陳 靜，胡 蓉，劉 勇，秦 藝，熊興華

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus，AACC，2n=38)作為全球重要的油料作物之一，在我國(guó)廣泛種植。在我國(guó)，油菜作為油料作物在生產(chǎn)中占有十分重要的位置，是我國(guó)第一大油料作物[1]。我國(guó)油菜產(chǎn)量大約占全世界總產(chǎn)值的1/3，油菜的種植面積和油菜產(chǎn)量都位居世界第一[2-3]。油菜種植面積占油料作物播種面積的1/2左右，油菜的產(chǎn)量占所有油料作物產(chǎn)量的2/5左右，但依舊不能滿足國(guó)民對(duì)食用油的巨大需求。為緩解國(guó)內(nèi)食用油的需求，60%左右的食用油需從國(guó)外進(jìn)口油脂或油料。我國(guó)南方實(shí)行稻稻油三熟制，以提高植物油的產(chǎn)量、保證植物油的安全[4]。在我國(guó)油菜的主產(chǎn)區(qū)多以種植半冬性油菜為主，其生育期較長(zhǎng)，與雙季稻的生育期存在沖突，因此，選育出開花早的早熟品種油菜能夠使油菜生育期縮短，對(duì)實(shí)行稻稻油三熟制起到至關(guān)重要的作用[5]。

適時(shí)開花以及花的形態(tài)發(fā)育不僅對(duì)甘藍(lán)型油菜的產(chǎn)量與品質(zhì)有重要影響，同時(shí)也決定了其對(duì)生態(tài)區(qū)域的適應(yīng)性，因此，植株開花的早晚以及花的形態(tài)發(fā)育是甘藍(lán)型油菜育種的重要目標(biāo)性狀[6-7]。油菜提前開花表明生育期會(huì)縮短，所以對(duì)甘藍(lán)型油菜開花基因的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究有助于油菜早熟品種的選育，為油菜開花期、成熟期的遺傳改良提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

FIL(FILAMENTOUS FLOWER)基因?qū)儆赮ABBY轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族中的一個(gè)子家族成員[8]，對(duì)其分生組織中心區(qū)域的非自主性影響是通過抑制分生組織的活性來調(diào)節(jié)的。在植物發(fā)育過程中，葉和花等側(cè)生器官是由分生組織中的奠基細(xì)胞(Founder cells)分化發(fā)育而成。細(xì)胞確定分化成各器官的命運(yùn)之后，側(cè)生器官原基的發(fā)育一直受到分生組織中至今未知的信號(hào)調(diào)控。例如，用解剖方法或者激光切除方法將葉原基從分生組織中分離，將會(huì)得到輻射狀對(duì)稱的遠(yuǎn)軸化的葉片，表明這種控制葉片近軸化發(fā)育的信號(hào)來自分生組織[9]。相反地，分生組織的活性受側(cè)生器官中的一個(gè)信號(hào)因子調(diào)控。有研究表明，擬南芥和金魚草中的YABBY基因參與這種信號(hào)的調(diào)控[10-11]。

在擬南芥中，擬南芥fil單突變體會(huì)導(dǎo)致花器官成細(xì)絲狀，以及花器官形態(tài)存在缺陷。Lugassi等[12]在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IL基因中存在一個(gè)fil-9突變體，該突變體導(dǎo)致花器官的數(shù)量和大小出現(xiàn)了高度變異，部分出現(xiàn)同源化以及花序組織出現(xiàn)缺陷。Douglas等[13]對(duì)fil-10抑制系的遺傳學(xué)和細(xì)胞學(xué)分析表明，F(xiàn)IL在促進(jìn)生長(zhǎng)方面的作用與它之前所描述的對(duì)分生組織特性和側(cè)枝器官極性的影響無關(guān)，轉(zhuǎn)錄譜分析表明，F(xiàn)IL下調(diào)了大量轉(zhuǎn)錄因子，而這些轉(zhuǎn)錄因子又從屬于花序結(jié)構(gòu)的調(diào)控部分。Chung等[14]探究生長(zhǎng)素反應(yīng)因子與多效基因之間的互作關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)與野生型擬南芥相比較，其他幾個(gè)突變體ettarf4、fil-8、filettarf4、filettarf4old和filettarf4NPA均出現(xiàn)了花序異常的現(xiàn)象，fil的突變體花序均呈現(xiàn)出絲狀結(jié)構(gòu)，無法完成正常的授粉過程，以至于會(huì)影響到植株后期的正常發(fā)育。Bonaccorso等[15]將擬南芥中的4個(gè)YABBY家族基因在酵母中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有FIL激活了報(bào)告基因。類似的分析表明，該基因是一種激活因子。同時(shí)有相關(guān)研究表明，F(xiàn)IL基因能夠?qū)﹂_花時(shí)間進(jìn)行調(diào)控，同時(shí)也可以維持和調(diào)控花序分生組織、花分生組織和花器官原生質(zhì)體的發(fā)育[16]。Tanaka等[17]發(fā)現(xiàn)，在擬南芥與水稻之間FIL/TOB基因的分支YABBY基因的功能可能被保守，以維持植株分生組織的正常功能。

