張淑艷，章紹兵，陳 林，張語青

河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

花生在我國種植面積廣闊[1]，主要分布于黃淮流域、東南沿海與長江流域。近年花生的需求量不斷增加，同時產(chǎn)量也在不斷攀升?；ㄉ鞍资且环N優(yōu)質(zhì)蛋白，富含氨基酸，具有較高的營養(yǎng)價值[2]。研究表明，由于分子結(jié)構(gòu)差異，花生蛋白的溶解性、乳化性和凝膠性等重要功能特性均無法和大豆蛋白相媲美，導致其在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到了很大限制[3]。

近年來研究人員通過物理[4-6]、化學[7-8]以及酶[9-11]等多種方法對花生蛋白進行改性并取得了一定進展。其中高場強超聲處理作為一種新型非熱技術(shù)，具有快速、高效等特點。超聲波技術(shù)的主要原理是通過空化泡、加熱、動態(tài)攪動、剪切力和湍流等物理效應(yīng)作用于改性對象[12]。Zhang等[6]將花生蛋白(8 g/L)超聲處理后，發(fā)現(xiàn)亞基條帶并未改變，內(nèi)源熒光光譜與表面疏水性有所變化；黃六容等[13]超聲處理花生蛋白(0.01 g/mL)后，熒光光譜顯示蛋白分子有所展開，二級結(jié)構(gòu)中β-折疊含量減少；張文等[14]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理花生蛋白(6 g/L)后，花生蛋白在66.2 kDa 附近條帶增加，且在14.4 kDa處生成新條帶，α-螺旋含量降低。雖然目前針對花生蛋白已開展了較多的超聲改性研究，但研究結(jié)論尚存在一定差異。對蛋白進行超聲處理時，樣品濃度可能是影響改性效果的重要因素，如同樣是針對乳清蛋白進行研究，Jambrak等[15]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)亞基超聲后發(fā)生明顯降解，而O′Sullivan等[16]卻報道亞基無變化，比較研究方法可知，他們在超聲處理乳清蛋白時樣品濃度相差了100倍。

目前在蛋白質(zhì)超聲改性研究中，通過改變超聲時間、功率和環(huán)境條件(熱、離子強度和pH值等)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的報道較多，但蛋白質(zhì)濃度對超聲改性效果的影響仍然未知。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，只有掌握蛋白質(zhì)經(jīng)超聲處理后結(jié)構(gòu)的變化，才能使其在食品加工中得到合理應(yīng)用。作者以花生蛋白為研究對象，在固定超聲處理強度的基礎(chǔ)上，改變超聲體系中蛋白與水的質(zhì)量體積比(以下簡稱蛋白濃度)，研究花生蛋白的濃度對其分子結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生：市售。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒：合肥新恩源生物技術(shù)有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸(ANS): 上海源葉生物科技有限公司 ；十二烷基硫酸鈉(SDS)：天津市天力化學試劑有限公司；5，5′-二硫代-雙-2-硝基苯甲酸(DTNB):上海索萊寶生物科技有限公司；鹽酸胍：上海麥克林生化科技有限公司；溴化鉀、三氯乙酸、尿素、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、乙腈(色譜純)：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技有限公司；G9800A 熒光分光光度計、Agilent 1260高效液相色譜: 美國安捷倫有限公司；BT-9300S激光粒度分布儀:丹東百特儀器有限公司；Tensor II傅里葉紅外光譜儀：德國Bruker公司；TSKgel GMPWXL色譜柱：日本Tokyo公司；Zeta sizer Nano ZS90納米粒度電位儀：英國馬爾文。

1.3 花生蛋白的提取

將適量花生放入粉碎機，打成花生漿，放置48 h后備用。按照m(花生漿)∶V(蒸餾水)=1∶ 6(g/mL)混合攪勻，用2 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)漿液pH值為10，再將漿液于50 ℃恒溫水浴鍋中150 r/min振蕩30 min，4 000 r/min離心15 min去除上層油、乳以及沉淀得水相。調(diào)節(jié)pH值為4.5，使蛋白酸沉析出，水洗2次后4 000 r/min離心10 min得到花生蛋白(PPI)，冷凍干燥后備用。

