數(shù)字化高溫大曲發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

鄭亞倫，趙 婷，王家勝，蔡開云，陳 萍，鄧俊松，方尚玲,3，曹敬華,3，陳茂彬,3,*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北稻花香酒業(yè)股份有限公司，湖北 宜昌 443000；3.湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)中心，湖北 武漢 430070）

白酒在中國傳統(tǒng)文化中有著重要的地位。大曲是白酒釀造的發(fā)酵啟動(dòng)劑，其質(zhì)量對(duì)白酒的品質(zhì)有極大影響，大曲風(fēng)味物質(zhì)決定了白酒的香氣。按照大曲的生產(chǎn)溫度可劃分為不同類別，不同溫度的大曲有不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。高溫大曲的生產(chǎn)最高溫度可達(dá)到65 ℃，較高溫度可以抑制酵母和霉菌的生長，形成以嗜熱菌為主要優(yōu)勢(shì)微生物的群落結(jié)構(gòu)。大曲中酶類豐富，包括糖化酶、液化酶、蛋白酶等。大曲提供的酶類物質(zhì)能夠分解白酒的發(fā)酵原料，為后續(xù)的微生物發(fā)酵提供營養(yǎng)。并且大曲作為白酒發(fā)酵的原料之一，能夠?yàn)榘l(fā)酵產(chǎn)物提供豐富的風(fēng)味物質(zhì)和風(fēng)味前體物質(zhì)。研究大曲中微生物的群落結(jié)構(gòu)，了解微生物的多樣性和功能對(duì)白酒的生產(chǎn)有十分重要的意義。長期以來，研究人員利用可培養(yǎng)的方式培養(yǎng)從大曲中分離出了包括嗜熱芽孢桿菌、球菌以及放線菌等微生物，但該方法無法全面檢測大曲中的微生物群落。以Illumina MiSeq測序平臺(tái)為代表的第二代測序技術(shù)具有快速、客觀、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用于大曲微生物結(jié)構(gòu)的分析，相關(guān)研究人員應(yīng)用該技術(shù)分析了不同儲(chǔ)存時(shí)間、不同類型以及不同顏色大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)。

現(xiàn)階段，白酒企業(yè)大多采取由人工測量記錄和控制發(fā)酵條件的傳統(tǒng)制曲方式，其存在工人經(jīng)驗(yàn)誤差大、大曲質(zhì)量不穩(wěn)定等弊端。為減少生產(chǎn)季節(jié)和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)帶來的大曲質(zhì)量的差異，白酒生產(chǎn)企業(yè)更傾向于探究新的大曲發(fā)酵方式。本研究將溫度、濕度、二氧化碳等傳感器布置在大曲發(fā)酵間的四周，電腦實(shí)時(shí)記錄發(fā)酵數(shù)據(jù)。根據(jù)企業(yè)的生產(chǎn)數(shù)據(jù)由電腦計(jì)算出最佳發(fā)酵參數(shù)，當(dāng)高溫大曲的發(fā)酵條件和設(shè)定值不同時(shí)，由電腦控制系統(tǒng)對(duì)發(fā)酵間的溫度、濕度等進(jìn)行調(diào)節(jié)（圖1）。將數(shù)字化管理系統(tǒng)用于大曲的生產(chǎn)過程，便于監(jiān)控發(fā)酵環(huán)境的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)大曲發(fā)酵的數(shù)字化管理。已有很多的學(xué)者研究過大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)，也明確了大曲中優(yōu)勢(shì)微生物組成。但對(duì)數(shù)字化管理系統(tǒng)在大曲發(fā)酵過程中的應(yīng)用還沒有系統(tǒng)性的研究。

本實(shí)驗(yàn)收集了由數(shù)字化管理系統(tǒng)生產(chǎn)的高溫大曲和傳統(tǒng)方式生產(chǎn)的高溫大曲各4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的3個(gè)平行樣本，利用高通量測序揭示數(shù)字化高溫大曲（digital high-temperature，IHD）和傳統(tǒng)高溫大曲（traditional high-temperature，THD）在發(fā)酵過程中微生物多樣性的變化趨勢(shì)以及差異。旨在驗(yàn)證數(shù)字化管理系統(tǒng)在大曲生產(chǎn)中運(yùn)用的可行性，有助于推動(dòng)大曲的自動(dòng)化生產(chǎn)。

