賈志強(qiáng)，許云玉，高 雪，陶宏征，3，陳增敏，劉雅婷，李永忠

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.紅河學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 蒙自 661199；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201)

辣椒(CapsicumannuumL.)是一年生或多年生植物，生長(zhǎng)過(guò)程中受到生物和非生物脅迫，如病原體、干旱、高溫、高濕，從而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[1-3]。植物在應(yīng)對(duì)環(huán)境中非生物和生物脅迫時(shí)，進(jìn)化出各種防御策略，其中轉(zhuǎn)錄因子(Ttranscription factor，TFs)對(duì)基因的調(diào)控是極為重要的調(diào)控方式[4]。WRKY 蛋白是種子植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，其基因家族成員的N端均含有由 WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域以及C2H2型鋅指(CX4-5CX22-23HXH)或C2HC型鋅指(CX7CX23HXC)，通過(guò)其WRKY結(jié)構(gòu)域與下游靶基因啟動(dòng)子中的W-box(TGAC)結(jié)合，從而對(duì)下游基因進(jìn)行調(diào)控[5-6]。根據(jù)WRKY 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的特征，WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3類：Ⅰ類含有2個(gè)WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，Ⅱ和Ⅲ類僅含有1個(gè)WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，Ⅱ類除含有WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域外，還含有C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)，Ⅱ類又可進(jìn)一步分為5個(gè)亞類(a、b、c、d、e)，此外Ⅲ類還有C2HC的鋅指結(jié)構(gòu)[7]。目前，辣椒WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究還不夠深入。

辣椒WRKY轉(zhuǎn)錄因子在生物和非生物脅迫中的功能研究較多，但未見(jiàn)番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)病毒侵染辣椒后WRKY基因家族的研究。辣椒WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與了生物與非生物脅迫，并在這些生物過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[8-9]。采用過(guò)表達(dá)和基因沉默試驗(yàn)，驗(yàn)證CaWRKY1對(duì)細(xì)菌病害辣椒瘡痂病(Xanthomonasaxonopodis)具有負(fù)調(diào)控作用。利用同源克隆和RT-PCR技術(shù)獲得辣椒6個(gè)WRKY基因(WRKY-a、WRKY-b、WRKY-c、CaWRKY1、WRKY1和CaWRKY2)的全長(zhǎng)cDNA，其中WRKY-a、CaWRKY2受到根結(jié)線蟲誘導(dǎo)表達(dá)[10]。辣椒的WRKY6、WRKY70、WRKY-A1244的表達(dá)分別受到青枯菌(Ralstoniasolanacearum)、疫霉菌(Phytophthoracapsici)和煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)的誘導(dǎo)，CaWRKY40的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了青枯菌的抗性[11]，而CaWRKY27和CaWRKY58分別正、負(fù)調(diào)控辣椒對(duì)青枯病的抗性[12-13]。CaWRKY6通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活CaWRKY40參與了青枯菌抗性和熱耐受性[14]。

為了解番茄斑萎病毒屬代表種番茄斑萎病毒(TSWV)侵染辣椒后的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的變化，闡明TSWV侵染后辣椒CaWRKY30的變化趨勢(shì)，本研究首先對(duì)CaWRKY30進(jìn)行克隆和序列分析，然后將其在本氏煙(Nicotianabenthamiana)中進(jìn)行亞細(xì)胞定位試驗(yàn)，最后將對(duì)TSWV侵染后CaWRKY30的變化情況進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究TSWV與辣椒互作后的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料處理與基因克隆

將辣椒種子播種于穴盤，待出苗后移栽到裝有土壤和腐殖質(zhì)混合物的塑料盆(10 cm×10 cm×10 cm)中，使植物生長(zhǎng)在光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為(25±2)℃，相對(duì)濕度恒定為(65±5)%，并且光照周期為16∶8(亮∶暗)，植物每7 d澆水2次，直到植物生長(zhǎng)到4葉期時(shí)，取TSWV毒源進(jìn)行機(jī)械摩擦接種。對(duì)照組用接種緩沖液處理并放置在相同條件下的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。分別摩擦接種1種病毒處理后收集(3個(gè)生物學(xué)重復(fù))頂部的正3葉樣品，立即在液氮中冷凍，并在RNA提取之前在-80 ℃冰箱中保存。

