劉 悅，張 燦，高玲玲，張康逸，閆美慧，張國治*

1．河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001 2．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002

老面是選用小麥粉、大米、玉米粉、麩皮等谷物作為基底，以一定比例與水混合，經(jīng)過自然發(fā)酵風(fēng)干后形成，在北方大多沿用傳統(tǒng)老面酵頭發(fā)酵技術(shù)，賦予饅頭獨(dú)特的質(zhì)地和濃郁的風(fēng)味，深受消費(fèi)者的喜愛[1]。風(fēng)味作為饅頭的重要感官屬性之一，直接決定了消費(fèi)者對食品的選擇。

發(fā)酵米面制品中風(fēng)味物質(zhì)的形成主要有以下4種途徑：脂肪氧化、熱處理、微生物代謝及酶系生物轉(zhuǎn)化[2]。老面面團(tuán)具有復(fù)雜的生化體系，饅頭風(fēng)味物質(zhì)的形成離不開微生物的代謝參與。老面發(fā)酵過程中乳酸菌和酵母菌的單一作用或相互作用會產(chǎn)生風(fēng)味化合物[3]。研究表明老面面團(tuán)的發(fā)酵過程可有效降低脂肪氧化，一些乳酸菌可還原脂肪氧化化合物為相應(yīng)的醇類物質(zhì)[4-6]。酵母菌主要產(chǎn)生醇類物質(zhì)，乳酸菌則通過代謝作用產(chǎn)生酸類、呋喃類及少量醚類物質(zhì)[7-8]。Ripari等[9]還發(fā)現(xiàn)乳酸菌可代謝生成2-戊基呋喃、己酸、己醇以及酯類等風(fēng)味物質(zhì)。Plessas等[10]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)生多種酯類化合物，乳酸菌的繁殖與酯類物質(zhì)的生成具有相關(guān)性。此外，Stadie等[7,11]研究表明，老面發(fā)酵面團(tuán)中菌群間的相互競爭與促進(jìn)對風(fēng)味物質(zhì)的形成有較大關(guān)聯(lián)，環(huán)境的變化使得微生物產(chǎn)酶量與酶活性發(fā)生變化，從而影響香氣化合物的產(chǎn)生。

目前，對于老面饅頭的風(fēng)味、微生物多樣性以及不同類型老面對饅頭風(fēng)味的影響研究較多，然而，對其發(fā)酵過程中微生物菌群代謝作用與揮發(fā)性物質(zhì)間的關(guān)系研究相對較少。因此，作者基于老面對饅頭風(fēng)味的影響，旨在通過傳統(tǒng)培養(yǎng)、高通量測序結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)，分析發(fā)酵過程中菌群的動態(tài)變化與風(fēng)味物質(zhì)間的相關(guān)性，進(jìn)而探索老面饅頭風(fēng)味形成機(jī)制，為面制品風(fēng)味發(fā)酵研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

特一粉：河南金苑糧油有限公司；高活性干酵母、饅頭改良劑：安琪酵母股份有限公司；老面(原料為玉米面、面粉、米酒及甜瓜曲)：新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)憶味土特產(chǎn)；雙效泡打粉：桂林市紅星化工有限責(zé)任公司；白糖：廣州福正東海食品有限公司；仲辛醇：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器

MP 5002 電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HM 740海氏廚師機(jī)：青島漢尚品牌管理有限公司；FJ-YH面包醒發(fā)箱：廣東樂創(chuàng)電器有限公司；GC-7890A氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司；50/20 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭：美國色譜科公司；YXQ-LS-75S11立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；PB-10酸度計(jì)：德國賽多利斯有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵面團(tuán)的制備

L樣品：復(fù)配老面面團(tuán)(DY(dough yield)=面團(tuán)質(zhì)量×100/面粉質(zhì)量=153；水分含量39.9%)。和面(將面粉100 g、酵母1 g、泡打粉0.25 g、改良劑0.25 g、白砂糖0.25 g及老面水0.25 g混勻)→醒發(fā)(35 ℃，RH 85%，40 min)→取樣(醒發(fā)0、10、20、30、40 min時(shí)稱取)→裝袋，-40 ℃凍存。

A樣品：酵母發(fā)酵面團(tuán)(DY 153，水分含量39.0%)。制作方法參照L樣品，僅和面時(shí)未加老面水，其余均保持一致。

1.3.2 發(fā)酵面團(tuán)微生物檢測

1.3.2.1 微生物的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)與保存

參照GB 4789.2—2016測定發(fā)酵面團(tuán)中菌落總數(shù)，對平板培養(yǎng)中優(yōu)勢單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，-40 ℃保存。

1.3.2.2 微生物群落鑒定

參考邢小龍[12]的方法，菌株活化后采用DNA試劑盒提取細(xì)菌的DNA，進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.2.3 高通量序列分析