1.4 花生蛋白的超聲處理

取適量冷凍干燥后的花生蛋白，加入蒸餾水分別配制成0.005、0.010、0.050、0.100、0.150 g/mL花生蛋白溶液，為使花生蛋白充分溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0。將探頭插入花生蛋白液面下2 cm處，冰水浴控溫，超聲功率400 W，時間5 min(工作2 s，間歇3 s)?；ㄉ鞍讟右撼曁幚砗罄鋬龈稍?，備用。對照組的花生蛋白濃度為0.010 g/mL，未經(jīng)超聲處理。

1.5 花生蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的測定

1.5.1 SDS-PAGE

采用文獻[17]的方法并稍加改動。配制樣品為3 mg/mL，樣液與蛋白上樣緩沖溶液各10 μL等體積混合，沸水浴5 min，濃縮膠中電壓80 mV，分離膠中電壓120 mV。待電泳完成后考馬斯亮藍染色2 h，脫色液脫色后觀察亞基條帶情況。

1.5.2 表面疏水性的測定

采用文獻[18]的方法并稍加改動，用熒光探針法測定樣品表面疏水性。將蛋白樣品溶解于pH 8的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，配制樣液濃度為0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mg/mL。取4 mL不同濃度蛋白樣液分別加入20 μL ANS(8 mmol/L)充分混勻。激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長480 nm下測定樣液熒光吸收強度。以熒光強度對蛋白濃度作圖，斜率表示該樣品的表面疏水性。

1.5.3 內(nèi)源熒光光譜的測定

采用文獻[19]的方法并稍加改動，測定蛋白樣品內(nèi)源光譜圖。將蛋白樣品溶解于pH 8的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，稀釋蛋白至合適濃度，取適量樣液，在激發(fā)波長290 nm、掃描范圍300～400 nm條件下，記錄最大發(fā)射波長(λmax)。

1.5.4 暴露游離巰基與二硫鍵的測定

采用文獻[20]的方法并稍加改動，將蛋白樣品溶解于Tris-Gly 緩沖溶液，充分溶解后5 000 r/min離心15 min，取上清液測定蛋白濃度。向3 mL的上清液中加入50 μL 4 mg/mL DTNB溶液，混勻后室溫放置1 h，以緩沖溶液為空白對照，在412 nm處測定吸光度。暴露游離巰基含量按照公式(1)計算。

(1)

式中：A412為吸光度；C為樣品蛋白濃度，mg/mL。

采用文獻[21]的方法并稍加改動，30 mg蛋白樣品加入4.7 g鹽酸胍，用Tris-Gly 緩沖溶液定容至10 mL。取1 mL樣液加入4 mL脲-鹽酸胍溶液和50 μL Ellman試劑，412 nm處測定吸光度，根據(jù)公式(2)計算游離巰基含量。

(2)

式中：D為稀釋倍數(shù)。

取1 mL樣液加入50 μLβ-巰基乙醇和4 mL脲-鹽酸胍溶液，25 ℃放置1 h，加入10 mL 12%的三氯乙酸，25 ℃放置1 h，5 000 r/min離心15 min，將沉淀用12%三氯乙酸洗滌2次后溶于5 mL的8 mol/L尿素中，待沉淀完全溶解加入40 μL Ellman試劑，412 nm處測定吸光度，根據(jù)公式(2)計算出總巰基含量，根據(jù)公式(3)計算二硫鍵含量。

(3)

