冉 黎，呂錦詩，張 浩，王 永，朱江江，李艷艷，孟慶勇，林亞秋

(1.青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部、四川省重點實驗室，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京 100193)

肌內(nèi)脂肪(Intramuscular adipocytes，IMF)含量對動物的肉品質(zhì)和口感都有巨大影響[1]。動物脂肪細(xì)胞分化會造成脂肪沉積，而脂肪沉積又由甘油三酯(TG)和脂肪酸轉(zhuǎn)運速度決定[2]。研究表明，IMF含量的變化主要通過甘油三酯的調(diào)節(jié)[3]。目前已有研究證明，載脂蛋白C3(Apolipoprontien C3，APOC3)已被確定為TG、殘余膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的重要調(diào)控因子[4-5]?；诖?，APOC3有望成為改善山羊IMF的候選基因。

APOC3基因位于APOA/C3/A4基因簇上，大部分在肝臟中合成，少部分在腸道合成[6]。其主要分布在乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的表面[7]。最新有研究發(fā)現(xiàn)，APOC3的表達(dá)可影響HDL結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而選擇性地激活棕色脂肪組織 (BAT)代謝活動[8]。APOC3還可通過影響GPIHBP1與脂蛋白酶(LPL)結(jié)合的活力來抑制甘油三酯水解[9]。徐聰[10]研究發(fā)現(xiàn)，APOC3的轉(zhuǎn)基因小鼠的效應(yīng)T細(xì)胞會增加對葡萄糖和游離脂肪酸攝取量，導(dǎo)致脂肪酸的合成水平增加。盧瑤瑤[11]敲除家兔APOC3基因后，發(fā)現(xiàn)家兔血漿中的脂質(zhì)水平顯著降低。姚瑤等[12]通過在小鼠上高表達(dá)APOC3，發(fā)現(xiàn)小鼠血液中的脂質(zhì)水平和膽固醇水平顯著高于普通小鼠?；萱替玫萚13]通過對比可樂豬、貴州白香豬和大約克豬脂肪中APOC3的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，APOC3基因的mRNA表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪沉積量呈正相關(guān)。綜合以上報道顯示，APOC3參與動物脂質(zhì)代謝過程，但是尚未見該基因在山羊脂肪細(xì)胞分化中的研究報道。

因此，本研究首先利用RT-PCR技術(shù)克隆山羊APOC3基因序列，利用實時熒光定量技術(shù)(qPCR)檢測山羊APOC3基因在心臟、肝臟、脾臟等14個組織和脂肪細(xì)胞分化0～120 h中的表達(dá)情況，獲得其組織和細(xì)胞表達(dá)譜。利用雙酶切法構(gòu)建山羊pcDNA3.1-APOC3過表達(dá)載體使其在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞過表達(dá)，利用形態(tài)學(xué)明確過表達(dá)APOC3后脂肪細(xì)胞中的脂滴積聚情況，同時檢測脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)情況對其發(fā)揮作用途徑進(jìn)行分析。研究結(jié)果可為闡明山羊APOC3基因調(diào)控肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的作用機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為構(gòu)建肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采集健康簡州大耳羊(n=3)的14個組織樣本，用DEPC水去酶處理過后的錫箔紙包裹，放入RNasefree凍存管中，標(biāo)記組織名稱，保存于液態(tài)氮中。山羊原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞由山羊脂肪代謝實驗室前期分離保存。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、XbaⅠ反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、Opti-MEM、Lipofectmine RNAIMAX Reagent 購自Thermo公司；雙抗、PBS、opti-MEM、胰蛋白酶均購自Hyclone公司；油酸購自Sigma公司；胰蛋白酶、PBS和DEME/F12培養(yǎng)基購自Gemini公司；胚胎牛血清購自Gemini公司，pcDNA3.1由西北農(nóng)業(yè)科技大學(xué)贈予。

1.3 試驗方法

1.3.1 山羊APOC3基因克隆和生物學(xué)分析 根據(jù)GenBank上山羊APOC3基因預(yù)測序列(XP_005689540.1)，使用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物(表1)。取簡州大耳羊的背最長肌組織cDNA為模板，擴增得到山羊APOC3基因。通過凝膠電泳分離出APOC3的條帶，利用DNA回收試劑盒進(jìn)行回收純化，純化產(chǎn)物連接至pMD-19T載體并轉(zhuǎn)染大腸桿菌中，氨芐青霉素以100 mg/mL濃度加入培養(yǎng)基中，待凝固以后將大腸桿菌菌液均勻涂至平板，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)10～12 h后，挑取陽性菌落進(jìn)行菌落PCR，篩選與目的條帶一致的送至公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果采用線性工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析(表2)。

