安清明，王 星，吳震洋，孟金柱，趙園園，宋興超

(貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

當(dāng)下社會(huì)，人們飲食習(xí)慣不斷發(fā)生改變，對(duì)健康飲食和養(yǎng)生保健的關(guān)注度越來(lái)越高，意味著對(duì)肉質(zhì)食品的質(zhì)量要求變得更高，這也為我國(guó)畜禽肉質(zhì)性狀的遺傳改良提出了新的要求。貴州白山羊是我國(guó)云貴高原特有的地方山羊(Caprahircus)品種，是發(fā)展當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的重要種質(zhì)資源。研究貴州白山羊優(yōu)良胴體肌肉性狀的分子調(diào)控機(jī)理，挖掘、鑒定控制白山羊胴體肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的主效基因，并應(yīng)用現(xiàn)代分子標(biāo)記育種與傳統(tǒng)育種法相結(jié)合的新途徑，對(duì)改良貴州白山羊胴體肌肉生長(zhǎng)性狀具有重要意義。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(Transcriptome Sequencing，RNA-Seq)是基于Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)能夠快速檢測(cè)特定物種在全基因組水平上基因表達(dá)和調(diào)控的重要方法，諸如新基因預(yù)測(cè)、基因結(jié)構(gòu)和功能優(yōu)化、可變剪接等，目前廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)領(lǐng)域，尤其在畜禽重要性狀分子機(jī)制研究中已被廣泛應(yīng)用[1-2]。

動(dòng)物肌肉組織的生長(zhǎng)發(fā)育狀況直接決定了動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)效益。肌肉組織的生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)又可以從生長(zhǎng)速度和肉品質(zhì)兩方面評(píng)價(jià)，肌肉的生長(zhǎng)速度直接決定動(dòng)物胴體質(zhì)量和產(chǎn)肉量，而肉品質(zhì)通常用嫩度、吸水力、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)成分和肌內(nèi)脂肪含量等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，直接影響動(dòng)物產(chǎn)出肉的評(píng)級(jí)和價(jià)格。而大多數(shù)決定肌肉生長(zhǎng)發(fā)育性狀的因素都具有遺傳效應(yīng)，受相應(yīng)基因調(diào)控，如骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育、肌內(nèi)脂肪含量、嫩度等指標(biāo)[3-6]。已有研究報(bào)道，孟祥忍等[7]對(duì)1周齡不同肉牛品種的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行差異基因篩選，最終篩選到2個(gè)可能與肌肉嫩度相關(guān)的功能基因。趙偉明等[8]對(duì)不同肉牛背膘脂肪進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，最終篩選出1 296個(gè)差異表達(dá)基因。孟憲然等[9]對(duì)不同性別、年齡的絨山羊背最長(zhǎng)肌進(jìn)行差異基因篩選和驗(yàn)證，最終篩選出3個(gè)可能與肉品質(zhì)相關(guān)的候選基因。王位等[6]對(duì)綿羊背最長(zhǎng)肌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，最終篩選出6個(gè)與肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因。劉遠(yuǎn)等[10]對(duì)不同山羊背最長(zhǎng)肌進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，挖掘出707個(gè)可能與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育和肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)的新基因，這些研究均為家畜的胴體肌肉生長(zhǎng)發(fā)育遺傳機(jī)理提供了一定研究基礎(chǔ)。

目前，雖然對(duì)家畜動(dòng)物胴體肌肉生長(zhǎng)相關(guān)基因進(jìn)行了一定篩選，但是有關(guān)地方山羊品種胴體肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的研究仍比較匱乏，尤其對(duì)不同性別山羊胴體肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的研究更為稀少。貴州白山羊作為云貴高原特有品種，是發(fā)展貴州乃至西南地區(qū)畜牧業(yè)的重要種質(zhì)資源，值得對(duì)其優(yōu)良胴體肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的遺傳特性進(jìn)行深入挖掘研究。

