司馬學琴，孫元鵬

(湖北科技學院醫(yī)學部基礎醫(yī)學院，湖北 咸寧 437100)

結直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重影響患者的健康。在世界范圍內，中國雖然處于結直腸癌的低發(fā)區(qū)，但是，近年來隨著飲食結構及生活方式的改變，結直腸癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。

結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多步驟、多階段的復雜而連鎖的過程，涉及多個分子的相互作用以及不同基因在DNA和RNA水平上一過性或永久性的變化[2]。

鋅指蛋白750(zinc finger protein 750，ZNF750)是鋅指蛋白C2H2樣鋅指蛋白亞群的一員，其編碼基因位于染色體17q25.3，編碼蛋白質長度為723個氨基酸，其中5-58位氨基酸為C2H2樣結構域，可結合特異性DNA位點CCNNAGGC，702-723位氨基酸為其核定位信號，這兩個結構域是其發(fā)揮轉錄調控功能所必需的[3]。目前，對ZNF750基因的功能和機制研究較少，ZNF750在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉移中的作用及分子機制亦尚未明確。因此，本研究重點探討ZNF750基因在結直腸癌增殖中的可能作用及分子機制，旨在闡明ZNF750在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的主要生物學功能，為結直腸癌的早期診斷、干預和治療及預后奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結直腸癌細胞株SW620和LoVo購于中國科學院細胞典藏培養(yǎng)中心，ZNF750小分子干擾RNA由吉瑪基因公司合成。Gibco胎牛血清、1640培養(yǎng)基、Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)瞬時轉染試劑盒、cDNA逆轉錄試劑盒(MBI Fermentas公司)、熒光定量(qRT-PCR)試劑盒(MBI Fermentas公司)和碧云天MTT檢測試劑盒購于廣州威佳科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

人結直腸癌細胞株SW620、LoVo在1640培養(yǎng)基中輔以5%胎牛血清培養(yǎng)，置于細胞培養(yǎng)箱內。

1.2.2 細胞轉染

選取對數(shù)生長期的SW620和LoVo細胞，按照說明書，用Lipofectamine2000試劑、ZNF750 siRNA和Negative control轉染，分為ZNF750-SW620敲低組和NC-SW620對照組，ZNF750-LoVo敲低組和NC-LoVo對照組。

1.2.3 干擾RNA和引物的設計

見表1、表2。

表1 干擾RNA和陰性對照序列

表2 所選基因引物序列

1.2.4 實驗組和對照組細胞的RNA提取和逆轉錄反應

轉染48h后，選取生長良好的SW620和LoVo實驗組和對照組細胞，倒掉培養(yǎng)基后，用PBS緩沖液沖洗2次，加入1mL Trizol試劑，把裂解物移入DEPC處理過的1.5mL離心管，加入0.2mL氯仿，翻轉離心管，充分混合，在冰上靜置10min后，在高速離心機中，4℃ 12 000rpm離心15min，把上層液體析出至另一干凈離心管中，加入0.2mL異丙醇，將新的離心管在高速離心機4℃ 12 000rpm離心10min后，析出上清液，把管底的白色沉淀用DEPC水配置的75%乙醇和100%乙醇各洗滌1次，室溫自然干燥后，加入20μL DEPC水溶解，用分光光度計測量提取的RNA純度和濃度。按照逆轉錄試劑盒說明進行操作，1μg的總RNA加入逆轉錄試劑盒中的相應試劑，混勻后在PCR擴增儀中42℃ 60min、95℃ 5min、4℃ 5min后取出，置于-20℃冷凍保存。

1.2.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測ZNF750 siRNA干擾效率

按照熒光定量試劑盒說明書，把反轉錄合成的cDNA，分別按劑量加入SYBR Green染料和ZNF750上下游引物(表2)，以及SYBR Green染料和內參GAPDH上下游引物(表2)，勻速離心混合后，置于ABI7 000PCR儀器中分別擴增基因ZNF750和內參基因GAPDH，用采集到的熒光定量值(Ct值)進行相對定量分析，檢測SW620和LoVo細胞實驗組和對照組中ZNF750的相對表達量，基因相對表達量采用2-ΔΔCt值表示，每組數(shù)值需要測定3個復孔，檢測siRNA對ZNF750的干擾效率。

1.2.6 MTT檢測細胞增殖活性

選取處于對數(shù)生長期的細胞，PBS緩沖液沖洗2遍后，加入胰蛋白酶液消化，使細胞充分解離，把ZNF750敲低的SW620和LoVo細胞和對照組細胞大約以每孔1 000個/細胞的密度分別接種于96孔板中，每組設置3個復孔，加入培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。24、48、72h后取出，然后向每孔內加入配置好的20μL MTT溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，取出后再用PBS緩沖液沖洗，最后加入20μL的DMSO溶液，使用酶標儀在450nm波長處測定吸光值(OD值)。