目前，對(duì)FIL基因的研究主要集中在擬南芥和其他植物，甘藍(lán)型油菜BnaFIL基因的研究和報(bào)道還比較少，F(xiàn)IL基因在油菜中的具體作用還不夠明確。本研究通過克隆BnaFIL基因的啟動(dòng)子并構(gòu)建表達(dá)載體，將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步研究甘藍(lán)型油菜BnaFIL基因功能提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的12份甘藍(lán)型油菜包括6份早花材料、6份晚花材料，均由國(guó)家油料改良中心湖南分中心提供。野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101菌株及植物表達(dá)載體pBI121均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

限制性內(nèi)切酶ScaⅠ、BamHⅠ、DL2000 DNA Marker、Trans 5k DNA Marker、抗生素、dNTP、高保真聚合酶等購(gòu)自北京全式金；pUCm-T克隆載體、T4DNA連接酶、DNA質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、利福平抗生素、卡那霉素、GUS染色劑、瓊脂糖等購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物合成和測(cè)序由湖南擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 甘藍(lán)型油菜BnaFIL基因啟動(dòng)子克隆及分析

在TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)中查找到擬南芥AtFIL基因的ID(AT2G45190)，用擬南芥AtFIL基因的ID在Brassica Database數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast，得到甘藍(lán)型油菜中BnaFIL基因上游的大約1 300 bp序列信息，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，分別命名為BnaFIL-P-F和BnaFIL-P-R(表1)。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequences

以甘藍(lán)型油菜葉片中提取的DNA為模板，用BnaFIL-P-F和BnaFIL-P-R特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板1 μL(1 054.2 ng/μL)，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，上游引物1 μL(10 μmol/L)，下游引物1 μL(10 μmol/L)，10×TransTaq HiFi Buffer 5 μL，TransTaq HiFi DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 37 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，采用膠回收試劑盒對(duì)pBnaFIL片段進(jìn)行回收，回收后的目的片段利用T4DNA連接酶連接到pUCm-T克隆載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)。經(jīng)菌落PCR鑒定后送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare)在線分析軟件對(duì)序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)。

1.3 表達(dá)載體構(gòu)建

將帶pBnaFIL片段的菌種進(jìn)行擴(kuò)繁并提取質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為模板，在原有的啟動(dòng)子擴(kuò)增引物上加入限制性內(nèi)切酶ScaⅠ、BamHⅠ的酶切位點(diǎn)(表1中加粗字母)以及相應(yīng)的保護(hù)堿基對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板1 μL(1 054.2 ng/μL)，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，上游引物1 μL(10 μmol/L)，下游引物1 μL，10×TransTaq HiFi Buffer 5 μL，TransTaq HiFi DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 37 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，采用膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收，回收后的目的片段利用T4DNA連接酶連接到pUCm-T克隆載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)。經(jīng)菌落PCR鑒定后提取質(zhì)粒，同時(shí)對(duì)pBI121載體質(zhì)粒進(jìn)行提取。

分別用內(nèi)切酶FlyCutScaⅠ和FlyCutBamH Ⅰ對(duì)目的片段質(zhì)粒和pBI121載體進(jìn)行雙酶切，酶切體系(50 μL)：質(zhì)粒10 μL(986.71 mg/μL)，F(xiàn)lyCutScaⅠ1 μL，F(xiàn)lyCutBamHⅠ1 μL，10×FlyCut Buffer 5 μL，ddH2O 33 μL。37 ℃孵育3 h，終止反應(yīng)時(shí)80 ℃加熱20 min。回收酶切后的目的片段，用pBnaFIL啟動(dòng)子替換pBI121載體上的CaMV35S啟動(dòng)子，采用T4DNA連接酶構(gòu)建pBnaFIL-GUS表達(dá)載體。將重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，在含有卡那霉素(50 mg/mL)的LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，提取陽(yáng)性菌株的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

采用凍融法將pBnaFIL-GUS表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，將其涂布在含有卡那霉素(50 mg/mL)和利福平(25 mg/mL)的YEB培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物如表1所示，陽(yáng)性菌落保存于-80 ℃。