圖1 數(shù)字化管理系統(tǒng)在高溫大曲發(fā)酵過程中的應(yīng)用Fig. 1 Application of digital management system in the fermentation process of high-temperature Daqu

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

IHD在發(fā)酵階段由系統(tǒng)管理發(fā)酵，其他生產(chǎn)工藝與傳統(tǒng)發(fā)酵相同，選擇0、18、30、60 d取樣。IHD編號(hào)為：IHD0、IHD18、IHD30、IHD60；THD樣本編號(hào)為：THD0、THD18、THD30、THD60。實(shí)驗(yàn)所用樣本均來自湖北省宜昌市某白酒生產(chǎn)企業(yè)。從發(fā)酵房間的4個(gè)角落以及中間取出5 份樣本，在無菌研磨機(jī)粉碎混合均勻后，取400 g用于分析理化數(shù)據(jù)，同時(shí)取適量的樣本于樣本管中，-20 ℃保存。

E.Z.N.A.Soil DNA Kit DNA抽提試劑盒 美國Omega BioTek公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；FastPolymerase 中國TransGen公司；MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5430 R小型離心機(jī) 德國Eppendorf公司；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì) 美國Thermo Fisher Scientific公司；ELx800酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；GeneAmp 9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；MiSeq測序儀美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲理化特性分析

水分、pH值、淀粉、發(fā)酵力和酯化力根據(jù)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》進(jìn)行測定，還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定。同時(shí)分析了糖化酶活力、液化酶活力。大曲所有的理化性質(zhì)都以干質(zhì)量計(jì)算。

1.3.2 DNA提取擴(kuò)增及高通量測序

使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit提取試劑盒提取0.5 g大曲樣本中的總DNA，DNA的完整性由1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。為了鑒定細(xì)菌，使用通用引物341F/806R擴(kuò)增16S rRNA的V3-V4高變區(qū)，為了鑒定樣本中的真菌，使用引物ITS1F/ITS2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫，PCR產(chǎn)物純化用于測序。最后文庫利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)測序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.3 微生物多樣性分析

利用QIIME（v 1.17）平臺(tái)對(duì)序列進(jìn)行物種分析和多樣性評(píng)價(jià)。使用FASTP軟件對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE軟件，以97%的相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，得到OTU代表序列。將具有代表性的序列與RDP、SLIVA和Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比。利用Mothur軟件進(jìn)行多樣性指數(shù)計(jì)算，包括Chao 1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)?；赨niFrac方法進(jìn)行多樣性分析，通過R軟件實(shí)現(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 理化特性分析

如圖2所示，兩種高溫大曲水分變化規(guī)律無明顯差異，都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵的前30 d下降較快，后期較緩慢。IHD的水分從39.70%下降至11.04%，THD的水分從39.42%降至12.10%。還原糖和pH值都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而淀粉含量則始終呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。IHD和THD的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)都在發(fā)酵結(jié)束時(shí)最低，分別為52.36%和54.48%，兩者的淀粉消耗率在18%左右。兩種高溫大曲的酯化力和液化酶活力隨發(fā)酵的進(jìn)行逐步上升，在發(fā)酵終點(diǎn)達(dá)到峰值。發(fā)酵力在發(fā)酵的第0、18天時(shí)稍低，隨之呈現(xiàn)上升后下降的趨勢(shì)，在第30天最高。第30天時(shí)IHD的發(fā)酵力高于THD，發(fā)酵結(jié)束時(shí)兩者的發(fā)酵力基本相同。兩種高溫大曲的糖化酶活力在發(fā)酵開始時(shí)最高，在第18天最低，隨后出現(xiàn)緩步上升。

圖2 高溫大曲發(fā)酵過程中理化性質(zhì)及酶活力的變化Fig. 2 Changes in physicochemical properties and enzyme activity during the fermentation of high-temperature Daqu