1.2.7 平板克隆形成實驗

選取處于對數(shù)期增長的細胞，PBS緩沖液沖洗，用胰蛋白酶液消化，使細胞充分分散，接種200個細胞到6孔板中，每種細胞接種3孔，然后輕輕晃動培養(yǎng)板，使細胞均勻平鋪在培養(yǎng)板中，在細胞培養(yǎng)箱中孵育2周。當培養(yǎng)板中的細胞出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時，停止培養(yǎng)，倒掉培養(yǎng)基，用緩沖液PBS輕輕沖洗3次，在空氣中干燥后，再倒入1mL甲醇固定15min，然后又置于空氣中干燥，待干燥完全后，用Giemsa染液染色15min，最后用蒸餾水緩緩洗凈殘留染液，干燥后在光鏡下計算克隆數(shù)。

1.2.8 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測實驗組和對照組細胞KLF4的表達

采用熒光定量PCR分別測定ZNF750-SW620敲低組和NC-SW620對照組，ZNF750-LoVo敲低組和NC-LoVo對照組，KLF4基因和內參基因GAPDH的熒光定量值(Ct值)，檢測SW620和LoVo細胞實驗組和對照組中KLF4的相對表達量，基因相對表達量采用2-ΔΔCt值表示，每組數(shù)值需要測定3個復孔，分析ZNF750沉默后，KLF4表達是否會有差異。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 熒光定量PCR檢測ZNF750siRNA干擾效率

熒光定量PCR結果顯示：瞬時轉染ZNF750 siRNA后，ZNF750-SW620敲低組和NC-SW620對照組相比，ZNF750的mRNA表達水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；瞬時轉染ZNF750 siRNA后，ZNF750-LoVo敲低組和NC-LoVo對照組相比，ZNF750的mRNA表達水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；說明SW620和LoVo細胞ZNF750基因敲低成功，可以進一步開展后續(xù)實驗，詳見表3。

表3 ZNF750 siRNA轉染結直腸癌細胞株ZNF750mRNA的相對表達量

2.2 ZNF750沉默對結直腸癌細胞株SW620和LoVo增殖能力的影響

運用MTT法檢測ZNF750沉默后，結直腸癌細胞SW620和LoVo增殖能力的變化。選取ZNF750敲低成功的SW620和LoVo細胞繼續(xù)培養(yǎng)，MTT檢測24、48和72h的OD值發(fā)現(xiàn)，實驗組較對照組細胞增殖活性明顯增強，差異具有顯著性(P<0.01)，結果見表4和表5。表明敲低ZNF750的表達會增強結直腸癌細胞的體外增殖能力。

表4 ZNF750敲低對SW620細胞增殖活性的影響

表5 ZNF750敲低對LoVo細胞增殖活性的影響

2.3 ZNF750沉默對結直腸癌細胞株SW620和LoVo平板克隆形成能力的影響

平板克隆形成實驗結果顯示：ZNF750-SW620敲低組單個細胞增殖能力高于NC-SW620對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，結果見圖2；ZNF750-LoVo敲低組單個細胞增殖能力也高于NC-LoVo對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，結果見圖3。

與對照組相比，**P<0.01

與對照組相比，**P<0.01

2.4 ZNF750沉默后對結直腸癌細胞KLF4基因表達水平的影響

熒光定量PCR結果顯示：結直腸癌細胞SW620中ZNF750敲低成功后，KLF4的mRNA表達水平較對照組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結果見表6；結直腸癌細胞LoVo中ZNF750敲低成功后，KLF4的mRNA表達水平也較對照組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結果見表6。表明在結直腸癌細胞中，ZNF750的沉默會使KLF4的mRNA表達水平相應下降，ZNF750可能間接調控KLF4的表達。

表6 ZNF750 siRNA轉染結直腸癌細胞株KLF4 mRNA的相對表達量

3 討 論

ZNF750在大部分上皮組織如胎盤、胸腺、肺、前列腺、皮膚、角質形成細胞中有表達，在間質細胞如外周血白細胞、T細胞、成纖維細胞中沒有表達，說明ZNF750可能是上皮組織特異性表達的基因[4]。有研究[5]表明ZNF750在原發(fā)性食管癌中發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用，ZNF750基因的突變與失活導致食管鱗癌的發(fā)生和轉移，ZNF750低表達與喉鱗狀細胞癌TNM分期、淋巴結轉移及預后有關。也有文獻[6-7]報道ZNF750基因在結直腸癌組織中的表達水平明顯低于周圍正常組織，而且ZNF750低表達和不良預后相關。基于以上研究報道，我們運用小分子RNA沉默ZNF750在結直腸癌細胞中的表達，進一步探討ZNF750對結直腸癌增殖過程的影響，以及其是否調控核轉錄因子KLF4的表達參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

通過本實驗我們發(fā)現(xiàn)ZNF750對結直腸癌的增殖能力有顯著抑制作用，而且還參與調控KLF4的表達。有研究[8]表明，ZNF750在口腔鱗狀細胞癌中通過調控KLF4基因轉錄參與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展。這一研究結果與我們在結直腸癌的初步實驗相佐證，后續(xù)我們將運用Oncomine數(shù)據(jù)庫做生物信息學研究，進一步研究ZNF750通過哪種信號通路如何調控KLF4在結直腸癌中的表達，探索ZNF750在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的機制。