劉 雨，席 輝，付英杰，李 鵬，盧斌斌，孫世豪，宗永立

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001

天然香料是以植物、動物或微生物為原料，經(jīng)物理方法、酶法、微生物法或傳統(tǒng)的食品工藝法加工制得，在食品、化妝品、煙草和醫(yī)療等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1-4]。天然香料作為添加劑中非常重要的一類，在食品和化妝品中應(yīng)用廣泛，例如浸膏和濃縮物等因其優(yōu)異的感官特性，廣泛用于化妝品和香皂等的生產(chǎn)中[5]；精油可以作為呈味劑、保鮮劑和抗菌劑豐富食品的風(fēng)味并延長保質(zhì)期[6-8]。水溶性糖是天然香料化學(xué)構(gòu)成中的重要一類，主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖醇、山梨糖醇、麥芽糖、麥芽三糖和肌糖醇等[9-13]。研究表明：果糖、山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖影響食品的硬度、嚼勁、彈性等質(zhì)構(gòu)特性[14-15]；水溶性糖可與水和香氣化合物相互作用，通過鹽析效應(yīng)、疏水相互作用和氫鍵等影響香氣化合物的釋放，進而影響果汁和飲料的香氣和風(fēng)味[16-17]。因此，水溶性糖與天然香料和食品的感官品質(zhì)特征聯(lián)系密切。

天然香料中水溶性糖的分布特征通常受到原料種類和提取方式等因素的影響[18]，了解其分布特征對于天然香料的實際應(yīng)用和品質(zhì)評價具有重要的指導(dǎo)意義[19-20]，但相關(guān)的研究報道并不多。水溶性糖的分析檢測主要是采用氣相色譜-質(zhì)譜法[21-22]、高效薄層色譜法[23]、高效液相色譜(HPLC)法[24-25]和核磁共振氫譜法[26-27]等技術(shù)，其中HPLC法因為前處理簡單、準(zhǔn)確度高和重復(fù)性好得到較多關(guān)注。基于此，作者以自制天然香料為研究對象，建立天然香料中常見的8種水溶性糖的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)同步分析方法，考察了市售天然香料中水溶性糖的分布特征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然香料樣品：櫻桃汁濃縮物、樹苔浸膏、菊苣浸膏、巴拉圭茶提取物、大棗提取物、山楂酊、圓柚精油、桂花精油、西梅提取物、玫瑰精油、玫瑰凈油和紫羅蘭凈油均由實驗室自制；菠蘿汁濃縮物、蘋果汁濃縮物、紅棗凈油1、葫蘆巴凈油、香莢蘭凈油、丁香花蕾油、茉莉浸膏、甜橙精油和樹蘭花酊：愛普香料集團股份有限公司；葡萄汁濃縮物、楊梅汁濃縮物、酸棗浸膏、西梅浸膏、樹苔提取物、紫花苜蓿提取物、棗子酊劑、茶花酊、無花果精油1和紅棗凈油2：上海致樸實業(yè)有限公司；黑加侖濃縮物、春黃菊浸膏、香蘭葉浸膏、無花果提取物、菊苣提取物、烏梅酊、檸檬精油、無花果精油2和蠟菊凈油：上海祺源香精香料有限公司；桂花浸膏、大棗提取物、獨活酊、苦杏仁精油、樹苔凈油和蕓香凈油：江西寶林天然香料有限公司。存放條件：(4.0±0.5)℃、RH(85±2)%。

乙腈(色譜純) ：德國Meker公司；果糖(純度≥99%)、葡萄糖(純度≥99.5%)、蔗糖(純度≥99.5%)、麥芽糖一水合物(純度≥99%)、麥芽三糖(純度≥99%)、肌糖醇(純度≥99%)、山梨糖醇(純度≥99%)：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000液相色譜儀、超純水儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；2000ES ELSD檢測器：美國Alltech公司；Prevail Carbohydrate ES色譜柱(5 μm, 250 mm×4.6 mm)：美國Grace公司；CP2245電子天平(感量0.000 1 g)：德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Prevail Carbohydrate ES色譜柱(5 μm, 250 mm × 4.6 mm)；流動相：乙腈和水；梯度洗脫：80%乙腈+20%水 (0 min)，80%乙腈+20%水(20 min)，75%乙腈+25%水(24 min)，55%乙腈+45%水(26 min)，55%乙腈+45%水(33 min)，80%乙腈+20%水 (37 min)，80%乙腈+20%水 (40 min)；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；ELSD：漂移管80 ℃；氮氣流量：2.2 L/min。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確稱取8種水溶性糖于25 mL容量瓶中，使用超純水定容，混勻得到標(biāo)準(zhǔn)儲備液，其中阿拉伯糖醇、山梨糖醇、肌糖醇、麥芽糖和麥芽三糖質(zhì)量濃度分別為15.00 mg/mL，果糖、葡萄糖和蔗糖質(zhì)量濃度分別為20.00 mg/mL；阿拉伯糖醇、山梨糖醇、肌糖醇、麥芽糖和麥芽三糖梯度稀釋，分別配制7.5、15、30、75、300、600、1 500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，果糖、葡萄糖和蔗糖梯度稀釋，分別配制10、20、40、100、400、800、2 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 樣品前處理