表1 PCR和實時熒光定量PCR(qPCR)引物信息Tab.1 Primers information for PCR and quantitative real-time PCR(qPCR)

表2 山羊APOC3生物信息的方法Tab.2 Method of goat APOC3 biological information

1.3.2 山羊APOC3基因組織和時序表達(dá) 以TBP基因作為組織內(nèi)參基因，UXT作為細(xì)胞內(nèi)參基因(表1)，采用qPCR方法檢測APOC3基因在上述反轉(zhuǎn)錄出來的山羊14個組織的表達(dá)量(心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、瘤胃、皮下脂肪、腹部脂肪、臂三頭肌、胰、背最長肌、股二頭肌、大腸、小腸)。取液氮保存的原代肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，37 ℃恒溫融化后進(jìn)行復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)，F(xiàn)3中的細(xì)胞生長到90%進(jìn)行誘導(dǎo)分化，在0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120 h的時間段用胰酶消化細(xì)胞于1.5 mL的EP管中，凍存-80 ℃ 2 d后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.3 山羊pcDNA3.1-APOC3重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用Primer Premier 5.0軟件在山羊APOC3的CDS區(qū)的3′端和5′端設(shè)計引物，再加上KpnⅠ和XbaⅠ的核苷酸序列和保護(hù)堿基，以pMD-19T-APOC3質(zhì)粒為模板，經(jīng)過PCR擴增得到片段進(jìn)行回收，并用紫外分光光度計測膠回收濃度，隨后進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物純化，用T4連接酶連接10 h以后轉(zhuǎn)化至DH5α中擴大培養(yǎng)，與上述的1.3.1的方法類似，37 ℃恒溫培養(yǎng)10 h，挑取陽性菌進(jìn)行測序，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-APOC3。過表達(dá)序列信息如下：APOC3-S：5′-GGGGTACCATGCAGCCCCGGCTACTCC-3′，KpnⅠ酶切位點GGTACC；APOC3-A：5′-GCTCTAGATCAGGCGGCCTCAGGACTG-3′，XbaⅠ酶切位點TCTAGA。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 取本實驗室前期凍存的山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，當(dāng)F3細(xì)胞融合度為80%時，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。每孔加入4 μL的轉(zhuǎn)染試劑和200 μL的Opti-MEM，試驗組加入pcDNA3.1-APOC3(OEAPOC3)，對照組加入pcDNA3.1空載(Negative control)，輕微搖勻并在室溫條件下孵化5 min[14]。轉(zhuǎn)染13 h后，更換50 nm/L油酸誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)分化48 h后收集細(xì)胞于管中，凍存于-80 ℃冰箱用于提取RNA。每個處理組設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.5 油紅O染色 利用油紅O染色法[15]觀察過表達(dá)APOC3后山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化過程中脂滴聚集的情況。用PBS緩沖液清洗之后甲醛固定細(xì)胞至少30 min，油紅O染料的原液按照3∶2的配比與蒸餾水稀釋，過濾，進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

組織表達(dá)與細(xì)胞時序表達(dá)分別選擇TBP和UXT作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析組織表達(dá)、時序表達(dá)和過表達(dá)的數(shù)據(jù)。利用SPSS 18.0中單因素方差分析中的LSD法與Duncan法對組織表達(dá)和時序表達(dá)進(jìn)行差異性分析，并用GraphPad Prism 5繪制圖譜。NC對照組與OE試驗組采用雙樣本t-檢驗進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊APOC3基因的克隆、序列分析及生物信息學(xué)分析

本試驗利用RT-PCR擴增并克隆得到山羊APOC3基因序列，PCR產(chǎn)物大小通過電泳法檢驗(圖 1)。測序后獲得山羊APOC3基因序列370 bp，其中包括完整的 ORF 294 bp，編碼97個氨基酸，5′UTR序列43 bp和 3′UTR 序列33 bp(登錄號MZ043723)，山羊APOC3蛋白質(zhì)分子式為C482H749N121O152S3，分子質(zhì)量是10.767 15 ku，在氨基酸組成中，絲氨酸(Ser)含量最高，占13.4%；正負(fù)電的氨基酸殘基比小于1，表明山羊蛋白可能帶負(fù)電荷；理論等電點(Protein isoelectric point，pI)為4.85，親水性總平均值為-0.351，不穩(wěn)定指數(shù)為43.20。由在線軟件Conserved Domain預(yù)測的功能結(jié)構(gòu)域區(qū)第23—88個氨基酸處。通過在線工具NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0得到，山羊APOC3蛋白序列的修飾位點有18個(12個Ser，4個Thr，2個Tyr)。有3個O-糖基化位點和4個N-糖基化位點。在線工具TMHMM預(yù)測發(fā)現(xiàn)，山羊APOC3蛋白質(zhì)無跨膜結(jié)構(gòu)域。Signal P4.1 Server預(yù)測結(jié)果顯示，在第23—24個氨基酸處有1個切割位點。以PSORT Ⅱprediction在線工具預(yù)測山羊APOC3蛋白大部分分布在細(xì)胞質(zhì)，少部分分布在線粒體和細(xì)胞核。

