何彩林 石廷玉

[摘要]目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討半夏治療肺結(jié)核的活性成分、靶點及作用通路，為深入探討半夏治療肺結(jié)核的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。方法 借助TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索半夏的活性成分及潛在作用靶點;通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫得出肺結(jié)核相關(guān)作用靶點;運(yùn)用Venny2.1軟件制作藥物靶點與疾病靶點韋恩圖;利用Cytoscape3.7.2軟件及STRING數(shù)據(jù)庫繪制藥物與疾病共同靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及中藥-成分-疾病-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò);采用Metascape數(shù)據(jù)庫及bioinformatics軟件對藥物與疾病共同靶點進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析;并通過Cytoscape3.7.2軟件繪制成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果經(jīng)過篩選，半夏作用于肺結(jié)核主要通過黃芩素、卡維丁、β-豆甾醇、豆甾醇等有效成分，AKT1、TP53、VEGFA、PPARG、JUN等靶點基因，以及癌癥信號通路和TB通路。結(jié)論初步預(yù)測獲得半夏有效成分抗結(jié)核作用機(jī)制，相關(guān)活性成分與關(guān)鍵靶點以及作用通路的結(jié)合可能是其治療肺結(jié)核的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]半夏;肺結(jié)核;活性成分;關(guān)鍵靶點;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

[中圖分類號]R978.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]2095-0616（2022）12-0020-05

肺結(jié)核（pulmonary tuberculosis，PTB）是一種傳染性疾病，其癥狀有慢性咳痰、咯血、盜汗、疲勞和體重減輕;肺外表現(xiàn)包括淋巴結(jié)炎，腎臟、骨骼或關(guān)節(jié)受累，腦膜炎或播散性疾病[1]。咳嗽在病原體結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）的傳播中起關(guān)鍵作用[2]。痰中的MTB是主要傳播來源，因此其為全球結(jié)核?。╰uberculosis，TB）控制策略的重點[1]。據(jù)估計，世界上約有1/4的人口患有潛伏性結(jié)核病，其中5%～10%的感染者會發(fā)展為活動性結(jié)核病[3]。TB致死率位列傳染病第一，且耐藥性結(jié)核分枝桿菌（drug resistance mycobacterium tuberculosis，MDR-TB）的出現(xiàn)加劇問題的嚴(yán)重性[4-5]。MDR-TB對實現(xiàn)世界衛(wèi)生組織（WHO）到2030年終結(jié)結(jié)核病戰(zhàn)略的全球目標(biāo)構(gòu)成威脅[6-7]。因此，迫切需要新的有效藥物來應(yīng)對PTB。

《名醫(yī)別錄》載“半夏，......主消心腹胸中膈痰熱滿結(jié)，咳嗽上氣”，具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)的功效[8];化學(xué)成分有生物堿類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、蛋白質(zhì)類、黃酮類、糖類、氨基酸類、無機(jī)元素類及苯酚類等，有止咳、祛痰、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、維持免疫力的作用[9]。目前，半夏在治療PTB方面機(jī)制研究較少，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討半夏治療PTB的作用機(jī)制，以期為今后臨床應(yīng)用和研究提供新思路。

1資料與方法

1.1半夏活性成分篩選及潛在靶點預(yù)測

在TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選半夏活性成分，用Uniprot數(shù)據(jù)庫篩選活性成分對應(yīng)的作用靶基因[10]。

1.2肺結(jié)核靶點及“藥物-疾病”共同靶點采集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫搜索，輸入關(guān)鍵詞“pulmonary tuberculosis”，獲得疾病靶點[11]。應(yīng)用Venny2.1在線工具繪制韋恩圖。獲得半夏與PTB共同基因靶點。

1.3“疾病-藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將化合物-靶點和疾病-靶點的相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中進(jìn)行整合，生成疾病-藥物-活性成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖[12]。

1.4蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共同靶點基因傳至STRING數(shù)據(jù)庫中，其物種為“HomoSapiens”，去除離散的點，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2構(gòu)建半夏的PPI網(wǎng)絡(luò)圖[13]。

1.5基因本體論（gene ontology，GO）生物功能和京都基因與基因組百科全書（Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將半夏與PTB交集基因傳至Metascape數(shù)據(jù)庫[14]，進(jìn)行基因的GO生物功能和KEGG通路富集分析。根據(jù)P<0.05表示該富集結(jié)果具有顯著性;P值越小，其顯著性越高。并借助bioinformatics對結(jié)果可視化。

1.6構(gòu)建“成分-靶點-信號通路”結(jié)構(gòu)圖

參照Metascape數(shù)據(jù)庫中KEGG富集通路信息，設(shè)定P<0.05，篩選靠前的20條通路進(jìn)行整合，將核心靶點與信號通路上富集的靶點相互匹配，取其交集得到交集靶點，交集靶點與成分匹配后制作文檔。最后導(dǎo)入Cytoscape3.7.2繪制“成分-靶點-信號通路”結(jié)構(gòu)圖[15]。