2.2 α多樣性分析

測序結(jié)果表明，24個(gè)高溫大曲樣本中共檢測出25 門、56 綱、147 目、279 科、619 屬、967種。相比而言，真菌的微生物豐富度遠(yuǎn)低于細(xì)菌，從全部的樣本中檢測出真菌7 門、24 綱、60 目、129 科、229 屬、365種。測序的覆蓋率高于99%且稀釋曲線接近平緩，說明測序深度足夠且能反映樣本中微生物的實(shí)際情況。用Chao 1指數(shù)、Sobs指數(shù)和Simpson指數(shù)評(píng)價(jià)微生物群落的豐富度和多樣性，見表1。

前些天，筆者回農(nóng)村老家，和妻子孩子陪著母親在場鎮(zhèn)上逛了一圈，發(fā)現(xiàn)在擠滿場鎮(zhèn)街道兩邊的貨攤上和商店里擺放的好些貨品賣相不佳，特別是一些家庭生活必需品的質(zhì)量堪憂，有些貨品看起來已經(jīng)非常老舊了，但仍舊擺放在攤位上和店里售賣，生意也自然冷冷清清，少有人駐足和問津。

表1 高溫大曲發(fā)酵過程α多樣性指數(shù)Table 1 α-Diversity indexes of bacterial and fungal communities in the fermentation process of high-temperature Daqu

兩種高溫大曲細(xì)菌群落的Simpson指數(shù)均呈先減少后上升的趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)低于發(fā)酵初始。這說明細(xì)菌群落的多樣性增加，在第18天時(shí)最高。細(xì)菌群落的Chao 1指數(shù)與Simpson指數(shù)變化規(guī)律相反，Chao 1指數(shù)先上升后下降。IHD60的Chao 1指數(shù)高于THD60，這說明發(fā)酵結(jié)束時(shí)IHD的細(xì)菌豐富度高于THD。Simpson指數(shù)下降說明群體的多樣性上升，反之，則多樣性下降。如表1所示，真菌群落的Simpson指數(shù)比發(fā)酵初始時(shí)高，說明兩種高溫大曲的真菌群落多樣性隨發(fā)酵時(shí)間的延長而下降。兩種高溫大曲的細(xì)菌和真菌多樣性變化情況基本相似，但I(xiàn)HD整體的豐富度和多樣性多數(shù)高于THD。

圖3 微生物群落α多樣性指數(shù)的差異顯著性分析Fig. 3 Significant difference analysis of α-diversity indexes of microbial communities

如圖3所示，兩個(gè)相同發(fā)酵時(shí)間的樣本之間的值小于0.05時(shí)具有顯著差異。細(xì)菌群落在發(fā)酵過程中，IHD和THD在相同時(shí)間時(shí)Sobs指數(shù)無顯著差異（＞0.05）。對(duì)于真菌群落，發(fā)酵IHD60和THD60的真菌豐富度具有顯著差異（=0.01），其余IHD和THD在相同時(shí)間點(diǎn)的樣本豐富度無顯著差異。IHD60與THD60的Sobs指數(shù)間有顯著差異，說明兩者實(shí)際觀察到的OTU數(shù)目差異大。但是結(jié)合Chao1算法估計(jì)的OTU數(shù)目和多樣性指數(shù)（表1）綜合分析，兩種高溫大曲在發(fā)酵完成時(shí)微生物群落之間有較好的相似性。

2.3 大曲微生物群落結(jié)構(gòu)

所有高溫大曲樣本中的細(xì)菌隸屬于25 門，其中相對(duì)含量高于1%的有5 門，包括厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidota）。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，18、30、60 d的IHD樣本形成以Firmicutes為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)門的微生物群落結(jié)構(gòu)，其相對(duì)豐度都高于80%。THD中微生物門的變化趨勢(shì)與IHD相似，第18、30、60天的THD樣本中Firmicutes相對(duì)豐度比同時(shí)間的IHD低20%左右（圖4a）。THD第18、30、60天的樣本形成以Firmicutes和Actinobacteria為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)門的微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖4 發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落在門水平（a）和屬水平（b）的相對(duì)豐度Fig. 4 Relative abundance of bacterial community during the fermentation process at the phylum level (a) and the genus level (b)