本試驗(yàn)選擇同等飼養(yǎng)水平下、不同性別的貴州白山羊作為研究對(duì)象，采用RNA-Seq技術(shù)對(duì)二者背最長(zhǎng)肌的表達(dá)基因進(jìn)行篩選分析，鑒定關(guān)鍵基因和篩選重要信號(hào)通路，以期為貴州白山羊種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

試驗(yàn)所需貴州白山羊由貴州省銅仁市沿河土家族自治縣中寨鎮(zhèn)永珍牧業(yè)養(yǎng)殖合作社提供。所選山羊在同等水平下采用半封閉式飼養(yǎng)，選取2周齡健康的公、母羊各3只，按照國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屠宰標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屠宰并測(cè)定屠宰性能指標(biāo)(宰前活質(zhì)量、胴體質(zhì)量、屠宰率、凈肉重和凈肉率)，采集6只白山羊(公、母各3只)第10～12根胸椎位置背最長(zhǎng)肌裝入凍存管并移至液氮中進(jìn)行冷凍保存，待運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置于-80 ℃冰箱中保存，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-qPCR。

1.2 總RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

將-80 ℃冰箱中的背最長(zhǎng)肌置于冰盒中解凍，利用RNAprep pure Tissue Kit (TianGen，北京天根生化科技有限公司)提取6個(gè)樣品背最長(zhǎng)肌組織的總RNA，公羊樣本標(biāo)注為R1、R2和R3，母羊樣本標(biāo)注為E1、E2和E3。為保證數(shù)據(jù)完整和準(zhǔn)確性，采用Agilent Bioanalyzer 2100檢測(cè)完整性，Qubit 2.0 Flurometer測(cè)量RNA濃度，RNA樣品檢測(cè)合格后送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序，測(cè)序主要通過(guò)Illumina Hiseq 2500平臺(tái)完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

利用FastQC軟件(http：//www.bioinformatics.babraha m.ac.uk/projects/fastqc/)對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，去除原始數(shù)據(jù)中含有帶接頭和低質(zhì)量的片段，保證獲得的數(shù)據(jù)具有品質(zhì)較高的有效測(cè)序數(shù)據(jù)(Clean reads)。利用TopHat 2軟件將獲得的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)與已知山羊參考基因組進(jìn)行比對(duì)，獲取測(cè)序拼裝序列在參考基因組上的相關(guān)位置信息以及樣品的序列特征信息。利用Cufflinks軟件，對(duì)轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝、注釋和合并，用DESeq 2軟件分析mRNA的差異表達(dá)數(shù)據(jù)，利用基因本體(Gene ontology，GO)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的表達(dá)差異基因進(jìn)行GO分析，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行DEGs的信號(hào)通路分析。

1.4 熒光定量PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性，對(duì)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行驗(yàn)證。挑選6個(gè)差異表達(dá)的候選基因，包括3個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因，進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)將高通量測(cè)序使用剩余樣品的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所需cDNA。應(yīng)用Primer 5.0軟件在線設(shè)計(jì)所挑選基因的引物，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因作參考基因，引物由上海生工合成(表1)。

表1 熒光定量引物基因Tab.1 The list of gene primers of RT-qPCR

RT-qPCR驗(yàn)證不同性別貴州白山羊背最長(zhǎng)肌中差異表達(dá)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平時(shí)采用3個(gè)樣本重復(fù)，采用TransStart?Tip Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行相對(duì)定量擴(kuò)增分析，擴(kuò)增體系20 μL：cDNA模板1 μL，2×Transstart?Tip Green qPCR super mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNA-free H2O 8 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，46個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因間的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州白山羊屠宰性能差異分析

測(cè)定不同性別白山羊2周齡屠宰性能，公羊群體的宰前活質(zhì)量、胴體質(zhì)量和凈肉質(zhì)量顯著高于母羊，屠宰率和凈肉率差異雖然不顯著，但公羊仍要高于母羊，該結(jié)果表明，公羊的屠宰性能要優(yōu)于母羊(表2)。

表2 不同性別貴州白山羊屠宰性能差異分析Tab.2 Slaughter performance differences between ram and ewe of Guizhou wihte goat