2結(jié)果

2.1中藥活性成分及對應(yīng)靶點篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索半夏化學(xué)成分，并以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選條件，再在UniProt數(shù)據(jù)庫中找出化學(xué)成分對應(yīng)的靶基因名稱，物種限定為“Homo Sapiens”，獲得13個潛在活性成分，76個靶點。

2.2“藥物-疾病”共同靶點采集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫搜索，輸入關(guān)鍵詞“pulmonary tuberculosis”，匯總?cè)ブ睾螳@得PTB靶點1068個。將藥物靶點與疾病靶點對應(yīng)，應(yīng)用Venny2.1在線工具繪制韋恩圖（圖1）。通過繪制韋恩圖獲得半夏與PTB的共同基因靶點29個。

將半夏的活性成分及作用靶點輸入Cytoscape3.7.2，構(gòu)建活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將藥物和疾病相映射得到的29個交集基因在STRING平臺進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，去除孤立點，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2得到PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3），顯示AKT1、TP53、VEGFA、PPARG、JUN連接度值顯著高于其余靶點，AKT1的節(jié)點最大，可能是半夏治療PTB最主要的潛在靶點。

2.5GO和KEGG分析

GO生物功能富集分析，主要包括生物過程、分子功能、細(xì)胞成分。共獲得P值小于0.05的GO功能條目376條，其中生物過程包括對無機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡信號通路、氧化應(yīng)激等604條，細(xì)胞組分包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、細(xì)胞器外膜等15條。分子功能包括蛋白體的活動、蛋白域特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等47條。根據(jù)P值前20條信號通路進(jìn)行KEGG富集分析并繪制氣泡圖（圖4），結(jié)果顯示，其顯著富集在癌癥信號通路（pathways in cancer）、TB、乙型肝炎（hepatitisB）、細(xì)胞凋亡（apoptosis）和麻疹（measles）等信號通路。

用29個核心靶點和KEGG根據(jù)P值得到的前20條信號通路，導(dǎo)入CytoScape3.7.2軟件創(chuàng)建“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。反映出黃芩素、卡維丁、松柏素、β-豆甾醇、豆甾醇5個成分最為重要。

3結(jié)論

在TB中咳嗽既是一種癥狀，也是一種疾病傳播方式，人類的先天咳嗽反射和后天咳嗽行為可能受到MTB和TB的影響[2]。《十藥神書》記載半夏用來治療咳嗽痰多[16]。研究發(fā)現(xiàn)半夏中生物堿有鎮(zhèn)咳作用，其總游離有機(jī)酸能夠鎮(zhèn)咳祛痰[17]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以PTB為目標(biāo)疾病，篩選半夏抗結(jié)核的作用靶點、活性成分以及相關(guān)通路。預(yù)測的作用靶點中AKT1、TP53、VEGFA、PPARG、JUN等靶點基因可能是半夏治療PTB的主要靶點。通過分析發(fā)現(xiàn)，半夏活性成分中有5個成分可能具有抗結(jié)核效果，其中黃芩素、卡維丁、松柏素、β-豆甾醇、豆甾醇等成分對應(yīng)的相關(guān)靶點個數(shù)較多，提示這些成分可能是半夏發(fā)揮作用的重要成分，并為半夏抗結(jié)核作用提供了理論依據(jù)。

PTB涉及多種病理過程如纖維化、肺炎、肝臟疾病等[18]。另外，有研究表明PTB和肺癌具有相關(guān)性[19]。AKT1的抑制可誘導(dǎo)吞噬體成熟為吞噬溶酶體，從而殺死細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，與PTB易感性有關(guān)，因此，AKT1抑制劑有望作為抗生素用于治療TB，尤其是MDR-TB[20]。TP53基因的突變是包括肺癌在內(nèi)的人類癌癥中檢測到的五種突變之一，其在肺上皮細(xì)胞的致癌轉(zhuǎn)化和肺癌進(jìn)展中都起著重要作用，TP53的高突變率使其基因改變成為非常有吸引力的潛在治療靶點[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA的高表達(dá)為MTB的持續(xù)存在創(chuàng)造了最舒適的條件，因此，可使用針對VEGFA阻斷的靶向治療[23]。PPARG的上調(diào)已被證明會增加幾種人類癌癥的化學(xué)敏感性[24]。纖維化通常發(fā)生在TB治療期間，研究表明黃芩素可抑制不同組織器官纖維化的發(fā)生和發(fā)展，且有望被批準(zhǔn)為特定的抗纖維化藥物[25-26]。因此，黃芩素作為抗結(jié)核藥物還可以改善或治療PTB導(dǎo)致的纖維化、肺癌等癥狀。

綜上所述，半夏主要通過黃芩素、卡維丁、β-豆甾醇、豆甾醇等有效成分，AKT1、TP53、VEGFA、PPARG、JUN等靶點基因，以及癌癥信號通路和TB通路等發(fā)揮抗結(jié)核作用。本研究為今后更深一步探索半夏抗結(jié)核活性成分治療PTB的作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)并提供了有益的思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Acharya B，Acharya A，Gautam S，et al.Advances in diagnosis of Tuberculosis： an update into molecular diagnosis of Mycobacterium tuberculosis[J].Mol Biol Rep，2020，47（5）：4065-4075.