如圖4b所示，IHD18和THD18在屬組成具有十分顯著的差異，這與多樣性指數(shù)的差異顯著性分析相吻合（圖2b）。IHD18中優(yōu)勢(shì)菌屬為乳酸桿菌屬（，38.31%）、狹義梭菌屬（，12.46%）、鏈球菌屬（，10.95%）、布勞特氏菌屬（，6.33%）等。THD18中，糖多孢菌屬（，33.77%）、高溫放線菌屬（，17.88%）、芽孢桿菌屬（，33.15%）和在屬水平未分類的偽諾卡式菌科（f_Pseudonocardiaceae，11.52%）為優(yōu)勢(shì)菌。第30天的樣本中微生物菌屬?zèng)]有明顯區(qū)別，但I(xiàn)HD30中相對(duì)豐度＞1%的菌屬較THD30多。IHD30和THD30兩者的菌屬豐度具有較大的區(qū)別，包括克羅彭斯特菌屬（，IHD 7.73%，THD 27.48%）、（IHD 6.88%，THD 25.34%）、（IHD 50.45%，THD 23.64%）和f_Pseudonocardiaceae（IHD 2.14%，THD 8.06%）。發(fā)酵第60天時(shí)，IHD和THD都形成以、和葡萄球菌屬（）為主的微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖5 發(fā)酵過程中的真菌群落在門水平（a）和屬水平（b）的相對(duì)豐度Fig. 5 Relative abundance of fungal community during the fermentation process at the phylum level (a) and the genus level (b)

真菌有3個(gè)門的相對(duì)豐度＞1%（圖5a），子囊菌門（Ascomycota）是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌門，其相對(duì)豐度在整個(gè)發(fā)酵過程中都高于90%。如圖5b所示，真菌屬在不同的發(fā)酵時(shí)間也具有明顯區(qū)別。第0天的高溫大曲中微生物群落的多樣性最高，這與Simpson指數(shù)分析結(jié)果相同（表1）。IHD0和THD0微生物在屬水平組成相似，都檢測出嗜熱子囊菌屬（，IHD 22.23%，THD 26.78%）、嗜熱真菌屬（，IHD 3.88%，THD 8.49%）、曲霉菌屬（，IHD 40.06%，THD 11.21%）、鏈格孢菌屬（，IHD 15.28%，THD 24.15%）和耐干霉菌屬（，IHD 6.06%，THD 9.88%）等，除此之外第0天的高溫大曲中還有較多相對(duì)豐度大于1%的菌屬。IHD18的菌屬相對(duì)豐度較為均勻，而THD18中相對(duì)豐度達(dá)到95.36%。第30、60天的樣本則是形成以和為優(yōu)勢(shì)菌屬的真菌群落結(jié)構(gòu)。

2.4 β多樣性分析

基于Bray-Curtis距離算法對(duì)所有的高溫大曲樣本進(jìn)行NMDS分析，結(jié)果如圖6所示。對(duì)細(xì)菌群落測序結(jié)果進(jìn)行排序分析，其stress值為0.066＜0.1，排序結(jié)果良好。從圖6a可知，發(fā)酵第0天的樣本具有較好的相似性，IHD0和THD0空間分布靠近。IHD18獨(dú)自分布在第2象限，與其他樣本的距離較遠(yuǎn)，這表明IHD18樣本的微生物組成與其他樣本具有顯著差異。真菌群落的NMDS分析結(jié)果如圖6b所示，其stress值為0.068＜0.1。相似性分析進(jìn)一步計(jì)算了群落的離散情況（=0.002）。IHD60和THD60組間微生物組成相似，組內(nèi)微生物組成也具有較高的相似性。其余樣本組內(nèi)離散程度高，IHD和THD相同發(fā)酵時(shí)間的高溫大曲差異性顯著。基于微生物數(shù)據(jù)對(duì)其進(jìn)行層級(jí)聚類分析，結(jié)果表明層級(jí)聚類分析結(jié)果與NMDS分析結(jié)果相似。

圖6 微生物群落的NMDS和層級(jí)聚類樹分析Fig. 6 NMDS and hierarchical clustering analysis of microbial communities