2.2 RNA-Seq數(shù)據(jù)比對(duì)分析

測(cè)序文庫(kù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)，各樣本均符合要求，最終6個(gè)樣本經(jīng)高通量測(cè)序共獲得78.99 Gb Clean bases Data，單個(gè)樣本Clean bases Data均達(dá)到12.45 Gb以上，獲得Clean reads Date在83 030 104～95 739 024條。結(jié)果中堿基質(zhì)量Q30以上的百分比為89.86%～92.86%，堿基測(cè)序錯(cuò)誤率均為2%，表明測(cè)序質(zhì)量高、測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，可用于后續(xù)分析試驗(yàn)。

將獲得的Clean reads與參考山羊基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，各樣品與參考基因組的比對(duì)效率為93.75%～94.79%，在參考序列上有唯一比對(duì)位置的reads數(shù)量占Clean reads的84.14%～87.21%，有多個(gè)比對(duì)位置reads占6.55%～10.65%(表3)。

表3 RNA-Seq與參考山羊基因組的序列比對(duì)Tab.3 RNA-Seq and mapping to the reference genome

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

以FPKM值作為衡量轉(zhuǎn)錄本和基因表達(dá)差異水平的指標(biāo)，分析得到6個(gè)樣本共25 089個(gè)表達(dá)基因的FPKM值，表4列出在公羊中表達(dá)量較高的前20個(gè)基因。同時(shí)應(yīng)用DESeq 2軟件設(shè)定參數(shù)≥FPKM≥1，MF-FPKM/FL-FPKM > 1，P<0.05，對(duì)獲得25 089個(gè)mRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，共獲得1 077個(gè)差異表達(dá)的mRNA，其中有194個(gè)為新發(fā)現(xiàn)基因(轉(zhuǎn)錄本)；其中公羊背最長(zhǎng)肌中表達(dá)顯著上調(diào)的基因?yàn)?63個(gè)，顯著下調(diào)的為514個(gè)。聚類分析熱圖顯示，公羊和母羊樣本間差異表達(dá)基因重復(fù)性較好，差異基因分別聚類在一起(圖1)。

表4 公羊和母羊背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最高的20個(gè)基因Tab.4 Top 20 highly expressed genes in ram and ewe longissimus doris tissue

A圖中紅色代表顯著上調(diào)基因，綠色代表顯著下調(diào)基因；B圖中紅色代表表達(dá)量上調(diào)基因，藍(lán)色代表表達(dá)量下調(diào)基因。Red represents significantly up-regulated gene and green represents significantly down-regulated gene in Fig.A；Red signal represents genes with up-regulated expression，blue signal represents genes with down-regulated expression gene in Fig.B.

2.4 GO功能富集分析

GO注釋系統(tǒng)可分為三大類，分別為：生物學(xué)過(guò)程(Biological process，BP)、細(xì)胞組分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)。通過(guò)Goseq軟件對(duì)篩選出的1 077個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，其中587個(gè)基因?yàn)轱@著富集(Q-value≥0.05)，這些基因在3個(gè)分支中均有分布，共有35個(gè)功能亞類包括14個(gè)生物學(xué)過(guò)程(BP)、20個(gè)細(xì)胞組分(CC)、1個(gè)分子功能(MF)(圖2)。

1.RNA加工；2.ncRNA加工；3.核糖核蛋白復(fù)合體生物合成；4.mRNA加工；5.通過(guò)酯交換反應(yīng)的RNA剪接；6.以膨大的腺苷為親核試劑，通過(guò)酯交換反應(yīng)的RNA剪接；7.通過(guò)剪接體的mRNA剪接；8.ncRNA代謝過(guò)程；9.RNA剪接；10.信使RNA代謝；11.核糖核蛋白復(fù)合體亞基組織；12.核糖核蛋白復(fù)合物組裝；13.核酸代謝過(guò)程；14.核糖體生物合成；15.細(xì)胞核部分；16.核腔；17.細(xì)胞核；18.細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器內(nèi)腔；19.細(xì)胞器內(nèi)腔；20.細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器；21.細(xì)胞膜內(nèi)腔；22.膜結(jié)合細(xì)胞器；23.細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器部分；24.細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器；25.細(xì)胞器；26.核仁；27.細(xì)胞器部分；28.細(xì)胞內(nèi)；29.細(xì)胞內(nèi)的部分；30.核糖核蛋白；31.大分子復(fù)合體；32.無(wú)膜細(xì)胞器；33.胞內(nèi)無(wú)膜細(xì)胞器；34.核質(zhì)；35.RNA結(jié)合。

