熊 敏，潘勇軍，苗新宇

(南方科技大學(xué)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518000)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是臨床常見代謝性疾病，主要表現(xiàn)為高血糖，其中1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)患者約占DM總?cè)藬?shù)5%～10%，是青少年常見內(nèi)分泌疾病之一，近年來調(diào)查顯示，成人T1DM患者人數(shù)甚至更多，全球發(fā)病率呈上升趨勢[1]。糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是DM常見并發(fā)癥，以尿中出現(xiàn)白蛋白為主要特征，DM中有20%～40%患者發(fā)展為DKD，是DM預(yù)后不良的重要原因之一[2]。DKD已逐漸成為終末期腎病(end-stage renel disease，ESRD)最主要原發(fā)病，導(dǎo)致腎功能發(fā)生不可逆損傷，嚴重危害患者生命健康。DKD早期起病隱匿，而腎穿刺活檢屬有創(chuàng)檢查，患者難以接受，因此，通過血清相關(guān)指標進行早期診斷，并采取積極措施進行干預(yù)，有助于延緩疾病進展，改善患者預(yù)后。可溶性細胞間黏附因子1(soluble intercellular adhesion molecule 1，sICAM1)參與炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)，與DKD發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3]。腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)是腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)家族成員，腎組織受刺激后可大量表達，對判斷腎損傷具有潛在價值[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)-155參與調(diào)控炎癥反應(yīng)，在急性腎損傷及梗阻性腎病中表達上調(diào)，與腎損傷有關(guān)[5-6]。目前關(guān)于DKD早期診斷相關(guān)研究多集中于2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，而對T1DM患者研究較少。本研究通過檢測T1MD患者血清sICAM1、TNFR1、miRNA155水平，探討三者檢測對DKD早期診斷的意義，以期為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 納入及排除標準

納入標準：①符合世界衛(wèi)生組織關(guān)于DM診斷標準[7]；②根據(jù)發(fā)病年齡、胰島素水平等診斷為T1DM。排除標準：①T2DM或其他繼發(fā)性DM患者；②急慢性感染患者；③存在心、肺、肝等器官嚴重損傷；④合并其他腎臟疾??；⑤合并血液系統(tǒng)疾病患者；⑥嚴重精神疾病患者；⑦合并惡性腫瘤及其他可能影響糖代謝疾病患者；⑧妊娠及哺乳期婦女；⑨使用腎毒性或影響肝腎代謝藥物；⑩合并甲狀腺機能減退/亢進等內(nèi)分泌疾病?；颊呔橥?，研究經(jīng)院倫理委員會批準。

以尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)為早期DKD診斷指標[8]，收集患者24h尿液，測定UAER，根據(jù)UAER水平進行分組，UAER<20μg/min為DM組，UAER 20～200μg/min為早期DKD組。

1.2 一般資料

選取2019年1月至2021年3月我院內(nèi)分泌科、腎內(nèi)科收治的T1DM患者101例，其中男58例，女43例，年齡21～51歲，平均(31.79±5.48)歲。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料調(diào)查

收集患者年齡、性別、病程、吸煙史、飲酒史、治療史(降糖、降壓、降脂)等基本資料，計算身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)，入院后禁食12h，采集清晨空腹靜脈血，測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、糖化血紅蛋白A1c(glycated hemoglobin A1c，HbA1c)，收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、尿酸(uric acid，UA)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、估算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、24h尿蛋白等臨床指標。