2.5 理化性質(zhì)與微生物相關(guān)性分析

表2 發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)屬與理化性質(zhì)的相關(guān)性Table 2 Correlation between dominant genus and physicochemical properties during fermentation process

3 討 論

高溫大曲在成型階段會(huì)加入一定比例的母曲，為大曲接入部分微生物和生物酶，這部分微生物和酶將成為高溫大曲發(fā)酵的啟動(dòng)助力。高溫大曲能夠在自然發(fā)酵過程中富集對(duì)發(fā)酵有利的微生物，而這些微生物的主要來源于母曲、原料、空氣和制曲的工具。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，大曲中微生物群落的組成結(jié)構(gòu)在不斷變化，微生物群體出現(xiàn)更迭，利用高通量測序技術(shù)研究高溫大曲在發(fā)酵過程中微生物群落組成的變化。測序結(jié)果表明，兩種高溫大曲細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌屬為、、、、和。優(yōu)勢(shì)真菌屬為、和等。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，大曲的主要優(yōu)勢(shì)微生物菌屬為、、乳酸球菌屬（）、、假絲酵母屬（）和。大曲主要優(yōu)勢(shì)微生物與本研究高溫大曲檢測出的微生物有所重合，但在不同的文獻(xiàn)中微生物群落具有一定的差異。這可能是因?yàn)榇笄a(chǎn)的地理環(huán)境因素和生產(chǎn)原料的不同所導(dǎo)致，不同類型的大曲和各異的發(fā)酵環(huán)境使大曲形成不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。

高溫大曲在發(fā)酵過程中微生物群落組成變化顯著，但I(xiàn)HD和THD在發(fā)酵完成時(shí)，都形成了以、、和為主要菌屬的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。這些菌屬在大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道中接連出現(xiàn)，醬香風(fēng)味的大曲中、為核心物種。其他報(bào)道中也都是優(yōu)勢(shì)菌屬，其具有強(qiáng)大的水解能力且與大曲中吡嗪類物質(zhì)的生成呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的生成具有重要的作用。已知能夠產(chǎn)生多種水解酶，包括蛋白酶和糖化酶，這些酶類物質(zhì)有助于白酒發(fā)酵原料的糖化液化。和在醬香和濃香型的大曲中含量豐富，這些菌屬在大曲發(fā)酵前期都有報(bào)道。其中在谷物當(dāng)中普遍存在，高溫大曲中的可能來源于原料和母曲，能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，為酵母形成乳酸乙酯提供底物，而乳酸乙酯是白酒中重要的風(fēng)味成分之一。Tao Yong等發(fā)現(xiàn)乳酸是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素，乳酸含量過多時(shí)會(huì)抑制其他微生物的生長。白酒發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，如含量的變化會(huì)引起乙酸、乳酸和乙酸乙酯的增加，乳酸乙酯的水平下降，大曲微生物群落的變化對(duì)白酒發(fā)酵也會(huì)有重要的影響。和也在其他的文獻(xiàn)中報(bào)道過。和是小麥中最豐富的菌屬，其中能夠產(chǎn)生耐熱的-淀粉酶，幫助淀粉水解為葡萄糖、麥芽糖等。

兩種高溫大曲在發(fā)酵結(jié)束時(shí)均形成以、、為主要真菌屬的群落結(jié)構(gòu)。發(fā)酵第0天的高溫大曲真菌群落多樣性比發(fā)酵結(jié)束時(shí)高，且在第0天的高溫大曲中鏈格孢屬（）的相對(duì)豐度較高，但在后續(xù)的樣本中未檢測出。在空氣中大量存在，能夠在糧食中快速生長，但其并不利于大曲的發(fā)酵和白酒的釀造。微生物群落結(jié)構(gòu)隨發(fā)酵時(shí)間的推移發(fā)生顯著變化，在后期的發(fā)酵樣本中消亡，這與其他報(bào)道的觀點(diǎn)相吻合：大曲發(fā)酵是自然選擇有利微生物的過程。一般來講大多數(shù)的酵母菌在50 ℃以上時(shí)幾乎不生長，而高溫大曲的最高生產(chǎn)溫度能達(dá)到65 ℃，因此真菌群落中豐度占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的是、等耐熱性的真菌。