1.3.3 面團(tuán)pH值、總酸度和還原糖含量的測定

參考Liu等[14]的方法測定發(fā)酵面團(tuán)的pH值及總酸度(TTA)；采用3, 5-二硝基水楊酸法[15]測定發(fā)酵面團(tuán)的還原糖(RS)含量。

1.3.4 發(fā)酵面團(tuán)風(fēng)味物質(zhì)的測定與分析

采用GC-MS測定，內(nèi)標(biāo)物為仲辛醇(200 mg/L)，參數(shù)設(shè)置參照馮濤等[16]的方法，并稍加改動。

樣品前處理：稱取面團(tuán)3 g，加入10 μL 200 mg/L仲辛醇為內(nèi)標(biāo)物，老化30 min，吸附30 min，解吸6 min，進(jìn)樣檢測。

色譜條件：色譜毛細(xì)管柱為DB-5MS(60 mm×0.32 mm, 1 μm)；起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至180 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。載氣流量0.8 mL/min，壓力3.29×104Pa，進(jìn)樣口250 ℃，運(yùn)行41 min。

質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～450 m/z，溶劑延遲3 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Origin 8.0、Tukey’s、Hiplot分別進(jìn)行制圖、顯著性差異和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)發(fā)酵面團(tuán)中菌落總數(shù)的鑒定及理化指標(biāo)測定

2.1.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)分離細(xì)菌鑒定結(jié)果

由表1可知，A樣品菌落總數(shù)從初始的5.6×107CFU/g升至3.2×108CFU/g，L樣品從6.4×107CFU/g升至5.8×108CFU/g。A樣品中有桿菌屬和球菌屬，分別為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、檸檬色短小桿菌(Curtobacteriumcitreum)及腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)，并且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，腐生葡萄球菌逐漸成為優(yōu)勢物種，而檸檬色短小桿菌在20 min后逐漸被其他種群取代。添加老面后與未添加對比發(fā)現(xiàn)，有膠紅酵母屬(Mucilaginosaisolate)生長繁殖，并且菌屬逐漸增多，檸檬色短小桿菌成為優(yōu)勢菌種，與張國華[17]的研究結(jié)果一致。檸檬色短小桿菌多存在于小麥制品及水稻種子中，由于老面發(fā)酵工藝經(jīng)過玉米、小麥等雜糧混合后接種米酒等發(fā)酵培養(yǎng)，體系富含多種乳酸菌、醋酸菌，與A樣品相比，發(fā)酵力相對較弱，但發(fā)酵過程中的菌種代謝產(chǎn)生更多醛、酮、酯類等風(fēng)味物質(zhì)，使得蒸制饅頭口感質(zhì)地細(xì)膩，味道香醇可口[18]。

2.1.2 發(fā)酵面團(tuán)還原糖含量、總酸度、pH值的變化

面團(tuán)發(fā)酵中的糖類物質(zhì)來源分為3類：面團(tuán)多樣微生物分解中利用自身或發(fā)酵所產(chǎn)生；面團(tuán)中所含淀粉酶水解淀粉后產(chǎn)生；代謝所產(chǎn)生的熱量影響面團(tuán)體系糖平衡后產(chǎn)生[19]。由圖1a可知，A樣品RS變化呈現(xiàn)波動趨勢，在發(fā)酵10 min時(shí)達(dá)到最大值，L樣品呈先降低又升高而后降低的趨勢，在發(fā)酵20 min時(shí)達(dá)到峰值(1.13 g/100 g)，由于面粉中富含淀粉酶，在微生物生長至對數(shù)期時(shí)，淀粉酶活及水解能力最高，隨著細(xì)菌豐度、多樣性增加，RS生成速率高于消耗速率，導(dǎo)致RS含量增加，與李志建等[20]的研究結(jié)果一致。添加老面后，微生物體系多樣性增加，菌種利用面團(tuán)氧氣進(jìn)行有氧呼吸生成醋酸、CO2等酸性物質(zhì)，面團(tuán)產(chǎn)氣能力逐漸增強(qiáng)，pH值降低。由圖1b可知，隨著面團(tuán)酸性增強(qiáng)，嗜酸微生物乳酸菌、醋酸菌逐漸增多，L樣品pH值降到最低值(5.02)，此時(shí)還原糖含量為1.17 g/100 g。

表1 基于 16S rRNA 基因測序的細(xì)菌菌種鑒定Table 1 Identification of bacterial strains based on 16S rRNA gene sequencing CFU/g

圖1 面團(tuán)發(fā)酵過程中RS含量、TTA及pH值的變化Fig.1 Changes of RS and TTA content and pH value during dough fermentation