1.3.2 血清sICAM1、TNFR1、miRNA155水平檢測

所有患者抽取清晨空腹靜脈血5mL，3 000r/min 4℃條件下離心5min，留取上清，-80℃保存。取血清樣品，sICAM1、TNFR1采用酶聯(lián)免疫吸附法，根據(jù)試劑盒(上海潤裕生物科技有限公司)說明書，使用680全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)在450nm處讀取吸光度(A)值，以標準品濃度為橫坐標，A值為縱坐標繪制標準曲線，計算待測樣本中sICAM1、TNFR1水平。

miRNA155采用qRT-PCR法檢測，取血清樣品，加入TRzol試劑，提取總RNA，檢測總RNA純度和濃度，選擇A260/A280為1.8～2.0的RNA樣品，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配制反應(yīng)體系，包括：2μL cDNA，1μL上下游引物，10μL SYBR Green Master Mix，ddH2O補充至總體積25μL。使用CFX96 PCR儀(美國Bio-Rad公司)檢測血清樣本中miRNA155表達水平。擴增條件：95℃預(yù)變性10min，95℃ 20s，55℃ 10s，72℃ 30s，40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，miRNA155相對表達水平采用2-△△CT法計算。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 miRNA155引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 可能導(dǎo)致DKD的影響因素分析

101例T1DM患者發(fā)生DKD 37例，發(fā)生率為36.63%。兩組患者年齡、性別構(gòu)成比、病程、BMI、FBG、HbA1c、SBP、DBP、UA、TC、HDL、TG、LDL、吸煙、飲酒、ALT、AST、降糖治療、降壓治療、降脂治療構(gòu)成比及FLNS、24h尿蛋白等臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。早期DKD組Scr、BUN、hs-CRP、sICAM1、TNFR1、miRNA155高于DM組，eGFR低于DM組(P<0.05)。見表2。

表2 影響T1DM患者發(fā)生DKD的單因素分析

2.2 Logistic回歸分析

以T1DM患者發(fā)生DKD的影響因素為自變量(X)，以是否發(fā)生DKD為因變量(Y)，分別進行賦值，賦值方法見表3。

表3 變量賦值方法

將X和Y納入Logistic回歸模型，進行多因素分析。結(jié)果顯示，hsCRP(OR=2.140，P=0.023)、eGFR(OR=0.425，P=0.009)、sICAM1(OR=4.187，P=0.001)、TNFR1(OR=4.697，P<0.001)、miRNA155(OR=3.832，P<0.001)均是導(dǎo)致T1DM患者發(fā)生DKD的影響因素。見表4。

表4 T1DM患者發(fā)生DKD的Logistic回歸分析

2.3 血清sICAM1、TNFR1、miRNA155對早期DKD的診斷價值

ROC結(jié)果顯示，血清sICAM1、TNFR1、miRNA155用于診斷早期DKD的最佳截斷點分別為303.16ng/mL、873.21pg/mL、4.65，單獨及聯(lián)合診斷早期DKD的AUC分別為0.762、0.749、0.756、0.835。見表5、圖1。

表5 血清sICAM1、TNFR1、miRNA155對早期DKD的診斷價值

圖1 血清sICAM1、TNFR1、miRNA155對早期DKD的診斷價值

3 討 論

T1DM是一種代謝紊亂綜合征，與遺傳、免疫功能、環(huán)境因素等有關(guān)，長期血糖控制不佳，患者處于高血糖狀態(tài)，導(dǎo)致脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂，增加腎臟負擔，促進腎小球肥大和硬化，引起腎功能下降，血流動力學(xué)發(fā)生改變，最終發(fā)展為DKD[9-10]。DKD早期病理改變?yōu)榭赡嫘?，及時治療可延緩病情進展，甚至能夠逆轉(zhuǎn)損傷，一旦進入終末期，腎實質(zhì)性損害將無逆轉(zhuǎn)可能。臨床上常用微量白蛋白尿及腎功能指標診斷DKD早期病變，但早期UAER受飲食、血糖及運動等因素影響較大，且部分患者腎功能出現(xiàn)明顯下降，而微量白蛋白仍在正常范圍，Scr及BUN等指標很難反應(yīng)早期腎臟病變，因此，需尋找更為敏感的早期診斷指標。