兩種大曲在發(fā)酵過程中水分和淀粉含量穩(wěn)步下降，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最低。按一般生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，大曲淀粉含量在50%、水分含量在10%～14%時(shí)較好。發(fā)酵力大小與細(xì)菌和耐熱性真菌顯著正相關(guān)，高溫大曲在開放式的發(fā)酵環(huán)境中不斷富集來源不同的微生物，淘汰不耐熱的微生物并且馴化耐高溫菌形成以耐熱菌為優(yōu)勢(shì)菌屬的群落結(jié)構(gòu)。高溫大曲的最高溫度會(huì)上升至65 ℃，高溫幾乎淘汰掉了所有酵母和大多數(shù)霉菌，因此高溫大曲亦能稱為細(xì)菌曲。

大曲微生物群落的更替與環(huán)境因子有關(guān)，Tang Hanlan等認(rèn)為環(huán)境變量是促進(jìn)大曲發(fā)酵過程中微生物變化的驅(qū)動(dòng)力。結(jié)果表明水分對(duì)細(xì)菌和真菌群落影響較大，與Guan Tongwei等的研究結(jié)果相似。除水分外，溫度對(duì)大曲微生物結(jié)構(gòu)的影響也很重要，相關(guān)研究表明溫度對(duì)大曲微生物的多樣性和豐度有極大影響，且細(xì)菌群落比真菌更容易受水分的影響。大曲溫度呈現(xiàn)先升高后保持相對(duì)的穩(wěn)定后又下降，這可能是由于微生物在合適的生長條件下迅速繁殖，微生物生長繁殖產(chǎn)生的大量生物熱使發(fā)酵溫度迅速升高，高溫使酵母和不耐熱的霉菌迅速被淘汰。大曲在后熟生香期水分降低，其水分活度不再適合微生物進(jìn)行大量的生長繁殖因而大曲的溫度開始下降，降至室溫時(shí)發(fā)酵結(jié)束。通過相關(guān)性計(jì)算可知微生物與環(huán)境因子之間的關(guān)系，但其內(nèi)在的相互作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

發(fā)酵時(shí)間相同時(shí)，兩種大曲的微生物群落組成和豐度具有略微差異，這可能是由于發(fā)酵環(huán)境的濕度和溫度的差異導(dǎo)致。THD的發(fā)酵溫度靠生物熱和生產(chǎn)季節(jié)的環(huán)境溫度共同決定，排潮和降濕都由人工完成，高溫大曲的品質(zhì)受季節(jié)的影響較大。綜合比較IHD和THD的微生物組成和理化性質(zhì)可知，兩者在發(fā)酵時(shí)間相同時(shí)，微生物多樣性和理化性質(zhì)之間并沒有顯著差異，NMDS分析和層級(jí)聚類分析可以證明這一觀點(diǎn)。數(shù)字化發(fā)酵根據(jù)設(shè)定值和外界環(huán)境參數(shù)對(duì)大曲發(fā)酵進(jìn)行調(diào)節(jié)，能夠更好地重現(xiàn)生產(chǎn)參數(shù)。同時(shí)實(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)監(jiān)控系統(tǒng)可以幫助記錄大曲的發(fā)酵情況，能夠降低人工生產(chǎn)帶來的品質(zhì)波動(dòng)，降低人工參與度。

4 結(jié) 論

高溫大曲的主要細(xì)菌類群為、、和，主要的真菌類群為、、。IHD和THD在相發(fā)酵時(shí)間時(shí)的微生物群落具有良好相關(guān)性，兩者在發(fā)酵結(jié)束時(shí)并無顯著差異。IHD的酯化力、糖化酶活力和液化酶活力略高于THD，其他理化特性無明顯的差異。數(shù)字化管理系統(tǒng)在大曲生產(chǎn)中的應(yīng)用具有可行性，為大曲的數(shù)字化生產(chǎn)提供一定的理論支撐。在此研究基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步研究改進(jìn)大曲的數(shù)字化生產(chǎn)工藝，推動(dòng)大曲自動(dòng)化生產(chǎn)。