A：M.DL2000 Marker;1.APOC3基因。B：橫線.克隆的引物;橙色字體.蛋白質(zhì)磷酸化位點;方框.功能結(jié)構(gòu)域;橢圓形.信號肽切割位點;ATG.起始密碼子;*.終止密碼子。A：M.DL2000 Marker;1.APOC3 gene.B：The horizontal line.The cloned primer;The orange font.Protein phosphorylation sites;Boxes.Simple domains;The ellipse.The signal peptide cleavage site;ATG.The starting codon;*.Stop codon.

2.2 山羊APOC3蛋白二級結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

用SOPAM預(yù)測山羊APOC3蛋白的二級結(jié)構(gòu)，有77(79.38%)個氨基酸可能形成α-螺旋結(jié)構(gòu)(圖2-A)。利用 NCBI 中 Blast 分析模塊，對犬類、鯨類、靈長類動物和反芻動物的APOC3基因的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源比對(圖2-B)。然后利用 MEGA 5.0 軟件根據(jù)各種動物的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，聚類結(jié)果與同源性比對結(jié)果一致，如圖，山羊與同為反芻動物的綿羊、水牛和野牦牛聚為一類，符合親緣關(guān)系(圖2-C)。

A.山羊APOC3蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；B.山羊APOC3的氨基酸序列與其他物種間的同源性；C.APOC3氨基酸序列物種進(jìn)化樹。A. Secondary structure prediction of APOC3 protein in goat；B.The amino acid sequence of goat APOC3 was homologous with other species；C.APOC3 amino acid sequence species evolutionary tree.

2.3 山羊APOC3基因組織和時序表達(dá)模式

山羊APOC3基因在山羊的肝臟中的表達(dá)量極顯著高于其他所有組織(P<0.01)(圖3-A)，瘤胃、皮下脂肪、腹部脂肪、小腸的表達(dá)量也較高。山羊APOC3基因在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)趨勢是呈上升后下降的趨勢，且在誘導(dǎo)分化48 h的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平最高，極顯著高于未分化的前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平(P<0.01)(圖3-B)。

A.以肺臟表達(dá)水平作為對照，TBP作為內(nèi)參基因；B.以0 d表達(dá)水平作為對照，UXT作為內(nèi)參基因。不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。A.The lung expression level was used as the control，TBP as the internal reference gene；B.The expression level of 0 d was used as control，UXT as an internal reference gene.Different letters have extremely significant differences(P < 0.01).

2.4 山羊APOC3對肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的影響

2.4.1 過表達(dá)效率檢測及形態(tài)學(xué)觀察 pcDNA3.1作為對照組和pcDNA3.1-APOC3轉(zhuǎn)染至肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，利用qPCR技術(shù)檢測APOC3過表達(dá)后，與對照組相比，試驗組的APOC3基因表達(dá)水平上升1 118.24倍(P<0.01)(圖4-A)。光學(xué)顯微鏡下觀察到油紅O染色的脂滴，放大200，400倍的NC對照組比同樣倍鏡下OE試驗組的脂滴小，數(shù)量少。說明轉(zhuǎn)染的過表達(dá)APOC3能夠促進(jìn)山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中的脂滴聚集(圖4-B、C)。

A.pcDNA3.1-APOC3載體在山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率；B、C.肌內(nèi)脂肪油紅O染色形態(tài)學(xué)觀察(200×和400×)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。A.Transfection efficiency of pcDNA3.1-APOC3 vector in goat intramuscular adipocytes；B，C.Morphological observation of intramuscular fat oil red O staining(200×and 400×)；Different uppercase indicate extremely significant difference(P<0.01).

