唐忠麗，逯曉楠，趙 蕊，劉慶華，李梅蘭，雷逢進(jìn)，許小勇

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西省設(shè)施蔬菜協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 棉花研究所，山西 運城 044000)

西葫蘆(CucurbitapepoL.)別名美洲南瓜，原產(chǎn)北美洲南部，屬于葫蘆科南瓜屬作物，其既可以采摘嫩瓜當(dāng)作蔬菜食用，又可以采收老瓜用作打籽，在我國南北方廣泛種植。西葫蘆營養(yǎng)豐富，有黃色、綠色、白色、黑綠等多種顏色類型，還具有較高的觀賞價值。色素含量測定結(jié)果表明，其主要是由類胡蘿卜素和葉綠素等色素的多樣性積累導(dǎo)致[1]。

類胡蘿卜素是自然界中分布最為廣泛的一大類色素，不僅賦予植物花、果實等器官鮮艷的色彩，還在光合作用、ABA和芳香物質(zhì)合成中起重要作用[2]。目前，植物類胡蘿卜素合成代謝途徑已基本清晰，共涉及八氫番茄紅素合成酶(Phytoene Synthase，PSY)、八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene Desaturase，PDS)、番茄紅素環(huán)化酶(Lycopene Cyclase，LCY)等11種合成代謝酶[3]。這些結(jié)構(gòu)基因的序列變異或者轉(zhuǎn)錄水平會直接導(dǎo)致園藝作物中類胡蘿卜素含量改變。例如，Gady等[4]研究發(fā)現(xiàn)，番茄中PSY1基因單氨基酸位點變化，導(dǎo)致番茄紅素和β-胡蘿卜素合成緩慢。洪敏等[5]克隆了枇杷中的PSY基因，表明PSY基因可能參與其類胡蘿卜素的合成調(diào)控。程潔等[6]從甘薯中克隆到PSY基因，在擬南芥中超表達(dá)PSY基因后，葉片中的類胡蘿卜素含量明顯提高。李永平等[7-8]從黃秋葵中克隆到PSY和LCYB基因，揭示了PSY和LCYB基因表達(dá)和類胡蘿卜素積累的特性。Pogson等[9]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中編碼LCYE基因LUT2，其lut2突變體表現(xiàn)為葉黃素缺失型，同時β-胡蘿卜素含量大量積累。韓璇等[10]從矮牽牛中克隆到PhLcyB基因，發(fā)現(xiàn)其對矮牽牛葉片中類胡蘿卜素的代謝調(diào)節(jié)有重要作用。此外，一些轉(zhuǎn)錄因子如MYB、bHLH、ARF以及APRR2、Or等基因，也可以通過調(diào)控類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，間接影響類胡蘿卜素的積累[11-14]?？偠灾?，植物體內(nèi)主要是通過直接或間接調(diào)控類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)，從而影響類胡蘿卜素的積累，最終使植物呈現(xiàn)不同色澤。

瓜類類胡蘿卜素積累相關(guān)基因克隆研究已取得一定的進(jìn)展。呂品等[15]從西瓜果實中克隆到ClPSY基因，推測ClPSY基因主要負(fù)責(zé)果實中類胡蘿卜素的合成。吳川等[16]也從紅肉西瓜中克隆到ClZDS基因。趙軍林等[17]在甜瓜中克隆到八氫番茄紅素脫氫酶CmPDS基因，且發(fā)現(xiàn)CmPDS基因隨果實的發(fā)育成熟，表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢。盡管如此，但仍有大量類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)基因未被克隆報道，尤其是關(guān)于西葫蘆果皮顏色積累的分子機(jī)制、黃皮決定基因等依然未知。

本研究通過對類胡蘿卜素合成代謝酶基因家族的鑒定、基因表達(dá)定量分析等，篩選并克隆西葫蘆類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)酶基因，比較其序列差異等，旨在為下一步揭示黃皮西葫蘆色素形成的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用白皮、黃皮西葫蘆材料均為高代自交系，于2020年春種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站大棚內(nèi)，于結(jié)果期分別選取2種材料授粉后0，2，6，10，20 d的果實果皮，迅速放于液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱備用。