2.2 發(fā)酵面團(tuán)高通量測序鑒定細(xì)菌群落多樣性差異

2.2.1 樣本群落多樣性及豐度分析

由圖2a、2b可知，Rarefaction和 Shannon[21]曲線都趨于平坦，證明結(jié)果足以覆蓋所有的菌種信息。由圖2c可知，2種樣品曲線陡峭，表明物種分布不均勻，且物種之間的豐度存在差異。

2.2.2 α多樣性指數(shù)分析

由表2可知，Coverage指數(shù)均大于0.999，表明結(jié)果可反映樣品中的真實(shí)情況。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)在A樣品中呈先升高后降低趨勢，在L樣品中呈先降低再升高趨勢，說明在發(fā)酵過程中面團(tuán)內(nèi)物種的豐度可能是隨著發(fā)酵進(jìn)行而波動的，老面面團(tuán)中的乳酸菌在最適生長條件下生長繁殖，一些適宜在較低溫、中性環(huán)境下生長的菌屬逐漸消亡。

表2 發(fā)酵面團(tuán)樣品中細(xì)菌 α 多樣性分析Table 2 Analysis of bacterial α diversity in yeast dough samples

Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)反映發(fā)酵過程中物種多樣性變化趨勢，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，多樣性種類不確定性越大，表明物種多樣性高。 結(jié)合表1可知，在發(fā)酵初期，隨著菌落總數(shù)的升高，物種多樣性有所降低，隨發(fā)酵面團(tuán)pH值降低及溫度緩慢升高，一些耐酸、耐熱菌屬逐漸增多。發(fā)酵后期，細(xì)菌生長從對數(shù)期進(jìn)入穩(wěn)定期，生長速率不變，菌落總數(shù)呈比例升高，多樣性增加，某些菌種在適宜條件下成為優(yōu)勢菌，有些菌群逐漸消亡，以此消彼長的狀態(tài)維持細(xì)菌總數(shù)的平穩(wěn)。

2.2.3 細(xì)菌群落組成分析

在目和屬水平上物種豐度前10的群落組成見圖3。由圖3a可知，從目水平看，乳桿菌目(Lactobacillales)和擬桿菌目(Bacteroidales)在添加老面的體系中占優(yōu)勢地位，乳桿菌目相對豐度7%，在未添加老面的體系中幾乎未檢出。L30的擬桿菌目相對豐度達(dá)到峰值10%，可能與老面體系中添加米酒酒曲后還原糖含量降低有關(guān)。張海燕等[22]在研究中檢測出與試驗(yàn)相同的葉綠體序列，并提出原因可能是過程中添加曲種或發(fā)酵、干制時(shí)環(huán)境所帶來。劉同杰等[23]通過對傳統(tǒng)酸面團(tuán)鑒定，發(fā)現(xiàn)乳桿菌目為其中關(guān)鍵微生物，與圖3a結(jié)果類似。寧亞麗等[24]研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌為酒曲中的優(yōu)勢細(xì)菌，對酸味的產(chǎn)生有重要作用。由圖3b可知，添加老面后，L樣品中出現(xiàn)新的乳酸桿菌(Lactobacillus)，且隨時(shí)間延長，保持較高相對豐度，在10%左右波動，可將乳酸桿菌看作L面團(tuán)中的優(yōu)勢菌屬。在酸面團(tuán)發(fā)酵過程中乳酸桿菌常被發(fā)現(xiàn)，并與檸檬色短小桿菌等細(xì)菌相互促進(jìn)[25-26]。