稱取待測天然香料樣品0.100 0 g于50 mL離心管中，加入25 mL超純水，室溫條件下超聲萃取15 min。提取液6 000 r/min離心10 min。取水相清液1 mL經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，作為進樣溶液，進行阿拉伯糖醇、果糖、山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖、肌糖醇、麥芽糖和麥芽三糖的HPLC-ELSD定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行分析；使用SPSS 23.0對水溶性糖含量進行方差分析；使用Origin 2018對天然香料進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立HPLC-ELSD法分析水溶性糖

以阿拉伯糖醇、果糖、山梨糖醇、肌糖醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽三糖等8種水溶性糖為目標(biāo)物，在之前的工作基礎(chǔ)上[28]，采用Prevail Carbohydrate ES色譜柱，進一步優(yōu)化色譜條件，建立了分析水溶性糖的HPLC-ELSD方法。該方法可以將8種水溶性糖較好地分開，且峰形尖銳、對稱、無拖尾現(xiàn)象(圖1)，對天然香料初步分析的結(jié)果顯示，所選擇的8種水溶性糖在天然香料中均有分布。

1.阿拉伯糖醇；2.果糖；3.山梨糖醇；4.葡萄糖；5.蔗糖； 6.肌糖醇；7.麥芽糖；8.麥芽三糖圖1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和天然香料的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard working solution and homemade natural fragrance and flavor ingredient

2.2 方法學(xué)評價

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

以目標(biāo)化合物的色譜峰面積對質(zhì)量濃度進行回歸分析，得到8種水溶性糖的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)；分別以3倍的信噪比和10倍的信噪比為方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果見表1。8種水溶性糖均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 2～0.999 9；LOD和LOQ分別為2.07～4.20 μg/mL、6.90～14.00 μg/mL，可以滿足各目標(biāo)物的定量檢測需求。

2.2.2 精密度和回收率

選取基質(zhì)相對復(fù)雜的浸膏樣品，通過加標(biāo)的方式考察方法的回收率和精密度。由表2可知，8種水溶性糖加標(biāo)回收率在91.5%～98.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.06%～4.65%之間。說明本方法測定結(jié)果比較穩(wěn)定，適用于天然香料中水溶性糖的分析。

2.3 天然香料中水溶性糖的分布特征

采用建立的方法對46種天然香料中的水溶性糖含量進行測定，并對其進行描述性統(tǒng)計分析，結(jié)果如表3所示，天然香料中檢出頻次最高的水溶性糖為葡萄糖和果糖，其次是麥芽糖、阿拉伯糖醇、蔗糖、山梨糖醇和麥芽三糖，阿拉伯糖醇僅在樹苔浸膏和樹苔提取物中檢出，肌糖醇僅在菊苣浸膏中檢出。所測定天然香料中水溶性糖的變幅和變異系數(shù)均比較高，離散程度大，表明不同的天然香料中水溶性糖的分布差異較大。

表1 8種水溶性糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、LOD和LOQTable 1 Standard curves, linear ranges, LOD, and LOQ of 8 soluble sugars

表2 8種水溶性糖的加標(biāo)回收率(n=5)Table 2 Spiked recoveries of 8 soluble sugars (n=5)

表3 天然香料中水溶性糖含量的描述性分析Table 3 Descriptive analysis of soluble sugars in natural fragrance and ingredient

2.4 不同品類天然香料中水溶性糖的分布特征

根據(jù)GB/T 21171—2018，天然香料可分為凈油、精油、酊劑、提取物、濃縮物和浸膏等品類。按照相應(yīng)的定義，精油和凈油是從原料中提取得到的芳香油；酊劑是由可變濃度的乙醇或水浸漬原料得到的產(chǎn)物；浸膏、提取物和濃縮物在提取過程中均經(jīng)過濃縮。因此理論上精油和凈油類天然香料產(chǎn)品中不應(yīng)含有水溶性糖；酊劑類產(chǎn)品中可能不含或含有少量水溶性糖；而浸膏、提取物和濃縮物類產(chǎn)品中可能含有較多的水溶性糖。

為了進一步考察不同品類天然香料中水溶性糖的實際分布特征，以天然香料中8種水溶性糖含量為變量，對46種天然香料進行聚類分析(圖2)。以歐式距離70為臨界值，總體上不同品類的天然香料可分為三大類，濃縮物、大部分提取物和部分浸膏為第1大類；精油、凈油、酊劑、部分浸膏和部分提取物為第2大類；樹苔浸膏和樹苔提取物為第3大類。

圖2 天然香料中水溶性糖含量的聚類分析樹狀圖Fig.2 Cluster tree analysis for soluble sugars content in natural fragrance and flavor ingredient