1.5.5 二級結(jié)構(gòu)的測定

花生蛋白二級結(jié)構(gòu)采用傅里葉紅外光譜儀測定。充分烘干的溴化鉀與蛋白樣品按照質(zhì)量比100∶ 1充分研磨混勻壓片，掃描波數(shù)范圍400～4 000 cm-1。測定結(jié)果采用Peak Fit 4.12軟件進行分析處理。

1.5.6 粒徑的測定

采用納米粒度電位儀測定可溶性蛋白樣品粒徑。將蛋白樣品溶解于pH 8的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，充分溶解后5 000 r/min離心15 min，取上清液測定蛋白含量(考馬斯亮藍法)，稀釋上清液至合適濃度，取1.2 mL樣液于粒徑儀測定。由儀器自帶軟件處理后可得出花生蛋白平均粒徑和多分散性指數(shù)(polydispersity index，PDI)。

1.5.7 花生蛋白分子量的分布測定

選用TSKgel GMPWXL柱子對蛋白樣品進行HPLC分離。流動相采用V(0.1 mol/L 磷酸緩沖液+0.1 mol/L 硫酸鈉)∶V(乙腈)=8∶ 2。測定前，所有蛋白質(zhì)樣品均通過0.45 μm膜過濾，進樣量為20 μL，采樣時間60 min，蛋白質(zhì)的檢測波長280 nm。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有試驗至少重復2次，數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，采用SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進行Duncan方差分析(P<0.05)，采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲處理下不同蛋白濃度對花生蛋白亞基組成的影響

目前有關(guān)花生蛋白亞基組成在超聲處理前后變化的研究結(jié)論并不一致，研究者使用的花生蛋白濃度也各不相同。由圖1可知，與對照組的花生蛋白相比，超聲處理下各濃度的花生蛋白并沒有產(chǎn)生新的亞基條帶，同時也沒有亞基條帶的消失(在更高超聲強度下處理也是如此，結(jié)果未展示)?？梢?，超聲處理下無論體系中蛋白濃度如何變化，均不能使花生蛋白分子酰胺鍵斷裂，這與Zhang等[6]的研究結(jié)論一致。

注：M為標準分子質(zhì)量蛋白；1為對照組花生蛋白；2—6為400 W 超聲處理5 min的花生蛋白(蛋白濃度分別為0.005、0.010、 0.050、0.100、0.150 g/mL)。圖1 不同濃度花生蛋白超聲處理后的亞基組成Fig.1 Subunit composition of peanut protein with different concentrations after ultrasonic treatment

2.2 超聲處理下不同蛋白濃度對花生蛋白表面疏水性和內(nèi)源熒光光譜的影響

如圖2所示，超聲處理后的花生蛋白表面疏水性明顯改變。與對照組花生蛋白相比，400 W條件下低濃度蛋白(0.005、0.010、0.050 g/mL)超聲處理5 min后表面疏水性略有增加；而0.100 g/mL的花生蛋白經(jīng)同等超聲強度處理后，表面疏水性顯著增加；隨著花生蛋白濃度的增大，蛋白表面疏水性反而下降。此外，與對照組花生蛋白的內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長(329 nm)相比，不同濃度的花生蛋白經(jīng)超聲處理后，只有0.100 g/mL花生蛋白的λmax(331 nm)發(fā)生了明顯紅移。超聲波的作用機理主要是空穴效應(yīng)，在超聲過程中空化泡不斷炸裂并循環(huán)往復。導致低濃度時蛋白表面疏水性和λmax改變不明顯的原因可能是：此時的低濃度蛋白體系不適合產(chǎn)生強烈的空穴效應(yīng)；即使空穴效應(yīng)強烈，但體系中蛋白分子數(shù)量較少時對空穴效應(yīng)有逃避的可能。而當?shù)鞍诐舛冗^高時(如0.150 g/mL)，體系黏度也隨之顯著增加，會影響空化泡的形成，此時同樣不利于蛋白質(zhì)的改性。說明在過低或過高的蛋白濃度下，超聲波不會顯著改變花生蛋白的表面疏水性和內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3、圖4同。圖2 不同濃度花生蛋白超聲處理后的 表面疏水性和內(nèi)源熒光發(fā)射波長Fig.2 Surface hydrophobicity and endogenous fluorescence emission wavelengths of peanut protein with different concentrations treated by ultrasound