1.2 西葫蘆類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)酶基因的鑒定及表達(dá)分析

在葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫GuGenDB中(http：//cucurbitgenomics.org/)[18]下載已經(jīng)注釋的西葫蘆類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)基因序列信息，進(jìn)一步使用pfam數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org/)[19]進(jìn)行結(jié)構(gòu)域篩選確認(rèn)。利用公開發(fā)表的Sweet REBA和Lady Godiva這2種不同顏色果皮材料不同發(fā)育時期果實果肉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[20]，分析類胡蘿卜素合成基因在不同發(fā)育時期果肉中的動態(tài)表達(dá)。根據(jù)基因表達(dá)量FPKM值[21]來呈現(xiàn)基因表達(dá)水平，并利用TBtools軟件[22]繪制基因表達(dá)熱圖。

1.3 qRT-PCR驗證

樣品總RNA的提取使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根，DP419)，使用2 × inNova Taq SYBR?Green qPCR Mix(With ROX)試劑盒(innovagene，SQ121-01)進(jìn)行PSY1和LCYE2基因qRT-PCR定量分析。試驗參照西葫蘆基因組序列(http：//cucurbitgenomics.org/)，利用NCBI網(wǎng)站上的Primer-BLAST工具設(shè)計PSY1和LCYE2基因特異性定量引物(表1)。以西葫蘆肌動蛋白Actin基因(GenBank登錄號MH211008)用作內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法對試驗結(jié)果進(jìn)行歸一化數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計相對表達(dá)量。

表1 引物名稱及其序列Tab.1 Primer name and sequence

1.4 基因克隆及序列分析

樣品總RNA的提取使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根，DP419)，cDNA的合成使用1stStrand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(innovagene，AR111-02)，具體操作步驟根據(jù)說明書進(jìn)行。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段(引物序列見表1)，并連接到pMD18-T載體上，挑取單菌落篩選、鑒定，并送至上海生工生物有限公司測序。利用SnapGene進(jìn)行基因序列比對分析。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用MEGA 7.0[23]軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining methed，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中，校驗參數(shù)Bootstrap值設(shè)置為1 000次，遺傳距離計算模型設(shè)置為P-distance，空位缺失數(shù)據(jù)的處理設(shè)置為Pairwise deletion。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素代謝酶基因的鑒定

通過對西葫蘆數(shù)據(jù)庫比對及pfam結(jié)構(gòu)域篩選，最終在西葫蘆基因組中共鑒定出48個類胡蘿卜素代謝酶基因，每類酶基因平均有3.46個拷貝。其中，NCED基因8個，ZEP基因6個，GGPPS、PSY和CCD基因各5個，LCYB、BCH和ECH基因各3個，PDS、CRTISO、LCYE以及VDE基因各2個，ZDS和NXS基因均只有1個(表2)。這48個基因中，除ZEP1和LCYB3基因僅能定位于未組裝的LG00染色體外，其余46個基因均分布在除了LG17和LG18之外的18條染色體上。大多數(shù)基因存在于基因密度較高的區(qū)域，其中，LG01和LG14染色體上基因數(shù)目最多，分別有6個；而LG02、LG06、LG08、LG09和LG20染色體上基因數(shù)目最少，分別只有1個。這些基因CDS的平均長度為1 395.75 bp，其中最長的是位于Cp4.1LG05染色體上的ZEP4(Cp4.1LG05g11360.1)，全長1 944 bp；而最短的是位于Cp4.1LG03上的NXS(Cp4.1LG03g06210.1)，全長693 bp。

表2 西葫蘆類胡蘿卜素代謝關(guān)鍵基因參考信息Tab.2 The information of key genes for carotenoid metabolism in zucchini

表2(續(xù))

2.2 不同發(fā)育時期類胡蘿卜素代謝基因表達(dá)模式分析

利用公開發(fā)表的Sweet REBA和Lady Godiva這2個材料不同發(fā)育時期果肉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析上述48個類胡蘿卜素代謝基因表達(dá)模式，結(jié)果表明(圖1)，GGPPS1、PDS、PSY2、LCYB2、LCYE2、BCH3、ECH3等基因在果實發(fā)育時期持續(xù)高水平表達(dá)，大多數(shù)CCD和NCED等基因在整個時期保持較低的表達(dá)水平；而PSY1、LCYE2等基因在2個材料間的表達(dá)水平動態(tài)變化差異相對較大，可能是由于2個材料中類胡蘿卜素含量差異較大，在果實類胡蘿卜素積累過程中起著關(guān)鍵性作用，是重點關(guān)注的對象。

R/LG表示2個西葫蘆材料Sweet REBA/Lady Godiva；5/10/15/20/40分別表示授粉后5，10，15，20，40 d的果實。R/LG represents two zucchini materials Sweet REBA/Lady Godiva；5/10/15/20/40 respectively represent the fruits at 5，10，15，20，40 d after pollination.