1.4 啟動(dòng)子表達(dá)分析

1.4.1 野生型擬南芥的種植 擬南芥種子消毒：取適量野生型擬南芥種子(不超過50 μL)放入1.5 mL/2.0 mL離心管中，加入75%的酒精1 mL渦旋1 min，用滅菌水清洗1次，加入10%的次氯酸鈉1 mL，期間不斷振蕩消毒10 min，最后用滅菌水清洗6～7次。在洗好的種子中加入0.1%瓊脂糖水1 mL混勻，將混勻的種子均勻鋪灑在1/2 MS培養(yǎng)基上，密封后置于4 ℃冰箱春化2～3 d。

擬南芥的培養(yǎng)：將春化后的種子放置于植物生長(zhǎng)培養(yǎng)箱，溫度設(shè)置在22～24 ℃，光周期設(shè)置在16～18 h，光照強(qiáng)度2 000 lx，以保證擬南芥正常生長(zhǎng)。培養(yǎng)7 d左右將野生型擬南芥幼苗移栽至人工土生長(zhǎng)，每天觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，7 d澆一次水，每次都將土完全澆透。移栽后1個(gè)月植株開始抽薹，將抽薹出的第1個(gè)花序從基部剪去，以便長(zhǎng)出更多分枝。待分枝花序長(zhǎng)至茂盛就可以進(jìn)行花序浸染。

1.4.2 農(nóng)桿菌菌液準(zhǔn)備 將含有重組質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌菌株接種到含有卡那霉素(50 mg/mL)和利福平抗生素(25 mg/mL)的YEB培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)2 d。挑取單菌落于5 mL含有卡那霉素(50 mg/mL)和利福平抗生素(25 mg/mL)的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃暗環(huán)境振蕩48 h。按照1∶50的比例吸取1 mL的菌液至50 mL含有卡那霉素和利福平抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液 OD600=1.8～2.0時(shí)，6 000 r/min離心10 min收集菌體。在菌體中加入100 mL浸染緩沖液，振蕩混勻使菌體充分懸浮在緩沖液中。

1.4.3 擬南芥花序浸染 將培養(yǎng)好的野生型擬南芥剪去花序上已結(jié)的角果，前一天晚上將野生型擬南芥澆水浸透。次日，將花序浸入提前配好的浸染液中1 min左右，為保持濕度每株擬南芥都套上袋子，置于暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，再將其置于光照培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。第1次浸染后的第5天再次對(duì)植株進(jìn)行浸染，共浸染2次。收取種子經(jīng)過多代抗性篩選直至直系純合，對(duì)純合植株進(jìn)行GUS染色。

1.4.4 GUS染色 用DMSO將X-Gluc配成20 mmol/L的母液，每管50 μL分裝，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。然后稱取Na2HPO4·12H2O 17.9 g，NaH2PO4·2H2O 7.8 g，Na2EDTA 3.72 g，鐵氰化鉀0.165 g，亞鐵氰化鉀0.221 g，Trition-100 1 mL配成1 L X-Gluc基液(50 mmol/L PBS pH=7.0)。GUS染色液由50 μL X-Gluc母液和450 μL X-Gluc基液組成。脫色液由冰醋酸和無水乙醇3∶1混合組成。

將準(zhǔn)備好的材料于GUS染色液中浸泡，25～37 ℃保溫過夜。所有綠色材料在75%酒精中脫色2～3次，直至陰性對(duì)照呈白色。肉眼觀察或顯微鏡下觀察，白色背景上出現(xiàn)藍(lán)色小點(diǎn)區(qū)域即為GUS的表達(dá)位點(diǎn)。利用體視顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1BnaFIL基因啟動(dòng)子的克隆與順式作用元件預(yù)測(cè)

根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的甘藍(lán)型油菜BnaFIL基因的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異性引物，以含有全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得1 326 bp的啟動(dòng)子序列(圖1)。通過T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得pT-Promoter克隆載體。對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，在早花材料與晚花材料啟動(dòng)子之間存在SNP位點(diǎn)，1號(hào)位點(diǎn)早花材料為A堿基，晚花材料為G堿基，2號(hào)位點(diǎn)早花材料為C堿基，晚花材料為T堿基，且其他堿基基本一致(圖2)。利用PlantCARE軟件對(duì)啟動(dòng)序列進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，該序列上包含多種順式作用元件(表2)，包括參與光響應(yīng)的部分保守DNA模塊、核心啟動(dòng)子必備元件TATA-BOX和CAAT-BOX等，大部分元件都位于啟動(dòng)子1—500 bp(圖2)，由此可以推斷，啟動(dòng)子的主要功能區(qū)位于1—500 bp。

1.晚花材料；2.早花材料；M.DL2000 Marker。圖3同。1.Late flower material；2.Early flower material；M.DL2000 Marker.The same as Fig.3.