圖3 不同濃度花生蛋白超聲處理后的暴露游離 巰基與二硫鍵含量Fig.3 Content of exposed free sulfhydryl groups and disulfide bonds after ultrasonic treatment of peanut protein with different concentrations

2.3 超聲處理下不同蛋白濃度對花生蛋白暴露游離巰基與二硫鍵含量的影響

暴露游離巰基的含量可以反映蛋白結(jié)構(gòu)的變化。如圖3所示，同等強度超聲處理后，與對照組花生蛋白相比，各個濃度超聲處理后花生蛋白的暴露游離巰基含量均顯著增加，應(yīng)該是蛋白分子展開所致，這與李俠等[22-23]對花生蛋白超聲處理的研究結(jié)果一致。蛋白濃度0.005～0.100 g/mL時，超聲處理后暴露游離巰基含量逐漸增大，在0.100 g/mL時達到最大；當濃度增大到0.150 g/mL時，暴露游離巰基含量有所下降，這與表面疏水性的改變趨勢一致，進一步說明在蛋白濃度0.100 g/mL進行超聲處理時，花生蛋白分子的展開程度最高。

對于蛋白質(zhì)而言，半胱氨酸殘基中的巰基可以與二硫鍵相互轉(zhuǎn)化。蛋白分子可以通過二硫鍵連接形成更大的蛋白聚集體。如圖3所示，同等強度超聲處理后，與對照組花生蛋白相比，各個濃度超聲處理后花生蛋白的二硫鍵數(shù)量都有所增加，其中以0.010 g/mL的花生蛋白超聲處理后二硫鍵含量增加最為顯著。說明超聲促使蛋白表面游離巰基含量增加后，這些游離巰基之間還發(fā)生了部分交聯(lián)。

2.4 超聲處理下不同蛋白濃度對花生蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

通過紅外光譜圖中酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化，一般認為：β-折疊(1 600～1 640 cm-1)，無規(guī)則卷曲(1 640～1 650 cm-1)，α-螺旋(1 650～1 660 cm-1)，β-轉(zhuǎn)角(1 660～1 700 cm-1)[24]。由表1所得到的二級結(jié)構(gòu)分布可知，不同濃度花生蛋白經(jīng)超聲處理后與對照組花生蛋白相比，α-螺旋與無規(guī)則卷曲含量不存在顯著性差異，但0.010 g/mL蛋白濃度處理時β-折疊含量顯著下降，β-轉(zhuǎn)角含量顯著增加。說明該蛋白濃度下超聲破壞了部分β-折疊片中的氫鍵，促使其多肽鏈反轉(zhuǎn)180°形成了β-轉(zhuǎn)角[25]?？傮w來說，花生蛋白在超聲后二級結(jié)構(gòu)變化較小，這可能與超聲強度較弱有關(guān)。

表1 不同濃度花生蛋白超聲處理后的二級結(jié)構(gòu)分布Table 1 Secondary structure distribution of peanut protein with different concentrations after ultrasonic treatment

2.5 超聲處理下不同蛋白濃度對花生蛋白粒徑的影響

圖4 不同濃度花生蛋白超聲 處理后的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of peanut protein with different concentrations after ultrasonic treatment