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路分析

通過(guò)Kobas軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，F(xiàn)DR≤0.05的通路為表達(dá)基因中顯著富集的信號(hào)通路，結(jié)果顯示，可被注釋的表達(dá)基因共參與243個(gè)通路，其中參與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K-AKT)信號(hào)通路相關(guān)的基因最為富集，共注釋到32個(gè)基因，圖3為差異表達(dá)基因的KEGG通路富集結(jié)果中顯著性Q值最小的20個(gè)通路。

圖3 背最長(zhǎng)肌中差異表達(dá)基因KEGG通路富集散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of enriched KEGG pathway in longissimus doris tissue

在被注釋到PI3K/AKT信號(hào)通路中的32個(gè)基因中，ITGAV、LAMA4、LAMB1等17個(gè)基因?yàn)轱@著上調(diào)基因，CBL基因?yàn)轱@著下調(diào)基因(表5)。對(duì)通路中的32個(gè)基因進(jìn)行共表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)COL4A1和COL4A2基因共表達(dá)估值最高，且在人、普通牛和小鼠中的共表達(dá)估值最高，ITGAV基因共表達(dá)最為豐富，與12個(gè)蛋白共表達(dá)。對(duì)通路中注釋到的32個(gè)基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果表明，CSF3基因編碼蛋白互作效應(yīng)最強(qiáng)，ITGAV基因編碼蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)最多，LPAR6基因編碼蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)最少(圖4)。

表5 參與磷脂酰肌醇3/激酶信號(hào)通路的基因Tab.5 Genes involved in PI3K/AKT signaling pathway

圖4 PI3K/AKT通路注釋基因共表達(dá)分析(A)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析(B)Fig.4 Coexpression analysis of annotated genes (A)and protein-protein network interaction(B) in PI3K/AKT signaling pathway

2.6 RT-qPCR驗(yàn)證分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選差異表達(dá)基因的準(zhǔn)確性，本研究從差異表達(dá)基因中篩選出6個(gè)候選基因進(jìn)行驗(yàn)證(表6)，其中FHL3、WFIKKN2、SOX6基因在公羊中為上調(diào)基因，QSOX2、MYH2、LAP基因?yàn)橄抡{(diào)基因，RT-qPCR結(jié)果顯示，這6個(gè)候選基因的mRNA表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，且FHL3、WFIKKN2、SOX6基因在公羊背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量均顯著高于母羊(P<0.05)，QSOX2、MYH2、LAP基因在公羊背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量均顯著低于母羊(圖5)(P<0.05)。

表6 可能與不同性別山羊背最長(zhǎng)肌發(fā)育相關(guān)的候選基因Tab.6 Candidate genes may associate with longissimus doris tissue development in ram and ewe

不同小寫字母表示差異顯著(P <0.05)。Different lowecase letters show significant difference(P <0.05).

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)選用同等飼養(yǎng)條件下、同年齡段、不同體質(zhì)量的貴州白山羊公、母羊背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選與胴體肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因，結(jié)合相關(guān)生物學(xué)功能分析，共發(fā)現(xiàn)了1 077個(gè)差異表達(dá)基因，其中有194個(gè)為新發(fā)現(xiàn)基因或轉(zhuǎn)錄本；其中563個(gè)基因在公羊背最長(zhǎng)肌中表達(dá)顯著上調(diào)，514個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)，這些差異表達(dá)基因可能與貴州白山羊的背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，值得進(jìn)一步深入挖掘研究。

