at 37 ℃ in dark for up to 30 days

3種乳液氧化穩(wěn)定性根據(jù)37 ℃條件下避光貯存30 d產(chǎn)生的初級(jí)氧化產(chǎn)物和次級(jí)氧化產(chǎn)物進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖8A中，對(duì)照組和3種乳液的氫過(guò)氧化物含量隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，表明油脂的氧化穩(wěn)定性逐漸降低，初始狀態(tài)下被包埋的乳液氫過(guò)氧化物含量高于對(duì)照組紫蘇油，原因可能是制備乳液過(guò)程中油脂受剪切力等作用被氧化，但在第6天開始對(duì)照組超過(guò)乳液包埋油脂的氧化速度，第30天氫過(guò)氧化物含量達(dá)到20.10 mmol/kg，而30 d后3種乳液的氫過(guò)氧化物含量分別為16.06、13.19 mmol/kg和9.54 mmol/kg，顯著低于對(duì)照組（＜0.05），說(shuō)明隨著包埋層數(shù)的增加，紫蘇油的氧化速率越慢。SPI-CS和SPI-CS-SA表面以靜電力吸附多糖分子，與沒(méi)有包埋的紫蘇油和SPI-E相比油-水界面層增加，有研究表明，脂質(zhì)的氧化穩(wěn)定性隨著油-水界面層的增加而增加。

TBARS值是表征脂質(zhì)次級(jí)氧化的指標(biāo)之一，一般與氫過(guò)氧化物相結(jié)合共同解釋油脂氧化過(guò)程。從圖8B可以看出，在初始階段油脂氧化速度均較低，但在貯存6～24 d TBARS值迅速增加，可能是由于脂質(zhì)的初級(jí)產(chǎn)物自發(fā)降解為次級(jí)產(chǎn)物，導(dǎo)致TBARS值增加。與對(duì)照組相比，SPI-CS與SPI-CS-SA都有延緩油脂氧化的作用，這是由于界面層數(shù)的增加充當(dāng)了油滴的物理屏障，油脂液滴與具有促進(jìn)油脂氧化的離子相互作用減弱，使其氧化速率越慢。此外，多種乳化劑的使用可能在增強(qiáng)抗氧化能力方面具有協(xié)同作用。因此結(jié)果表明乳液能夠提高紫蘇油的氧化穩(wěn)定性，并且界面層數(shù)增多對(duì)紫蘇油的氧化保護(hù)效果越好。

2.5 體外模擬消化模型

2.5.1 乳液脂肪酸釋放率

圖9 乳液在體外模擬消化模型中的脂肪酸釋放率Fig. 9 Release rate of FFA from perilla oil emulsions in an in vitro simulated digestion model

采用滴定法對(duì)SPI-CS和SPI-CS-SA穩(wěn)定的多層乳液在體外模擬消化模型中脂肪酸釋放進(jìn)行監(jiān)控，如圖9所示。SPI-CS相比SPI-E的脂肪酸最終釋放率較少，并且脂肪酸釋放的速率較慢，這是由于CS吸附在初級(jí)乳液表面，對(duì)液滴起到保護(hù)的作用，使脂肪酶對(duì)乳液的作用減弱。CS是含有帶正電的粒子（NH），p值在6.5左右，乳液在小腸部位消化環(huán)境偏堿性，CS分子失去大部分正電荷，從乳液表面脫落，使得脂肪酶不能與液滴中油脂接近。另一方面，CS還可能具有與帶負(fù)電荷的脂肪酶和其他消化酶結(jié)合的能力，從而降低脂肪酶的活性。這一結(jié)果表明，CS做為SPI-CS的聚電解質(zhì)能夠降低脂質(zhì)的消化率和消化程度。

SA的加入明顯降低了消化速率（＜0.05），可能是由于SA帶有高密度的線性直線分子，分子中帶有葡糖酸酯基團(tuán)，在胃部環(huán)境酸性條件下收縮的同時(shí)結(jié)合腸液中的鈣離子形成多層聚體，阻止鈣離子結(jié)合游離脂肪酸形成沉淀，從而使乳液消化變慢，因此相對(duì)SPI-E和SPICS有更多的油脂液滴到達(dá)小腸部位，最后SPI-CS-SA的聚電解質(zhì)在小腸中均失去了電荷，油脂液滴暴露在消化液中，因此消化程度相比對(duì)照組有所增加。SPI-CS-SA對(duì)經(jīng)過(guò)胃中的不飽和脂肪酸提供了更好的保護(hù)，并在腸中相對(duì)快速地釋放，達(dá)到油脂緩釋的效果。

2.5.2 乳液消化前后脂肪酸組成

表1 紫蘇油脂肪酸組成及乳液消化前后脂肪酸組成對(duì)比Table 1 Fatty acid composition of perilla oil and comparison of fatty acid composition before and after simulated digestion of perilla oil emulsions%

如表1所示，3種乳液消化前的各脂肪酸含量略低于對(duì)照組，并且隨著乳液層數(shù)的增加，脂肪酸含量逐漸降低，這與朱巧莎的研究結(jié)論略有不同，可能是由于本實(shí)驗(yàn)乳液制備過(guò)程中的儀器和制備方式使油脂在受剪切力和摩擦作用力，產(chǎn)生的熱量對(duì)脂肪酸產(chǎn)生氧化作用，這種影響隨著乳液層數(shù)疊加，導(dǎo)致乳液中脂肪酸含量略低于對(duì)照。SPI-CS-SA表面帶有大量負(fù)電荷，較高的負(fù)電荷會(huì)吸收帶有正電荷的金屬離子，從而導(dǎo)致消化前脂肪酸的降解量高于SPI-CS。3種乳液消化后的飽和脂肪酸比例下降，而多不飽和脂肪酸比例升高，主要原因是消化后的-亞麻酸（C）比例升高，說(shuō)明在包埋后紫蘇籽油中的棕櫚油、油酸和亞油酸的體外消化量較亞麻酸的多，其他脂肪酸的釋放率要高于多不飽和脂肪酸。另一方面，多不飽和脂肪酸的增加可能是由于膽鹽的作用釋放多不飽和脂肪酸。綜合分析液滴中的多不飽和脂肪酸更難從甘油三酯水解，多層乳液可以保證油脂中脂肪酸有效釋放。

3 結(jié) 論

以紫蘇油為油相，SPI、CS和SA分別作為SPI-E、SPICS和SPI-CS-SA的壁材，用粒徑電位、微觀形態(tài)對(duì)3種乳液表征確定3種聚電解質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明SPI、CS、SA最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、2.0%、1.5%時(shí)，SPI-E、SPI-CS和SPI-CS-SA理化性質(zhì)最佳，結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定。

乳液穩(wěn)定性結(jié)果表明，SPI-CS和SPI-CS-SA對(duì)比SPI-E乳析指數(shù)更低，穩(wěn)定性更好，添加多糖可以增強(qiáng)乳液電荷和網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。氧化穩(wěn)定性結(jié)果表明乳液界面層數(shù)影響紫蘇油的氧化穩(wěn)定性，并且層數(shù)越多對(duì)紫蘇油的保護(hù)效果越好。

體外消化結(jié)果表明3種乳液與對(duì)照組相比都可以很好保護(hù)脂肪中的脂肪酸，并且SPI-CS-SA較SPI-E和SPICS在腸部具有更好的緩釋效果，因此通過(guò)多層包埋對(duì)脂肪形成保護(hù)作用，減少小腸中脂肪與界面胰酶和膽鹽的接觸，進(jìn)而延遲脂肪的釋放，使紫蘇油在食品中應(yīng)用中具有巨大潛力。