2.3 候選基因PSY1和LCYE2的qRT-PCR分析

進(jìn)一步對PSY1(Cp4.1LG13g05570.1)、LCYE2(Cp4.1LG11g11790.1)2個關(guān)鍵酶基因在白皮和黃皮西葫蘆果皮不同發(fā)育時期的qRT-PCR分析表明(圖2)，PSY1基因隨著授粉后果實發(fā)育在白皮西葫蘆中的表達(dá)水平總體呈逐漸降低趨勢，而在黃皮西葫蘆中總體呈現(xiàn)波動式上升趨勢，尤其是在10 d表達(dá)量差異達(dá)到最大值，約為白皮西葫蘆同期的10倍(圖2-A)。LCYE2基因在白皮西葫蘆中的表達(dá)水平一直處于相對較低水平，且逐漸降低，而在黃皮西葫蘆中的表達(dá)水平逐漸升高，且在6 d及以后差異不斷放大，遠(yuǎn)高于白皮西葫蘆，在20 d時黃皮西葫蘆中的LCYE2基因表達(dá)量已達(dá)到白皮西葫蘆的40倍(圖2-B)。由此可見，隨著果實發(fā)育除PSY1基因0 d和LCYE2基因2 d外，其他時間點基因的表達(dá)水平都呈現(xiàn)出黃皮西葫蘆高于白皮西葫蘆的趨勢。這2個基因在整個果實發(fā)育時期，尤其在10 d后的果實顯著轉(zhuǎn)色時期起著決定性作用。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different lowercase indicate significant difference(P<0.05).

2.4PSY1和LCYE2基因的克隆及序列分析

分別提取白皮、黃皮西葫蘆的總RNA，合成cDNA一鏈，并以此為模板，擴(kuò)增西葫蘆的PSY1、LCYE2基因，分別得到約1 200 bp(圖3-A)和1 800 bp(圖3-B)的條帶，與預(yù)期結(jié)果基本一致。隨后的克隆測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，西葫蘆PSY1、LCYE2基因分別編碼1 263，1 602 bp的開放閱讀框。與已公布的西葫蘆基因組PSY1基因由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成不一致的是，所克隆的白皮西葫蘆PSY1(W)和黃皮西葫蘆PSY1(Y)基因編碼區(qū)序列比參考序列(1 212 bp)多出的51 bp是原本注釋為內(nèi)含子的一段片段(圖4-A)。與GenBank已報道的(登錄號：XM_023695146.1)序列一致，編碼一個完整的蛋白質(zhì)，比預(yù)測蛋白質(zhì)序列多出17個氨基酸，不改變其余部分蛋白質(zhì)編碼序列。將西葫蘆PSY1基因與其他瓜類的PSY1同源基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，同源性高達(dá)96%，且在其他瓜類的PSY1基因中發(fā)現(xiàn)均含有51 bp的外顯子區(qū)域(圖4-B)。

PSY1(W)來自白皮西葫蘆克隆，PSY1(Y)來自黃皮西葫蘆克??； LCYE2(W)來自白皮西葫蘆克隆，LCYE2(Y)來自黃皮西葫蘆克隆。M.DNA Marker DL2000。PSY1 (W)is cloned from white peeled zucchini， PSY1 (Y)is cloned from yellow peeled zucchini；LCYE2(W)is cloned from white peeled zucchini，LCYE2(Y)is cloned from yellow peeled zucchini.M.DNA Marker DL2000.

A.序列比對，Ref PSY1為參考序列，PSY1(W)為白皮西葫蘆PSY1，PSY1(Y)為黃皮西葫蘆PSY1；B.不同瓜類PSY1基因序列比對。A.Sequence alignment，Ref PSY1 is the reference sequence，PSY1 (W)is white peeled zucchini PSY1， PSY1 (Y)is yellow peeled zucchini PSY1；B.Sequence alignment of PSY1 gene in different cucurbits.

