郭家媚 ， 趙允清 ， 邵明珠 ， 吳同壘 ， 張志強(qiáng) ， 李蘊(yùn)玉 ， 張艷英 ， 李佩國(guó) ， 張召興,2

(1.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 秦皇島 066004 ； 2.河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系 ， 河北 承德 067000)

禽沙門(mén)菌病 (Avian salmonellosis)是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要細(xì)菌性疾病之一，臨床中常見(jiàn)沙門(mén)菌病主要包括雞白痢、禽傷寒和雞副傷寒3種[1-2]。禽沙門(mén)菌病可以引起不同日齡的雞發(fā)病，其中雛雞發(fā)病率和死亡率均較高，成年雞多為慢性和隱性經(jīng)過(guò)，常不出現(xiàn)癥狀，但可導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降，引發(fā)其他疾病[3-5]。沙門(mén)菌寄生于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，絕大多數(shù)對(duì)人和動(dòng)物具有致病性，且成為禽產(chǎn)品污染的主要來(lái)源之一[6]。相關(guān)研究表明，沙門(mén)菌引起的中毒病例約占細(xì)菌性食物中毒的40%，該菌在自然界中廣泛存在，且對(duì)人類的健康具有很大的威脅，成為公共衛(wèi)生問(wèn)題[7]。

沙門(mén)菌屬型復(fù)雜，其中菌體表面脂多糖、鞭毛抗原分別攜帶的O、H抗原等，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且不易分型，生化反應(yīng)、血清型分型及傳統(tǒng)的分型方法存在較大的局限性[8]。傳統(tǒng)的分型方法不能滿足區(qū)分不同來(lái)源的沙門(mén)菌菌株之間同源性。脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)具有重復(fù)性好、分辨率高、易于標(biāo)化等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌分子分型中[9-10]。本試驗(yàn)從患病蛋種雞體內(nèi)分離到了12株沙門(mén)菌，并對(duì)分離的12株沙門(mén)菌致病性、血清分型、分子分型等生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步分析蛋種雞源沙門(mén)菌及開(kāi)展分子流行病學(xué)溯源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 秦皇島地區(qū)蛋種雞養(yǎng)殖場(chǎng)，采集患病蛋種雞的肝臟、卵黃、心血等病料組織。

1.2 主要試劑 沙門(mén)菌血清因子，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；API 20E試劑盒，購(gòu)自法國(guó)梅里埃生物科技公司；沙門(mén)菌科瑪嘉培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2×TaqMasterMix、10×M Buffer、0.1%BSA、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、細(xì)胞懸浮緩沖液(CSB)、細(xì)胞裂解緩沖液(CLB)、TE緩沖液、20%十二烷基硫酸鈉，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DL-2 000 DNA Marker，購(gòu)自北京中科瑞泰生物科技有限公司；沙門(mén)菌H9812(Marker)、7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基，均由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要儀器 PCR儀FGEN02TD型，英國(guó)Techne公司產(chǎn)品；CHEF MAPPER脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、Bio-Rad型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Rio-Rad公司產(chǎn)品；生物培養(yǎng)箱DHP-9082型，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 種蛋由河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)基地提供，1日齡白來(lái)航雛雞由本實(shí)驗(yàn)室孵化，飼養(yǎng)至14日齡，經(jīng)檢測(cè)無(wú)沙門(mén)菌感染，再進(jìn)行致病性試驗(yàn)。

1.5 細(xì)菌的分離與培養(yǎng) 采集的患病蛋種雞的肝臟、卵黃、心血等病料組織無(wú)菌條件接種于7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～18 h，挑取優(yōu)勢(shì)單個(gè)菌落接種于沙門(mén)菌科瑪嘉培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，挑取沙門(mén)菌科瑪嘉培養(yǎng)基單個(gè)菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢。

1.6 API 20E試劑盒鑒定 取分離純化的疑似沙門(mén)菌的菌株，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將分離菌株懸浮液接種API 20E試條，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，根據(jù)細(xì)菌編碼表判讀結(jié)果。

1.7 細(xì)菌的PCR鑒定 按細(xì)菌提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，設(shè)計(jì)16S rRNA基因序列通用引物F:5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/R:5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，進(jìn)行PCR檢測(cè)，將分離菌株的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的沙門(mén)菌參考株的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.8 致病性試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[11]報(bào)道的方法，分別設(shè)攻毒組和對(duì)照組，每一株菌為1個(gè)攻毒組，將分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期計(jì)數(shù)，每一株分離菌株腹腔注射5只試驗(yàn)雛雞，劑量為0.2 mL(108CFU/mL)；對(duì)照組給予等量的無(wú)菌PBS。攻毒12 h后開(kāi)始觀察，試驗(yàn)期為7d，試驗(yàn)期間觀察并記錄雛雞發(fā)病和死亡情況，對(duì)死亡的雛雞進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.9 血清分型檢測(cè) 按照沙門(mén)菌血清因子說(shuō)明書(shū)，采用玻板凝集試驗(yàn)對(duì)分離的12株沙門(mén)菌進(jìn)行血清型鑒定。