根據(jù)辣椒全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//passport.pepper.snu.ac.kr/)和茄科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//solgenomics.net/)下載CaWRKY30基因序列信息，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，委托上海生工生物工程股份有限公司合成。辣椒Total RNA 提取按照TianGen(TRNzol Universal總RNA提取試劑，DP424，TianGen)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA(PrimeScriptTMⅣ 1st strand cDNA Synthesis Mix，6215A，TaKaRa)。對(duì)cDNA用克隆引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃徹底延伸5 min，4 ℃保存。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，割膠回收符合要求的片段進(jìn)行克隆?？寺∮迷噭┖袨閜EASY-Blunt Zero Cloning Kit(CB501，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，按照說(shuō)明書將純化片段與pEASY-Blunt Zero載體連接，然后熱擊法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定后挑取陽(yáng)性單克隆送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得CaWRKY30基因序列。

表1 試驗(yàn)所用引物信息Tab.1 Experiment primer information

基于克隆得到的CaWRKY30序列用ProtParam在線工具(http：//web.expasy.org/protparam/)對(duì)其蛋白進(jìn)行氨基酸數(shù)量、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和親水性等理化性質(zhì)分析。

1.2CaWRKY30的多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用軟件MEGA 7.0對(duì)與CaWRKY30同源的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、黃瓜(Cucumissativus)、番茄(Solanumlycopersicum)、大豆(Glycinemax)、小麥(Triticumaestivum)、葡萄(Vitisvinifera)、咖啡(Coffeaarabica)等植物的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果用鄰接法 (Neibor-joinng，NJ)對(duì)CaWRKY30的保守域蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap重復(fù)1 000次。使用DNAMAN 6.0軟件的默認(rèn)參數(shù)，將表征WRKY蛋白的WRKY結(jié)構(gòu)域用于蛋白質(zhì)多序列比對(duì)。

1.3 CaWRKY30蛋白的亞細(xì)胞定位試驗(yàn)

利用在線軟件Plant-mPLoc 9.0(http：//linux1.softberry.com/all.htm)和Cell-PLoc 2.0軟件[15](http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)對(duì)CaWRKY30蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞核。根據(jù)CaWRKY30序列設(shè)計(jì)不含有終止密碼子的帶BamHⅠ/KpnⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物CaW30-BamHⅠ-F/KpnⅠ-R(表1)，并以辣椒cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用雙酶切技術(shù)(NEB)將產(chǎn)物與pBI121-eGFP載體用T4連接酶連接，最終構(gòu)建pBI121-eGFP∶CaWRKY30融合表達(dá)載體。將新鮮培養(yǎng)的含有pBI121-eGFP∶CaWRKY30載體和pBI121-eGFP空載體的GV3101農(nóng)桿菌菌液5 000 r/min，離心10 min，去除上清液，在沉淀中加入新鮮配置的煙草浸潤(rùn)緩沖液(10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES pH值5.7、200 μmol/L乙酰丁香酮)，調(diào)整其OD600=0.8，室溫靜置3 h后接種至5～6葉期健康的本氏煙，接種時(shí)用去除針頭的無(wú)菌注射器浸潤(rùn)處理本氏煙葉片下表皮。3次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)浸潤(rùn)5株，每株浸潤(rùn)4片葉子，每片葉均有2個(gè)浸潤(rùn)點(diǎn)。處理后的本氏煙放于25 ℃培養(yǎng)箱中，光周期為14 h光照/10 h 黑暗，相對(duì)濕度為65%，72 h后制片置于激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5 Ⅱ，Leica)488 nm 激發(fā)光下觀察本氏煙上皮細(xì)胞中目標(biāo)蛋白在明、暗視野下的表達(dá)情況。