1，2.SNP位點(diǎn)。1，2.SNP sites.

表2 啟動(dòng)子元件Tab.2 Promoter elements

2.2BnaFIL基因啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建

早花材料與晚花材料經(jīng)過序列比對(duì)和順式作用元件分析，在早花材料和晚花材料中各選取1個(gè)材料啟動(dòng)子序列進(jìn)行啟動(dòng)子的表達(dá)載體構(gòu)建。采用表1中含有酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的引物ScaⅠ-P-F/BamHⅠ-P-R對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行克隆，使擴(kuò)增得到的片段帶有酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基方便后續(xù)的酶切，擴(kuò)增得到的目的條帶為1 344 bp(圖3)。將PCR擴(kuò)增得到的目的條帶進(jìn)行膠回收后連接pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，經(jīng)過菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性菌落，搖菌提質(zhì)粒，質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

圖3 啟動(dòng)子擴(kuò)增Fig.3 Promoter amplification

對(duì)啟動(dòng)子質(zhì)粒用內(nèi)切酶FlyCutScaⅠ和FlyCutBamHⅠ進(jìn)行雙酶切，回收目的片段連接至同樣用內(nèi)切酶FlyCutScaⅠ和FlyCutBamHⅠ進(jìn)行雙酶切切除CaMV35S啟動(dòng)子的pBI121載體(含GUS表達(dá)基因)回收的大片段上，經(jīng)T4連接酶連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)保存(圖4)。從大腸桿菌中提取陽(yáng)性質(zhì)粒，經(jīng)內(nèi)切酶FlyCutScaⅠ和FlyCutBamHⅠ雙酶切電泳檢測(cè)，得到目的片段和pBI121載體片段證明pBnaFIL-pBI121植物表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖5)。

圖4 植物表達(dá)載體構(gòu)建過程Fig.4 Flow chart for construction of the plant expression vector

1.晚花材料重組質(zhì)粒；2.早花材料重組質(zhì)粒；M.Trans 5k DNA Marker。1.Recombinant plasmid of late flowering material；2.Recombinant plasmid of early flower material；M.Trans 5k DNA Marker.

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，擴(kuò)增出一條878 bp的目的條帶(圖6)，表明BnaFIL啟動(dòng)子雙元表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

A.轉(zhuǎn)早花啟動(dòng)子菌落PCR；B.轉(zhuǎn)晚花啟動(dòng)子菌落PCR；M.DL2000 Marker。A.Transforming early flowering promoter colony PCR；B.Transforming late flowering promoter colony PCR；M.DL2000 Marker.

2.3BnaFIL基因啟動(dòng)子表達(dá)分析

將含有重組質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌采用花序浸染法轉(zhuǎn)化至野生型擬南芥植株中，轉(zhuǎn)化植株置于植物生長(zhǎng)培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)至收獲到T0種子。將T0種子消毒后播撒在含有卡那霉素抗性的1/2 MS培養(yǎng)基上篩選出陽(yáng)性植株。在篩選過程中陽(yáng)性幼苗表現(xiàn)為主根和側(cè)根均正常生長(zhǎng)發(fā)育，陰性幼苗表現(xiàn)出發(fā)育遲緩且根部無法正常生長(zhǎng)，不形成側(cè)根。移栽時(shí)選取主根和側(cè)根生長(zhǎng)發(fā)育均正常的陽(yáng)性苗，取幼苗時(shí)用鑷子緩緩將幼苗從培養(yǎng)基中拔出，用無菌水清洗幼苗根部的培養(yǎng)基，移入滅菌的人工土，置于植物生長(zhǎng)培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。待T1擬南芥植株長(zhǎng)至抽薹時(shí)，每株取少量葉片提取擬南芥總DNA鑒定是否為陽(yáng)性植株。鑒定出3株轉(zhuǎn)早花重組質(zhì)粒陽(yáng)性植株，5株轉(zhuǎn)晚花重組質(zhì)粒陽(yáng)性植株(圖7)。

1—3.早花重組質(zhì)?？剐悦?；4—8.晚花重組質(zhì)?？剐悦?；9.野生型擬南芥。1—3.Early-flowering recombinant plasmid resistant seedlings；4—8.Late-flowering recombinant plasmid resistant seedlings；9.Wild type Arabidopsis thaliana.