2.4.2 過表達(dá)山羊APOC3對脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響 在山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中過表達(dá)APOC3后，脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因SREBP1、CEBPβ和PPARγ基因相對表達(dá)水平分別上調(diào)了7.53(P<0.01)，4.63(P<0.01)，1.46(P<0.05)，而Pref-1和LPL分別下調(diào)了0.79(P<0.05)，0.63(P<0.05)，CEBPα和AP2的變化差異不顯著(圖5)。

不同大寫字母表示對照組與試驗組差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示對照組與試驗組差異顯著( P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

APOC3是載脂蛋白C族中分子量較低、濃度最高的水溶性蛋白分子，參與心血管、動脈粥樣硬化、Ⅰ型糖尿病和高甘油三酯血癥等與脂質(zhì)代謝相關(guān)的疾病[16-19]。本研究克隆得到包含ORF 的山羊APOC3基因序列，編碼97個氨基酸。分析結(jié)果顯示，APOC3的α螺旋結(jié)構(gòu)所占比例最高，曹威榮[20]研究發(fā)現(xiàn)，α螺旋和無規(guī)卷曲是豬APOC3蛋白的主要元件，這與本研究的結(jié)果相似。以PSORT Ⅱ在線工具預(yù)測山羊APOC3蛋白的亞細(xì)胞定位主要是細(xì)胞質(zhì)，這與盧賢君等[21]的亞細(xì)胞定位豬APOC3的結(jié)果一致，說明APOC3主要是在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。同源性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山羊APOC3氨基酸序列與綿羊、水牛、野牦牛的同源性最高，而狗和白鼬，南象海豹和港海豹為同一分支，猴、人、小猩猩和大猩猩靈長類動物在同一分支，符合進(jìn)化規(guī)律。

為了明確山羊APOC3基因的表達(dá)規(guī)律，采用qPCR技術(shù)檢測山羊的組織表達(dá)特異性和誘導(dǎo)分化不同時間段的細(xì)胞表達(dá)的差異性。組織表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，該基因在山羊肝臟中存在較高表達(dá)。惠嫣婷等[13]研究表明，APOC3在豬的肝臟中的表達(dá)量最高，與本試驗結(jié)果完全一致?，F(xiàn)在已經(jīng)有研究證明，APOC3基因主要在肝臟和小腸中表達(dá)[8]，與本試驗結(jié)果相似。細(xì)胞表達(dá)譜結(jié)果顯示，山羊APOC3基因在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞成脂分化過程中的相對表達(dá)量總體趨勢是呈先上升再下降的趨勢，于48 h達(dá)到峰值，推測APOC3基因參與山羊肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控過程。

為了確定山羊APOC3基因?qū)?nèi)脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用，本研究在過表達(dá)APOC3后從形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂滴積聚增加，同時脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因SREBP1、CEBPβ和PPARγ的表達(dá)水平上調(diào)，而Pref-1相對表達(dá)水平顯著下降。SREBP1是編碼脂肪酸合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，對脂肪分化發(fā)揮重要作用[22-23]。目前有研究已經(jīng)證實；SREBP1可以直接結(jié)合到APOC3的啟動子區(qū)域，并且可以與APOC3協(xié)同促進(jìn)脂肪的沉積[24]。目前已知PPARγ是脂肪細(xì)胞成脂能力最強的基因[25]。CEBPβ可促進(jìn)3T3前脂肪細(xì)胞進(jìn)行終末分化，它還可以通過激活終末階段脂肪細(xì)胞的PPARγ基因來發(fā)揮作用[26]。研究發(fā)現(xiàn)，APOC3能吸附到LPL底物上面，阻礙LPL與底物的結(jié)合，從而導(dǎo)致LPL的表達(dá)水平降低，甘油三酯水解率會減慢[27-28]。Pref-1是抑制前脂肪細(xì)胞分化的因子[29]，可作為檢測的標(biāo)志基因?？傊?，本試驗結(jié)果表明，過表達(dá)山羊APOC3促進(jìn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化，但具體的調(diào)控機制還需要進(jìn)一步試驗來驗證。

本研究克隆得到山羊APOC3基因序列，其在肝臟中的表達(dá)量最高，在成脂誘導(dǎo)分化48 h表達(dá)水平極顯著高于前體脂肪細(xì)胞。過表達(dá)山羊APOC3促進(jìn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂滴積聚，分化標(biāo)志基因SREBP1、CEBPβ和PPARγ的表達(dá)水平上調(diào)，Pref-1的表達(dá)水平顯著下調(diào)。因此，山羊APOC3可能是通過調(diào)控SREBP1、CEBPβ、PPARγ和下調(diào)Pref-1表達(dá)水平促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。