1.4 TSWV侵染后CaWRKY30的表達(dá)分析

TSWV(株系GC-1)分離自云南省，保存在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物與病原互作實(shí)驗(yàn)室，其全基因組已被測(cè)序。使用時(shí)從冰箱中取出，摩擦接種到一點(diǎn)紅(EmiliasonchifoliaL.)上，活化病毒用于后續(xù)的試驗(yàn)。本研究用對(duì)TSWV病毒的易感辣椒(CapsicumannuumL.)品種湘研11為試驗(yàn)材料。

挑選在TSWV侵染后的CaWRKY30進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。用TRIzol法從3個(gè)辣椒葉樣品中提取植物的總RNA，試驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)TianGen Biotech說(shuō)明書(天根生化科技(北京)有限公司，DP421)。

以CaWRKY30轉(zhuǎn)錄因子的基因序列為參考序列，用Beacon Designer 7.9(Premier Biosoft International，Palo Alto，CA)設(shè)計(jì)qRT-PCR試驗(yàn)中的引物(表1)，內(nèi)參基因選用UBI3(Accession number：AY486137.1)[16]，試驗(yàn)樣品為接種后1，7，14，21，28 d的樣品，CK為接種緩沖液的樣品，每個(gè)時(shí)期的樣品進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。熒光定量所用儀器為ABI7500型熒光定量PCR儀(美國(guó))，qRT-PCR反應(yīng)體系：2×SYBR?Green Supermix 10 μL；Forward primer(200 nmol/L) 1 μL；Reverse primer(200 nmol/L)1 μL；cDNA 2 μL；ddH2O 6 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，39 個(gè)循環(huán)；溶解曲線(Melt curve analysis)(60～ 95 ℃，+1 ℃/循環(huán)，保持時(shí)間 4 s)。使用2-ΔΔCt方法來(lái)計(jì)算基因的表達(dá)量[17]。分析TSWV病毒侵染后CaWRKY30的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒CaWRKY30基因克隆

以辣椒cDNA為模板用CaWRKY30的特異性引物CaWRKY30-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后電泳檢測(cè)，結(jié)果得到1 122 bp大小的特異性條帶(圖1)。CaWRKY30基因含有1個(gè)ORF，編碼373個(gè)氨基酸。利用ProtParam在線工具預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CaWRKY30蛋白的理論等電點(diǎn)為5.87，分子質(zhì)量為41.289 25 ku，不穩(wěn)定系數(shù)為63.17，脂肪系數(shù)為45.79，平均親水性系數(shù)為-0.907，結(jié)果表明，CaWRKY30蛋白是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白。

圖1 辣椒 CaWRKY30基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of pepper CaWRKY30 gene

2.2 CaWRKY30的系統(tǒng)發(fā)育和多序列比對(duì)分析

選取與CaWRKY30同源植物的WRKY保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CaWRKY30與WRKY家族Ⅱ(e)類的AtWRKY22聚在一起，推測(cè)其屬于Ⅱ(e)類，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CaWRKY30與茄科的馬鈴薯StWRKY22、煙草NtWRKY22和番茄SlWRKY22親緣關(guān)系較近，而與小麥TaWRKY35、玉米ZmWRKY39、水稻OsWRKY27親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這也符合同屬植物轉(zhuǎn)錄因子相似性較高的規(guī)律(圖2)。為進(jìn)一步確定CaWRKY30的分類地位，用DNAMAN 6.0軟件對(duì)WRKY保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示，CaWRKY30含有1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域，并且含有1個(gè)C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)，因此屬于第Ⅱ(e)類(圖3)。

圖2 辣椒CaWRKY30的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Systematic development analysis of pepper CaWRKY30

圖3 辣椒CaWRKY30的多序列比對(duì)分析Fig.3 Multi-sequence comparison analysis of pepper CaWRKY30

2.3 CaWRKY30蛋白的亞細(xì)胞定位分析

為分析CaWRKY30蛋白的亞細(xì)胞定位情況，將pBI121-eGFP∶CaWRKY30載體和pBI121-eGFP空載體分別利用GV3101農(nóng)桿菌介導(dǎo)的接種法浸潤(rùn)本氏煙葉片，72 h后取葉片下表皮細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CaWRKY30主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上，并且在細(xì)胞膜上可以觀察到膜增厚的結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖4 CaWRKY30亞細(xì)胞定位Fig.4 CaWRKY30 subcellular positioning