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

進(jìn)一步應(yīng)用MEGA 7.0軟件構(gòu)建PSY1基因與其他物種的PSY蛋白之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明(圖5)，西葫蘆與中國南瓜的親緣關(guān)系最近，相似度高達(dá)98.80%。另一個LCYE2基因由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成，外顯子大小為103～300 bp不等，測序結(jié)果與基因組序列結(jié)構(gòu)一致，無點突變和氨基酸差異。

圖5 西葫蘆PSY1基因與其植物PSY基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of PSY1 gene in zucchini and PSY genes in other plants

3 結(jié)論與討論

果皮顏色是西葫蘆重要的農(nóng)藝性狀之一，其類胡蘿卜素含量與西葫蘆的皮色密切相關(guān)。而PSY和LYCE基因是類胡蘿卜素合成代謝的關(guān)鍵酶基因之一。郭新倫[24]研究發(fā)現(xiàn)，PSY基因在牛奶子(ElaeagnusumbellateThunb.)果實成熟期間表達(dá)量持續(xù)升高，除番茄紅素外的其他類胡蘿卜素含量逐漸下降或消失，說明牛奶子果實中番茄紅素的積累是類胡蘿卜素代謝途徑各基因協(xié)同作用的結(jié)果。Guo等[25]研究發(fā)現(xiàn)，紅肉西瓜中PSY1的表達(dá)與番茄紅素積累呈正相關(guān)。Obrero等[26]對白皮、綠皮和黃皮西葫蘆栽培品種比較觀測發(fā)現(xiàn)，果皮和果肉顏色都與類胡蘿卜素積累相關(guān)，PSY基因在橙黃皮西葫蘆中表達(dá)量高于白皮和綠皮西葫蘆；通過qRT-PCR確定番茄紅素ε環(huán)化酶LCYe基因的轉(zhuǎn)錄水平與果皮果肉中類胡蘿卜素的積累高度相關(guān)，且LCYE基因在橙黃皮和綠皮西葫蘆中表達(dá)量高于白皮西葫蘆，而在白皮西葫蘆中幾乎不表達(dá)。李靜文等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在芹菜中AgLCYE基因的表達(dá)量隨著生長期的增加逐漸升高，葉柄中逐漸降低。余磊等[28]從三紅蜜柚中克隆到PSY、PDS、ZDS、LCYB基因，發(fā)現(xiàn)這些基因在果實生長發(fā)育過程中呈現(xiàn)增長或先增后降的趨勢，且在成熟期表達(dá)量最高。與Obrero等[26]的研究結(jié)果基本一致，本研究發(fā)現(xiàn)，PSY1基因在白皮西葫蘆中的表達(dá)量逐漸降低，而黃皮西葫蘆中的表達(dá)量呈現(xiàn)波動式上升趨勢，在授粉10 d時表達(dá)量最高，且黃皮西葫蘆中的表達(dá)量高于白皮西葫蘆同期。LCYE2基因在白皮西葫蘆中的表達(dá)一直處于較低水平且逐漸降低，而在黃皮西葫蘆中隨著果實發(fā)育逐漸升高，預(yù)示著PSY1和LCYE2基因在黃皮西葫蘆色素積累過程中起著重要作用。

已經(jīng)公開的基因組序列為研究者進(jìn)行基因定位、克隆等提供了很多便利，但所預(yù)測序列可能有所偏差。本研究發(fā)現(xiàn)，從2種不同果色西葫蘆中克隆到的PSY1基因均與已經(jīng)報道GenBank(登錄號：XM_023695146.1)預(yù)測序列基本一致，但比參考基因組預(yù)測的CDS序列多了一個51 bp的外顯子。擴(kuò)大比對群體，將西葫蘆的PSY1基因與其他瓜類同源基因進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，其余瓜類也都含有51 bp的外顯子區(qū)域，因此，西葫蘆數(shù)據(jù)庫中所預(yù)測的PSY1基因?qū)⑦@51 bp視為含子而忽略。因此，有時候生物信息學(xué)預(yù)測的CDS序列仍需要通過實際試驗來驗證。

綜上所述，本研究從西葫蘆參考基因組中鑒定了48個類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)酶基因，進(jìn)一步通過表達(dá)定量等篩選并克隆出PSY1、LCYE2等2個關(guān)鍵基因，下一步將進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化等研究揭示基因功能，為后期進(jìn)行黃皮西葫蘆類胡蘿卜素積累的分子機(jī)制的解析奠定基礎(chǔ)。