[2] Turner RD.Cough in pulmonary tuberculosis： Existing knowledge and general insights[J].Pulm Pharmacol Ther， 2019，55：89-94.

[3] Jeon D.Latent tuberculosis infection： recent progress and challenges in South Korea[J].Korean J Intern Med， 2020，35（2）：269-275.

[4]陳曉博，李俊.抗結(jié)核藥物靶點的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J].自然雜志，2021，43（5）：335-342.

[5] Fatima S，Kumari A，Das G，et al.Tuberculosis vaccine： A journey from BCG to present[J].Life Sci， 2020，252：117594.

[6] Guo Z，Xiao D，Wang X，et al.Epidemiological characteristics of pulmonary tuberculosis in mainland China from 2004 to 2015： a model-based analysis[J]. BMC Public Health，2019，19（1）：219.

[7] Cocozza AM，Linh NN，Jaramillo E.Is effective patient support missing in the global response to multidrug- resistant tuberculosis？[J].Int J Tuberc Lung Dis，2020， 24（6）：626-630.

[8]魏康康，杜金行，常江夢，等.仲景半夏用法初探[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，39（2）：155-157.

[9]王恒，于淼，李偉楠，等.半夏化學(xué)成分及抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2021，27（8）：49-52.

[10]王康，孟泳，王玉潔，等.蒼耳子治療過敏性鼻炎的分子機(jī)制研究[J].轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志，2021，10（5）：330-334.

[11]劉艷霞，任明輝，杜寶中.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的白頭翁治療肺結(jié)核作用機(jī)制研究[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2021，28（27）：4-9.

[12]張海東，曲妮妮.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析七味都?xì)馔柚委熉宰枞苑渭膊〉淖饔脵C(jī)制[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2021，30（32）：3594-3601.

[13]劉莉，王鳳云，王卓，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討貓爪草異病同治的作用機(jī)制[J].廣東藥科大學(xué)學(xué)報，2021，37（5）：78-84.

[14]王佳俊，陳青垚，王建，等.基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究含黃連方劑治療潰瘍性結(jié)腸炎的配伍規(guī)律及作用機(jī)制[J].中草藥，2021，52（19）：5984-5995.

[15]張愿，謝紅艷，田苑，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討穿心蓮治療新型冠狀病毒肺炎機(jī)制研究[J].四川中醫(yī)，2021，39（9）：56-61.

[16]陳修園，趙正山.十藥神書注解[M].福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，1982：18-25.

[17]鄭冬寧，趙朝旭，江瑩，等.半夏藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展[J].大眾標(biāo)準(zhǔn)化，2021（24）：13-15.

[18] Kang W，Du J，Yang S，et al.The prevalence and risks of major comorbidities among inpatients with pulmonary tuberculosis in China from a gender and age perspective： a large-scale multicenter observational study[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2021，40（4）：787-800.

[19] Molina-RomeroC，ArrietaO，Hernández-PandoR. Tuberculosis and lung cancer[J].Salud Publica Mex， 2019，61（3）：286-291.

[20] Wang X，Cao Z，Jiang J，et al.AKT1 polymorphisms are associated with tuberculosis in the Chinese population[J]. Int J Immunogenet，2010，37（2）：97-101.

[21] Smardova J，Liskova K，Ravcukova B，et al.Complex analysis of the p53 tumor suppressor in lung carcinoma[J]. Oncol Rep，2016，35（3）：1859-1867.

[22] Long J，Wang A，Bai Y，et al.Development and validation of a TP53-associated immune prognostic model for hepatocellular carcinoma[J].EBioMedicine，2019，42：363-374.

[23] Golubinskaya EP，F(xiàn)ilonenko TG，Kramar TV，et al. Dysregulation of VEGF-dependent angiogenesis in cavernous lung tuberculosis[J].Pathophysiology， 2019，26（3-4）：381-387.

[24] Lian M，Chen J，Shen X，et al.Pparg may Promote Chemosensitivity of Hypopharyngeal Squamous Cell Carcinoma[J].PPAR Res，2020，2020：6452182.

[25] Evans S，Butler JR，Mattila JT，et al.Systems biology predicts that fibrosis in tuberculous granulomas may arise through macrophage-to-myofibroblast transformation[J]. PLoS Comput Biol，2020，16（12）：e1008520.

[26]朱慶均.黃芩苷與黃芩素治療纖維化疾病研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2017，42（7）：1271-1276.

（收稿日期：2022-01-10）