由圖4可知，對照組蛋白和0.005 g/mL超聲處理的可溶性蛋白粒徑分布相對集中，主要呈現(xiàn)1個大峰，而超聲處理下其他濃度的蛋白粒徑分布主要呈現(xiàn)2個大峰。由表2可知，對照組花生蛋白分子的平均粒徑164.47 nm，經(jīng)過超聲處理后，各個濃度的花生蛋白的平均粒徑均顯著增大，在花生蛋白濃度0.100 g/mL時，超聲處理后的蛋白粒徑達到263.23 nm，可能原因是此時蛋白分子充分展開后暴露出更多的疏水基團(圖2)，分子間疏水相互作用增強導致蛋白質(zhì)分子聚集，平均粒徑隨之增加。PDI可以反映所測定樣品體系中粒徑的分布情況，數(shù)值越小代表該樣品分布比較均勻。0.005 g/mL花生蛋白經(jīng)過超聲處理后PDI最小，說明該濃度下蛋白超聲后粒徑分布最均勻。值得注意的是，目前也有關(guān)于蛋白質(zhì)在超聲后粒徑減小的研究報道[26-27]，這很有可能與研究者采用的超聲強度不同有關(guān)。嘗試在更高超聲強度下(500 W，5 min)處理花生蛋白，發(fā)現(xiàn)其平均粒徑減小，這說明高超聲強度雖然不會使蛋白亞基發(fā)生降解，但可能會通過破壞亞基間疏水相互作用導致其相互離解。

表2 不同濃度花生蛋白超聲處理后的平均 粒徑與PDITable 2 Average particle size and PDI of peanut protein with different concentrations after ultrasonic treatment

2.6 超聲處理下不同蛋白濃度對花生蛋白分子量分布的影響

如圖5所示，根據(jù)分子排阻高效液相色譜測定，對照組花生蛋白按分子量不同分為P1、P2和P3三大類組分，不同濃度的蛋白超聲處理后主要組分的出峰時間明顯前移，表明有更大分子量的新組分(可溶性蛋白聚集體)生成，這也和蛋白粒徑分布測定的結(jié)果(圖4)相互印證，說明適當強度的超聲處理可以促使花生蛋白發(fā)生聚集，分子量增加，與Jiang等[28]的報道一致。由于樣品在測定前通過了0.45 μm膜過濾，一些具有更大粒徑(如超過500 nm)的蛋白聚集體在液相色譜圖上得不到體現(xiàn)。不同濃度的蛋白色譜圖之間差異并不大，但對0.005 g/mL蛋白進行超聲處理時，蛋白分子量的增加幅度略小。此外，花生蛋白經(jīng)超聲處理后出現(xiàn)了少量更低分子量的組分，說明在此超聲強度作用下，雖然蛋白亞基聚集的現(xiàn)象更加明顯，但同時也會有少量亞基從原有蛋白寡聚體中發(fā)生解離。因此，可以推斷花生蛋白在超聲作用下亞基的聚集和解離現(xiàn)象同時存在，究竟以哪種現(xiàn)象為主則與超聲強度有關(guān)。

圖5 不同濃度花生蛋白超聲處理后的 分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution of peanut protein with different concentrations after ultrasonic treatment

3 結(jié)論

在本研究的超聲體系中，無論蛋白濃度高低，都不能使花生蛋白亞基發(fā)生降解，然而蛋白濃度對其他結(jié)構(gòu)特性(表面疏水性、內(nèi)源熒光光譜、暴露游離巰基含量和二級結(jié)構(gòu))有顯著影響。在低超聲強度下各個濃度花生蛋白的平均粒徑均顯著增大，在高超聲強度下平均粒徑則顯著減小。在超聲過程中蛋白分子聚集和亞基解離現(xiàn)象同時存在，低強度超聲主要引起分子聚集(可能通過暴露的活性基團相互作用)，高強度超聲主要引起亞基解離(可能通過破壞分子內(nèi)/間的非共價作用力)。已有關(guān)于蛋白超聲改性的研究選用的蛋白濃度較低，本研究發(fā)現(xiàn)一定超聲強度下，蛋白濃度會顯著影響超聲改性效果，因此，為達到蛋白分子結(jié)構(gòu)特性的預(yù)期改性目標，超聲時選擇合適的蛋白濃度十分重要。