炎癥反應(yīng)在DKD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，由代謝過剩引發(fā)的慢性低度炎癥狀態(tài)，是導(dǎo)致DM并發(fā)癥發(fā)生的主要機制之一，體外實驗及動物實驗均表明，慢性低度炎癥狀態(tài)與DKD發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。sICAM1是一種免疫球蛋白，廣泛分布于單核細胞、內(nèi)皮細胞等內(nèi)，通過與受體結(jié)合形成復(fù)合物，釋放各種物質(zhì)，在細胞與細胞以及細胞外基質(zhì)之間產(chǎn)生黏附作用，促進血管增生，引發(fā)DKD、糖尿病視網(wǎng)膜病變等DM并發(fā)癥[13]。TNF-α是主要促炎因子，通過受體TNFR1、TNFR2介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，對DKD的發(fā)生發(fā)揮病因?qū)W作用。TNFR1在機體各種細胞廣泛表達，與腎損傷關(guān)系密切，血清TNFR1濃度較高的T2DM患者發(fā)生ESRD風險明顯增加[14]。miRNA155參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，與DKD關(guān)系密切，Beltrami等[15]研究顯示，miRNA155在DKD患者中的表達是單純DM患者的1.8倍。本研究結(jié)果顯示，DKD組患者血清sICAM1、TNFR1、miRNA155較DM組明顯升高，提示sICAM1、TNFR1、miRNA155均與T1DM患者腎損傷有關(guān)。另外，本研究結(jié)果還顯示，DKD組hs-CRP水平升高，eGFR降低，提示hs-CRP、eGFR也是影響T1DM患者發(fā)生DKD的因素。hs-CRP是臨床炎癥標志物，其水平升高表明患者存在炎癥反應(yīng)，且在腎損傷早期已發(fā)生異常表達。部分DM患者微量尿白蛋白處于正常范圍時，eGFR已發(fā)生明顯下降，eGFR下降可反應(yīng)腎功能損傷程度和DKD進展程度。本研究經(jīng)Logistic回歸分析，結(jié)果顯示sICAM1、TNFR1、miRNA155、hs-CRP、eGFR均為DKD的影響因素，參與DKD發(fā)生發(fā)展過程。

本研究ROC結(jié)果顯示，血清sICAM1、TNFR1、miRNA155預(yù)測DKD的最佳截斷點分別為：303.16ng/mL、873.21pg/mL、4.65，三者單獨及聯(lián)合檢測用于診斷早期DKD的AUC分別為：0.762、0.749、0.756、0.835，提示三者均對DKD發(fā)生具有較高預(yù)測價值，且三者聯(lián)合檢測價值更高。sICAM1參與內(nèi)皮細胞及炎性細胞黏附作用，主要與腎小球血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)有關(guān)，可反應(yīng)炎癥情況和功能障礙，在多種炎癥性疾病中表達異常[16]。TNFR1參與TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，在T1DM患者早期損傷中，TNFR1與腎小球濾過率呈負相關(guān)，對早期腎損傷具有良好預(yù)測作用[17]。miRNA155參與腎間質(zhì)纖維化過程，在肥胖相關(guān)性腎病及急性腎損傷等多種腎功能障礙疾病中表達異常[18]。血清sICAM1、TNFR1、miRNA155均可在一定程度上反應(yīng)腎功能損傷程度，但存在特異性不足等局限性，本研究將3種指標聯(lián)合檢測后AUC可達0.835，因此，臨床對T1DM患者進行血清sICAM1、TNFR1、miRNA155檢測，有助于早期診斷DKD，及早采取干預(yù)措施，延緩疾病進展，改善預(yù)后。

綜上所述，血清sICAM1、TNFR1、miRNA155均是T1DM患者發(fā)生DKD的影響因素，采用三者聯(lián)合檢測對DKD早期診斷價值更高，有望成為臨床早期診斷DKD的可靠指標。另外，本研究尚存在研究時間相對較短及樣本量較小等不足，今后仍需擴大樣本量，進一步驗證結(jié)論可信度。