第1大類主要包括所有的濃縮物、酸棗浸膏、無花果浸膏、西梅浸膏、西梅提取物、大棗提取物、無花果提取物、無花果精油1和紅棗凈油1，其表現(xiàn)為含有大量水溶性糖。但是凈油和精油中不應(yīng)含有水溶性糖，這提示無花果精油1和紅棗凈油1可能存在標(biāo)簽誤貼或命名錯誤。第2大類主要包括精油、凈油、酊劑等不含有或含有少量水溶性糖的天然香料。以歐式距離45為臨界值，第2大類又可以分為3個亞類：第1亞類包括精油、凈油、桂花浸膏和茉莉花浸膏，其表現(xiàn)為不含水溶性糖，茉莉花浸膏和桂花浸膏通常是由有機溶劑提取得到[29-30]，所以被聚為第1亞類；第2亞類和第3亞類包括水溶性糖含量較低的浸膏、酊劑和提取物。第3大類包括樹苔浸膏和樹苔提取物，表現(xiàn)為僅含有阿拉伯糖醇，其僅天然存在于地衣和蘑菇中[13]，提示水溶性糖的分布特征或可作為天然香料真實性鑒別的依據(jù)。

不同品類天然香料中水溶性糖含量如表4所示，濃縮物中果糖(254.68 mg/g)和葡萄糖(217.02 mg/g)含量最高，其次是提取物和浸膏，酊劑中果糖和葡萄糖含量最低，分別為16.40 mg/g和18.99 mg/g。濃縮物中果糖和葡萄糖含量顯著高于其他品類市售天然香料中果糖和葡萄糖含量；浸膏和提取物中果糖和葡萄糖含量顯著高于酊劑中果糖和葡萄糖含量。不同品類天然香料中水溶性糖的分布特征或可作為天然香料品質(zhì)特征評價和真實性鑒別的指標(biāo)之一。

表4 不同品類天然香料中水溶性糖的含量Table 4 Content of soluble sugars in different species of natural fragrance and flavor ingredient

2.5 不同原料種類天然香料中水溶性糖的分布特征

根據(jù)原料種類不同，把不同品類天然香料進一步分為水果類香料和植物花葉類香料[31]，進一步探討水果類香料和花葉類香料中水溶性糖的分布特征(表5)。以水果為原料的香料中葡萄糖和果糖含量均高于以花葉為原料的天然香料，其他水溶性糖含量無顯著性差異。

表5 不同原料種類天然香料中水溶性糖的含量Table 5 Content of soluble sugars in natural fragrance and flavor ingredient with different raw materials

在以水果為原料的天然香料中，浸膏和提取物中果糖和葡萄糖含量顯著高于酊劑中果糖和葡萄糖含量，浸膏和提取物中果糖和葡萄糖含量無顯著性差異。提取物中果糖(269.50 mg/g)和葡萄糖(212.04 mg/g)含量最高，其次是浸膏，酊劑中果糖和葡萄糖含量最低，分別為32.81 mg/g和37.97 mg/g。在以花葉為原料的天然香料中，浸膏、酊劑和提取物中果糖和葡萄糖含量均無顯著性差異。浸膏和提取物中果糖和葡萄糖含量互有高低，酊劑中未檢出水溶性糖。不同原料種類天然香料中水溶性糖的分布特征對調(diào)香時天然香料的選用具有參考價值。

3 結(jié)論

本研究建立了一種同時測定天然香料中果糖、葡萄糖、阿拉伯糖醇、山梨糖醇、麥芽糖、麥芽三糖、肌糖醇和蔗糖的HPLC-ELSD分析方法。該方法檢出限低、重復(fù)性好、回收率高，分析性能良好，適用于天然香料中水溶性糖的分析。以往的研究工作大多聚焦于不同品種的相同物質(zhì)的水溶性糖的分布，本研究采用所建立的方法分析了不同品類和不同原料種類的天然香料。結(jié)果表明，天然香料中主要的水溶性糖是果糖和葡萄糖，天然香料中水溶性糖含量的變幅和變異系數(shù)均比較高，離散性大；濃縮物中果糖和葡萄糖含量顯著高于其他品類市售天然香料中果糖和葡萄糖含量；浸膏和提取物中果糖和葡萄糖含量顯著高于酊劑中果糖和葡萄糖含量。部分凈油和精油樣品中檢出大量水溶性糖，表明天然香料可能存在標(biāo)簽誤貼或命名混亂的現(xiàn)象。以水果為原料的香料中葡萄糖和果糖含量均高于以花葉為原料的天然香料，其他水溶性糖含量無顯著性差異，以花葉為原料的天然香料中，浸膏、酊劑和提取物中果糖和葡萄糖含量均無顯著性差異。天然香料中水溶性糖的分布特征對天然香料的品質(zhì)評價和實際應(yīng)用具有指導(dǎo)性意義，同時為建立天然香料液相色譜指紋圖譜真實性鑒別技術(shù)奠定了良好的工作基礎(chǔ)。