2.4 TSWV侵染后CaWRKY30的表達(dá)分析

番茄斑萎病毒侵染辣椒后，番茄斑萎病毒的積累量在14 d達(dá)到最大值，然后逐漸下降。當(dāng)病毒侵染后，CaWRKY30在1～28 d的變化趨勢(shì)為“倒V”形，由結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在14 d之前，CaWRKY30表達(dá)量逐漸升高，在14 d達(dá)到最大值，然后在14 d之后，CaWRKY30表達(dá)量逐漸下降(圖5)。

A.CaWRKY30變化；B.TSWV侵染植物后的變化；使用SPSS 26.0軟件采用Duncan′s模型進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P< 0.05)。A.CaWRKY30 changes；B.Changes after TSWV infects plants；SPSS 26.0 software was used for ANOVA statistical analysis using Duncan′s model(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)遇到各種生物和非生物逆境脅迫，因此，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)化出了各種防御策略[18]，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抵抗生物脅迫中扮演重要角色。辣椒是重要的蔬菜，但生產(chǎn)中病原物的侵染是影響產(chǎn)量的重要因素[19]，因此，研究植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子與病原物的互作對(duì)植物抗病育種具有重要作用[20-21]。本研究對(duì)CaWRKY30轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CaWRKY30屬于Ⅱ(e)類，編碼373個(gè)氨基酸，是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白；然后用雙酶切的方法構(gòu)建pBI121-eGFP：CaWRKY30融合表達(dá)載體，在本氏煙中觀察亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaWRKY30定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜，并且在細(xì)胞膜上可以觀察到膜增厚的現(xiàn)象；最后用TSWV病毒侵染辣椒，用qRT-PCR檢測(cè)不同時(shí)期CaWRKY30表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)接種14 d后CaWRKY30的積累量達(dá)到最大值。

本研究對(duì)辣椒被TSWV侵染后不同時(shí)期的病毒積累量進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)TSWV病毒的積累量與CaWRKY30變化趨勢(shì)一致，因此，推測(cè)TSWV在辣椒中的積累水平與CaWRKY30轉(zhuǎn)錄因子的積累量呈正相關(guān)關(guān)系，TSWV誘導(dǎo)了CaWRKY30的表達(dá)，所以猜測(cè)CaWRKY30轉(zhuǎn)錄因子在辣椒響應(yīng)TSWV菌脅迫過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。辣椒CaWRKY8轉(zhuǎn)錄因子在鹽、高溫、干旱和疫霉菌處理下誘導(dǎo)表達(dá)，在鹽和干旱處理下3 h達(dá)到峰值，在高溫和疫霉菌處理下12 h達(dá)到峰值，由于TSWV是逆轉(zhuǎn)錄病毒，此外還有辣椒品種的差異，最終導(dǎo)致TSWV侵染辣椒后CaWRKY30最大積累量的時(shí)期與CaWRKY8的存在差異[22]。辣椒CaWRKY14轉(zhuǎn)錄因子ABA 和疫霉菌脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并且在12，24 h達(dá)到峰值[23]。綜合CaWRKY14和CaWRKY8在辣椒疫霉菌的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，辣椒WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)不同病原菌的響應(yīng)強(qiáng)度差異較大。

前人研究發(fā)現(xiàn)，辣椒CaWRKY30轉(zhuǎn)錄因子受水楊酸(SA)、辣椒疫霉菌、煙草花葉病毒、辣椒青枯菌、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，但受到茉莉酸甲酯(MeJA)抑制表達(dá)[24]。此外，CaWRKY30正調(diào)控CaWRKY40增強(qiáng)辣椒對(duì)青枯病的抗性[25]。由于TSWV侵染辣椒后WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)趨勢(shì)未見(jiàn)研究，因此，本研究對(duì)TSWV侵染后CaWRKY30的亞細(xì)胞定位和表達(dá)差異進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CaWRKY30在辣椒響應(yīng)TSWV脅迫過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用，為進(jìn)一步研究TSWV與辣椒互作后的分子機(jī)制提供了參考依據(jù)。