2.3 發(fā)酵面團(tuán)風(fēng)味物質(zhì)的測定

由表3可知，面團(tuán)中有21種醇類、42種烴類、30種酯類、2種呋喃類、11種醛類、7種酮類、4種酚類、2種醚類及5種其他類別，共124種風(fēng)味物質(zhì)，醇類和酯類相對含量較高，可認(rèn)為是面團(tuán)發(fā)酵過程中的關(guān)鍵香氣成分。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，L面團(tuán)中醛類風(fēng)味物質(zhì)略微下降，A面團(tuán)中烴類略微下降，其余總體基本不變，比較L面團(tuán)中揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量發(fā)現(xiàn)，適量添加老面后面團(tuán)的風(fēng)味物質(zhì)增加，從而提升蒸制后饅頭的風(fēng)味。醇類在環(huán)境中不穩(wěn)定、易揮發(fā)而較易在香氣檢測中捕獲，面團(tuán)中醇類物質(zhì)的產(chǎn)生主要源于可發(fā)酵糖源的代謝作用。在面團(tuán)發(fā)酵后期，體系中酵母菌、乳酸菌通過直接參與代謝或結(jié)合電子受體參與代謝，還原內(nèi)部醛類物質(zhì)為醇類、酸類物質(zhì)，面團(tuán)體系風(fēng)味物質(zhì)多樣性增加[27-28]。酯類風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生主要來源于酸類物質(zhì)與醇類物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)，面團(tuán)發(fā)酵過程中脂肪酸與乙醇作用，使面團(tuán)產(chǎn)生堅(jiān)果類及環(huán)狀芳香類氣味[29]。棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯和酞酸二丁酯為老面面團(tuán)中相對含量較多的特征風(fēng)味成分，酯類的產(chǎn)生可能來源于發(fā)酵過程中桿菌、酵母菌的生長繁殖，面團(tuán)中脂肪酸代謝作用增強(qiáng)[30]。面粉中本身含有少量的油脂成分及不飽和脂肪酸，通過氧化反應(yīng)生成氧化物，發(fā)酵時(shí)酵母菌種類及數(shù)量增加，酶作用增強(qiáng)，生成醛、酮類物質(zhì)。醛類物質(zhì)大多具有果類、綠葉草本類等風(fēng)味；酮類、酚類物質(zhì)大多具有酸味、堅(jiān)果類、水果類香氣，但其呈香作用弱，在饅頭整體香氣特征中表現(xiàn)不明顯[31-32]。

圖3 目和屬水平的群落組成和相對豐度Fig.3 Community composition and relative abundance at the order and genus levels

表3 面團(tuán)發(fā)酵過程揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析Table 3 GC-MS analysis of volatile flavor compounds during dough fermentation

續(xù)表3

綜合各類香氣成分的變化可以得出，微生物復(fù)雜程度的增加、體系內(nèi)生化反應(yīng)的進(jìn)行有利于風(fēng)味的產(chǎn)生，起主導(dǎo)作用的是酯類、醇類、醛類等風(fēng)味成分，相對含量存在差異。隨發(fā)酵時(shí)間延長，老面面團(tuán)中酯類物質(zhì)逐漸增多，醇類、醛類物質(zhì)逐漸減少，可能是造成老面饅頭具有特殊香氣的主要原因。添加老面后，面團(tuán)風(fēng)味物質(zhì)種類變多，通過物質(zhì)之間相互協(xié)調(diào)，賦予了饅頭獨(dú)特的風(fēng)味和口感。

2.4 發(fā)酵面團(tuán)揮發(fā)性成分與微生物相關(guān)性分析

由圖4可知，檸檬色短小桿菌與醇類負(fù)相關(guān)，與醚類、醛類正相關(guān)；蠟樣芽孢桿菌與醇類、醛類正相關(guān)，與呋喃類負(fù)相關(guān)；膠紅酵母與酮類、酯類、醛類正相關(guān)，與烴類、呋喃類負(fù)相關(guān)；腐生葡萄球菌與酚類、呋喃類正相關(guān)，與酯類負(fù)相關(guān)。由此可見，發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的變化與微生物群落結(jié)構(gòu)的變化具有相關(guān)性，說明微生物改變是影響風(fēng)味變化的一項(xiàng)重要因素。對面團(tuán)發(fā)酵過程中的微生物進(jìn)行調(diào)控，為進(jìn)一步研究微生物菌群結(jié)構(gòu)對風(fēng)味物質(zhì)形成的機(jī)理提供理論依據(jù)。

圖4 風(fēng)味物質(zhì)與微生物間相關(guān)性熱圖Fig.4 Heat map of the correlation between flavor components and microorganisms

3 結(jié)論

基于傳統(tǒng)培養(yǎng)和高通量測序?qū)ξ⑸锒鄻有约熬航Y(jié)構(gòu)分析表明，老面的添加提高了發(fā)酵過程中膠紅酵母及檸檬色短小桿菌的菌落數(shù)。微生物多樣性的提高有利于發(fā)酵面團(tuán)風(fēng)味的改善。采用GC-MS法共檢測到124種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，老面的添加使得風(fēng)味物質(zhì)的種類及數(shù)量增多，酯類、醛類、醇類尤其明顯。與酵母面團(tuán)相比，老面面團(tuán)在縮短發(fā)酵時(shí)間的同時(shí)，能賦予新的風(fēng)味及增強(qiáng)特征香氣濃度。微生物菌群多樣性與老面饅頭風(fēng)味相關(guān)性分析表明，微生物菌群多樣性與揮發(fā)性香氣物質(zhì)組成具有顯著相關(guān)性。本研究通過對未添加和添加老面的面團(tuán)發(fā)酵過程中微生物多樣性及風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行比較分析，為進(jìn)一步研究菌群信息及提升饅頭特征風(fēng)味和品質(zhì)優(yōu)化提供理論參考，對開發(fā)生產(chǎn)老面饅頭工業(yè)化風(fēng)味發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。