對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能注釋和KEEG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路是一條重要的信號(hào)通路，該通路在細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、代謝和生存中起著重要調(diào)控作用[11]，通路中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)主要分為三類，其中Ⅰ類最為重要，其主要與生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的PI3K信號(hào)通路密切相關(guān)，其中p85α亞基可以介導(dǎo)胰島素的調(diào)控進(jìn)而影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[12]，還可以通過(guò)與p110α亞基結(jié)合影響p110α亞基的活性[13]。研究還發(fā)現(xiàn)，PTEN基因編碼蛋白與PI3K的p85亞基之間的相互作用對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的穩(wěn)態(tài)起著重要作用[14]，本研究在PI3K/AKT信號(hào)通路中篩選到PTEN基因，也篩選到了編碼2種亞基的基因PIK3CA和PIK3R1。在該通路中蛋白激酶B(AKT)是另一個(gè)關(guān)鍵因子，其重要的亞型AKT2主要在骨骼肌、棕色脂肪中表達(dá)，而且研究發(fā)現(xiàn)，活化后的AKT可以激活上百種底物，達(dá)到調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝、運(yùn)動(dòng)等功能[15-16]。呂欣等[17]分析也認(rèn)為，通過(guò)影響PI3K/AKT信號(hào)通路中的蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)通路的磷酸化，可以促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化、抑制凋亡，從而影響骨骼肌的再生修復(fù)。而本研究對(duì)不同山羊背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄組分析篩選出PI3K/AKT信號(hào)通路是最為富集的信號(hào)通路，這也證明該通路是調(diào)控胴體肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的重要信號(hào)通路，值得進(jìn)一步深入研究。

在PI3K/AKT信號(hào)通路篩選出的32個(gè)注釋基因中，ITGAV基因編碼蛋白(Integrin subunit alpha V，整合素αV亞基)在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中互作蛋白數(shù)最為豐富，該基因?qū)儆谡纤卅伶溂易宄蓡T，研究表明，編碼蛋白可通過(guò)精-甘-天冬序列(Arg-Gly-Asp，R-G-D)與多種細(xì)胞外基質(zhì)配體相結(jié)合，從而介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)，在調(diào)控腫瘤血管生成、腫瘤的遷移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[18]。馬春輝[19]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，ITGAV基因可能在大鼠副側(cè)韌帶損傷恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究在PI3K/AKT信號(hào)通路篩選出的注釋基因中，包括了COL家族的4個(gè)基因，分別為COL4A1、COL4A2、COL5A3和COL6A6，其中COL4A1和COL4A2基因編碼蛋白共表達(dá)估值最高。已有研究表明，COL4A1、COL4A2基因分別編碼Ⅳ型膠原蛋白的α1鏈和α2鏈，主要在細(xì)胞基底膜上表達(dá)，與細(xì)胞網(wǎng)狀支架形成相關(guān)[20]，綜上，本研究在通路中篩選出的注釋基因可能都與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，可進(jìn)一步作為山羊胴體肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的候選基因。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出的1 077個(gè)差異表達(dá)基因中，篩選出6個(gè)可能與貴州白山羊背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)差異表達(dá)候選基因(上調(diào)基因3個(gè)，下調(diào)基因3個(gè))，分別為FHL3、WFIKKN2、SOX6、QSOX2、MYH2和LAP基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果均與RNA-Seq分析結(jié)果一致。在上調(diào)基因中，F(xiàn)HL3基因的cDNA全長(zhǎng)843 bp，編碼281個(gè)氨基酸，轉(zhuǎn)錄蛋白屬于LIM蛋白家族[21]。FHL3基因主要在骨骼肌中高表達(dá)，F(xiàn)HL3蛋白可以通過(guò)和肌動(dòng)蛋白相結(jié)合對(duì)肌動(dòng)蛋白成束起到負(fù)調(diào)控的作用[22]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因在成肌細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)纖維解聚，說(shuō)明FHL3是激動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)中的重要調(diào)控因子[22]。在畜牧生產(chǎn)中，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL3基因的突變與豬肉的眼肌面積、肉質(zhì)性狀、肌內(nèi)脂肪、肌肉嫩度等肉質(zhì)生產(chǎn)性狀相關(guān)[23-24]。WFIKKN2基因編碼蛋白是一種分泌蛋白，可抑制蛋白酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，WFIKKN2基因編碼蛋白可以通過(guò)結(jié)合生長(zhǎng)分化因子GDF11而參與調(diào)控骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[25]。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，孫玲[26]發(fā)現(xiàn)，WFIKKN2基因與MSTN基因隨骨骼肌的發(fā)育變化而表現(xiàn)出相反的表達(dá)規(guī)律。Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，WFIKKN2基因變異與綿羊的肩部瘦肉量相關(guān)。SOX6基因最早從成年小鼠睪丸中分離得到[28]，其編碼蛋白屬于一種轉(zhuǎn)錄因子，后續(xù)發(fā)現(xiàn)其在脊椎動(dòng)物發(fā)育中起著重要調(diào)控作用[29]，如SOX6基因編碼蛋白參與維持肌肉組織的正常生理功能[30]，參與軟骨和骨骼肌的生成等[31]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，SOX6基因在細(xì)胞增殖和分化中起重要作用，如Jackson等[32]發(fā)現(xiàn)，Sox6是調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物骨骼肌纖維類型分化的關(guān)鍵因素之一，Quiat等[33]發(fā)現(xiàn)，在小鼠骼肌中Sox6蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致慢肌纖維顯著增加，肌肉顏色變鮮紅。