1.10 PFGE分型檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道的方法，對(duì)分離的12株沙門(mén)菌進(jìn)行PFGE分型，用凝膠成像分析系統(tǒng)在紫外燈下獲取凝膠圖像，將獲得的凝膠圖像送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所腹瀉病室進(jìn)行聚類分析。采用BioNumerics軟件繪制沙門(mén)菌分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析遺傳變異性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離與培養(yǎng) 疑似沙門(mén)菌分離菌株在7%綿羊脫纖血培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、淺白色的菌落，不溶血；在沙門(mén)菌科瑪嘉培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓形光滑、邊緣整齊、大小一致的紫紅色菌落；革蘭染色為陰性的兩端鈍圓桿狀菌，大小(0.5～0.8)μm×(1.0～2.0)μm。

2.2 API 20E生化鑒定 利用API 20E 試條對(duì)12株分離菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，12株分離菌株均為沙門(mén)菌，并命名為C1、36、C13、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11和C12。

2.3 細(xì)菌的PCR鑒定 結(jié)果如圖1所示，分離的12株分離菌株用細(xì)菌的16S rRNA基因序列通用引物均擴(kuò)增出1 492 bp左右的目的基因。12株分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的12株沙門(mén)菌參考株的基因序列同源性在97.9%～99.0%。

圖1 沙門(mén)菌分離菌株的PCR擴(kuò)增

2.4 致病性試驗(yàn) 攻毒組的白來(lái)航雛雞在攻毒后24～96 h出現(xiàn)精神沉郁、采食量減少、腹瀉，個(gè)別的雛雞出現(xiàn)無(wú)癥狀死亡。無(wú)菌采集死亡雛雞的病料組織，成功分離到沙門(mén)菌。直到7 d試驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組白來(lái)航雛雞未出現(xiàn)明顯臨床癥狀。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，12株分離株對(duì)白來(lái)航雛雞具有一定致病性，均為致病性沙門(mén)菌。致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的12株沙門(mén)菌致病性沒(méi)有差異性。

2.5 血清分型檢測(cè) 采用玻板凝集試驗(yàn)對(duì)分離的12株沙門(mén)菌進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示，除菌株36未測(cè)出血清型外，其余11株沙門(mén)菌分離菌株屬于4個(gè)血清型，其中菌株C1為O4(B)群無(wú)動(dòng)力沙門(mén)菌；菌株C3、C4為雞沙門(mén)菌；菌株C5、C6、C7、C8、C9為病牛沙門(mén)菌；菌株C10、C11、C12為腸炎沙門(mén)菌。

2.6 PFGE分型檢測(cè) 用PFGE對(duì)12株沙門(mén)菌分離菌株進(jìn)行分子分型，結(jié)果如圖2所示，12株沙門(mén)菌用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后進(jìn)行PFGE電泳，其中菌株36 PFGE帶型不明顯，其余11株沙門(mén)菌株可得出不同的PFGE圖譜，每株約產(chǎn)生10～20條電泳帶。

圖2 沙門(mén)菌分離株的PFGE圖譜

沙門(mén)菌聚類分析結(jié)果如圖3所示，其中菌株36 PFGE帶型不明顯未進(jìn)行聚類分析，其余11株分離菌株之間的相似度為56%～100%，11株試驗(yàn)菌可分為5個(gè)不同的型別，其中菌株C13、C4與菌株C5、C6、C7、C8相似度均為100%，菌株C9與菌株C10、C11相似度為100%，其余菌株相似度較低。11株沙門(mén)菌分離株的聚類分析圖中，以75%的相似度為界，可以分為 A、B、C和 D共4個(gè)簇。A 簇包括病牛沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌，B 簇均為病牛沙門(mén)菌，而C 簇也只有1種血清型，即雞沙門(mén)菌，D簇只有1株沙門(mén)菌，血清型為O4群無(wú)動(dòng)力沙門(mén)菌。相同的血清型可能具有聚為 1 簇的趨勢(shì)。不同血清型間的相似度高。菌株C9(病牛沙門(mén)菌)和菌株C10(腸炎沙門(mén)菌)的相似度為100%，而菌株C8和菌株C9(同為病牛沙門(mén)菌)的相似度只有70%。