收取T1植株種子，通過上述相同方法對(duì)T2植株進(jìn)行陽(yáng)性篩選，最終得到T2種子，T2種子采取單株收種。繼續(xù)對(duì)T2種子進(jìn)行檢測(cè)至株系純合。

將轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系的種子播種在含有卡那霉素抗性的1/2 MS培養(yǎng)基上，選取長(zhǎng)勢(shì)良好發(fā)育正常的擬南芥幼苗進(jìn)行GUS染色。染色后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗GUS基因主要在根莖中表達(dá)。含有晚花啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的擬南芥幼苗GUS基因染色程度較淺，因此，晚花啟動(dòng)子在苗期表達(dá)量較??；含有早花啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的擬南芥幼苗GUS基因染色程度較深，因此，早花材料啟動(dòng)子在苗期表達(dá)量較大；在野生型擬南芥中GUS基因不表達(dá)；pBI121載體轉(zhuǎn)染的擬南芥GUS基因全株表達(dá)(圖8)。

A.野生型擬南芥；B.含pBI121載體擬南芥；C.含晚花啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因擬南芥；D.含早花啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因擬南芥。

3 結(jié)論與討論

在基因表達(dá)調(diào)控中基因啟動(dòng)子中的順式作用元件起著重要作用，基因中不同的啟動(dòng)子特征決定了啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因不同的表達(dá)特征[18]。開花對(duì)植物而言是生長(zhǎng)發(fā)育過程中最為重要的階段之一，植物開花也就意味著植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)過渡[19]。對(duì)油菜開花基因的研究能夠更好地了解油菜發(fā)育過程，為提高油菜產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

本研究克隆了BnaFIL基因啟動(dòng)子序列，并對(duì)該序列進(jìn)行了啟動(dòng)子順式作用元件分析，結(jié)果顯示，在早花材料和晚花材料中啟動(dòng)子的順式作用元件都相同，但是不同開花時(shí)期的材料還是存在SNP位點(diǎn)；啟動(dòng)子序列中包含了參與光響應(yīng)的部分保守DNA模塊、核心啟動(dòng)子必備元件TATA-BOX和CAAT-BOX、與分生組織表達(dá)有關(guān)的順式作用的調(diào)控元件CAT-BOX以及光敏反應(yīng)元件，由此推斷，該啟動(dòng)子的表達(dá)受光照的影響較大，該啟動(dòng)子還含有與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用元件，也可推測(cè)，該啟動(dòng)子對(duì)油菜開花相關(guān)的分生組織有相應(yīng)影響。由于該基因的啟動(dòng)子反應(yīng)元件以及SNP位點(diǎn)主要集中在1 300 bp以內(nèi)，因此，試驗(yàn)主要以長(zhǎng)度為1 300 bp的啟動(dòng)子進(jìn)行研究。為了進(jìn)一步探究BnaFIL基因啟動(dòng)子序列上的SNP位點(diǎn)是否對(duì)BnaFIL基因的驅(qū)動(dòng)有影響，本研究構(gòu)建了BnaFIL基因啟動(dòng)子表達(dá)載體pBnaFIL-pBI121，鑒定結(jié)果表明，表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入土壤農(nóng)桿菌GV3101，為下一步試驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)FIL基因?qū)﹂_花時(shí)期的研究還較少，但對(duì)FIL基因所屬的YABBY家族研究較多。YABBY基因主要調(diào)控植物的開花以及側(cè)枝發(fā)育等[20-22]。本研究通過構(gòu)建BnaFIL基因啟動(dòng)子表達(dá)載體，將載體通過農(nóng)桿菌花序浸染的方法成功轉(zhuǎn)入擬南芥中，獲得了早花啟動(dòng)子重組質(zhì)粒陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系和晚花啟動(dòng)子重組質(zhì)粒陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。之后利用GUS基因染色的特性，對(duì)啟動(dòng)子的表達(dá)效果進(jìn)行了檢測(cè)，最終在不同的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中均發(fā)現(xiàn)了GUS基因的表達(dá)，從而可以斷定早花材料啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的效果比晚花材料啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)效果要好。該結(jié)論進(jìn)一步驗(yàn)證了早花材料中BnaFIL基因的表達(dá)量較晚花材料中BnaFIL基因的表達(dá)量更高。由于BnaFIL基因中的SNP位點(diǎn)位于內(nèi)含子上，內(nèi)含子不參與蛋白質(zhì)的編碼，因此，對(duì)該基因啟動(dòng)子上的SNP進(jìn)行研究，且結(jié)果顯示早花材料與晚花材料中啟動(dòng)子的表達(dá)效果存在一定差異，由此推斷，該基因在不同材料中的表達(dá)可能是由于啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)效果決定的，從而對(duì)油菜開花早晚進(jìn)行調(diào)控。