在下調(diào)基因中，QSOX2基因相關(guān)研究仍較少，目前還未發(fā)現(xiàn)該基因與哺乳動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)或個(gè)體發(fā)育相關(guān)的研究報(bào)道，僅Okada等[34]研究發(fā)現(xiàn)，QSOX2基因rs12338076突變可能與日本人群個(gè)體身高相關(guān)。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，骨架(體高)比較大的動(dòng)物具有更為良好的育肥前景，且畜禽的日增質(zhì)量直接受肌肉發(fā)育的影響。MYH2基因?qū)儆贛YH基因家族，該家族基因能夠編碼一系列與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的MyHC蛋白亞型，其中MYH2基因編碼的亞型蛋白主要存在于快速氧化型肌纖維中，且在骨骼肌中也有發(fā)現(xiàn)，研究表明，MYH2基因是一種肌節(jié)調(diào)控基因，主要與動(dòng)物的肌肉發(fā)育相關(guān)[35-37]，而肌纖維是影響肉品質(zhì)的一個(gè)重要因素；李娜[38]通過(guò)GWAS研究發(fā)現(xiàn)，MYH2基因可作為影響豬肉中肌纖維性狀和肌內(nèi)脂肪的重要候選基因。LAP基因編碼蛋白屬于一類對(duì)亮氨酸殘基具有最高切割效率的氨肽酶，這類蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞極性和細(xì)胞增殖中具有重要作用[39]，研究發(fā)現(xiàn)，LAP基因可以通過(guò)影響泌乳細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)奶牛的產(chǎn)奶量、牛奶的乳脂率和乳蛋白含量[40]，亦有研究通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，LAP基因與綿羊的體質(zhì)量顯著相關(guān)[41]。

綜上，本研究共篩選出影響不同性別貴州白山羊背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)發(fā)育和肉品質(zhì)的差異表達(dá)基因1 077個(gè)，其中194個(gè)為新發(fā)掘基因(轉(zhuǎn)錄本)；其中在公羊背最長(zhǎng)肌中563個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，514個(gè)基因顯著下調(diào)。通過(guò)功能分析及RT-qPCR驗(yàn)證及PI3K/AKT信號(hào)通路分析表明，篩選出的基因可作為影響不同性別貴州白山羊背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)發(fā)育和肉品質(zhì)的重要參考基因，對(duì)進(jìn)一步深入探究白山羊胴體肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的遺傳調(diào)控機(jī)制具有重要意義。