圖3 11株沙門(mén)菌分子分型聚類圖

3 討論

沙門(mén)菌是一類廣泛分布于自然界人獸共患的病原菌之一，該菌可以通過(guò)多種途徑污染食品、水源及畜產(chǎn)品等，引起人類的食物中毒、急性腸胃炎和動(dòng)物腹瀉等疾病，對(duì)人類及動(dòng)物健康構(gòu)成極大危害[5-6]。禽沙門(mén)菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，經(jīng)過(guò)一定途徑進(jìn)入宿主體內(nèi)，在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)定殖，并隨著吞噬細(xì)胞擴(kuò)散至其他組織器官，該菌可以通過(guò)水平傳播，也可以通過(guò)垂直傳播，帶菌和隱形感染的種雞是沙門(mén)菌主要宿主的傳染源，可以長(zhǎng)期帶毒和排毒，導(dǎo)致沙門(mén)菌病在種雞、雛雞中廣泛流行[12-13]。因此，在蛋種雞養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)該注意沙門(mén)菌病的凈化與控制，減少該病的發(fā)生與流行。

在養(yǎng)殖過(guò)程中，種雞群雞白痢凈化主要通過(guò)全血玻板凝集試驗(yàn)檢測(cè)，此方法簡(jiǎn)單便于操作，但只能檢出含有 O抗原的沙門(mén)菌，會(huì)造成其他類型沙門(mén)菌感染的漏檢，而細(xì)菌分離鑒定可以解決其他類型的沙門(mén)菌感染的漏檢情況[4-6]。本試驗(yàn)采用API20E、PCR和人工感染致病性試驗(yàn)從患病的蛋種雞病料組織分離得到12株致病性沙門(mén)菌，為了更好地控制該病，對(duì)其血清分型、分子分型等生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，除菌株36未測(cè)出血清型外，其余11株沙門(mén)菌分離株屬于4種血清型，其中 C1為O4(B)群無(wú)動(dòng)力沙門(mén)菌，菌株C13、C4為雞沙門(mén)菌，菌株C5、C6、C7、C8、C9為病牛沙門(mén)菌，菌株C10、C11、C12為腸炎沙門(mén)菌。本試驗(yàn)在患病的蛋種雞體內(nèi)分離到病牛沙門(mén)菌，國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果與費(fèi)中杰[2]、吳曉君[3]、徐耀輝等[4]的報(bào)道存在一定差異性，可能與地區(qū)分布、雞的種源、場(chǎng)環(huán)境、飼料、鼠類及其他媒介生物攜帶沙門(mén)菌等有關(guān)。本試驗(yàn)分離的5株病牛沙門(mén)菌可能對(duì)種雞群具有潛在威脅，需引起注意。

為了更好地了解養(yǎng)殖場(chǎng)中沙門(mén)菌的流行情況，建立起常態(tài)監(jiān)測(cè)具有重要意義。本試驗(yàn)利用PFGE方法對(duì)分離的12株致病性沙門(mén)菌分子分型進(jìn)行溯源分析，結(jié)果顯示，除菌株36因PFGE帶型不明顯未進(jìn)行聚類分析外，其余11株沙門(mén)菌分離株包含4種血清型，可分成4種PFGE指紋圖譜，各帶型間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，不同血清型的菌株之間的相似度在56%～100%，相同的血清型可能具有聚為 1 簇的趨勢(shì)，不同血清型菌株之間具有較高的相似度，11株沙門(mén)菌具有相同血清型的菌株中具有不同的PFGE圖譜，不同血清型的沙門(mén)菌菌株可同屬一種PFGE指紋圖譜，如5株病牛沙門(mén)菌可分為2個(gè)型別，C9株病牛沙門(mén)菌與C10株腸炎沙門(mén)菌圖譜更為相似。因而說(shuō)明了PFGE指紋圖譜與血清學(xué)型別無(wú)相關(guān)性，相同血清型的沙門(mén)菌分離菌株其PFGE圖譜不一定相同，PFGE可進(jìn)一步區(qū)分各菌株間的微小差別，因而在沙門(mén)菌病流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測(cè)中發(fā)揮重要作用。沙門(mén)菌的PFGE分型結(jié)果能夠?yàn)椴煌瑏?lái)源的沙門(mén)菌數(shù)據(jù)庫(kù)的建立提供更詳細(xì)的資料，本試驗(yàn)為蛋種雞源沙門(mén)菌疾病的進(jìn)一步凈化與防控提供了科學(xué)依據(jù)。