馬美榮，張坤，李洪媛，李博藝，周林艷，王小偉

(北京紅星股份有限公司，北京 101400)

紅曲霉是腐生真菌，屬真菌門、子囊菌綱、真子囊菌亞綱、曲霉目、曲霉科、紅曲霉屬[1]。紅曲霉在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落起初為白色，老熟后變成淡粉色、紫色或灰黑色，多形成紅色[2]。由其制作的紅曲可用于釀酒[3-4]、制醋[5-6]、作豆腐乳的著色劑和調(diào)味劑[7-8]。在酶制劑工業(yè)中也可用其生產(chǎn)糖化酶制劑[9-10]。近年來，隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)紅曲的深入研究，發(fā)現(xiàn)紅曲中有洛伐他汀類化合物、γ-氨基丁酸、麥角固醇、亞油酸、異黃酮、葡萄糖胺等有益的代謝產(chǎn)物，這些活性物質(zhì)具有降脂、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、抗抑郁、預(yù)防骨質(zhì)疏松等多種功效[11-13]。

麩皮為小麥最外層的表皮，小麥加工面粉后剩下的皮稱為麩皮。麩皮含有可提供曲霉生長(zhǎng)的一切維生素、微量礦質(zhì)元素及其他生長(zhǎng)因子，是制作黑曲霉、根霉、毛霉、梨頭霉、擬內(nèi)孢霉、固體酵母的主要原料[14]。近年來，一些研究者進(jìn)行了利用麩皮生產(chǎn)紅曲的研究。張立強(qiáng)等采用麩皮培養(yǎng)紅曲，以酯化力為標(biāo)準(zhǔn)確定麩皮紅曲的最佳制作條件，并將麩皮紅曲應(yīng)用于黃水的酯化以提高己酸乙酯和乳酸乙酯的含量[15]。莊桂采用黑曲霉將麩皮糖化后，進(jìn)而利用糖化麩皮代替糯米進(jìn)行紅曲培養(yǎng)以制備紅曲色素，提高了麩皮的附加值[16]。程偉等采用大米、麩皮混合料制備的酯化紅曲明顯優(yōu)于大米或麩皮等單獨(dú)作為原料制備的酯化紅曲[17]。

北京紅星股份有限公司的紅曲生產(chǎn)是以小米或大米為原料，生產(chǎn)成本較高。因?yàn)辂熎け刃∶谆虼竺妆阋耍喳熎ご嫘∶谆虼竺讈砼囵B(yǎng)紅曲，應(yīng)該可以降低生產(chǎn)成本。由于QB/T 5188-2017《釀造紅曲》是以糖化力作為紅曲的評(píng)價(jià)指標(biāo)[18]，且紅星公司生產(chǎn)的紅曲主要是利用其糖化性能和產(chǎn)香性能參與釀酒發(fā)酵，因此在研究中以糖化力指標(biāo)作為麩皮紅曲質(zhì)量的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過影響麩皮紅曲糖化力的單因素試驗(yàn)研究及正交試驗(yàn)研究，確定合適的發(fā)酵工藝條件；分析麩皮紅曲與大米紅曲的風(fēng)味物質(zhì)含量并進(jìn)行比較；對(duì)兩種紅曲的成本進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)麩皮紅曲生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

紅糖、大米、玉米面：市售；麩皮、酒糟、酒尾：北京紅星股份有限公司釀造車間；紅曲霉：北京紅星股份有限公司。

1.2 主要試劑

乙醇：分析純，北京化工廠；乙酸、無水乙酸鈉：均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.3 主要儀器與設(shè)備

HY-60S恒溫?fù)u床 武漢匯誠(chéng)科技有限公司；HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；HH.S21-Ni6水浴鍋 北京長(zhǎng)安永利科學(xué)儀器有限公司；GTR16-2離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；GC-2010 plus氣相色譜儀 日本島津公司。

1.4 方法

1.4.1 酒糟水的制備

取100 g酒糟置于1 L水中，加熱至沸，保持10 min，過濾，濾液加水補(bǔ)足至1 L。

1.4.2 紅糖酒糟水培養(yǎng)基的制備

上述制備的酒糟水1 L，加入50 g紅糖，溶解，滅菌備用。

1.4.3 紅曲霉液體種子培養(yǎng)

將紅曲霉斜面接種于紅糖酒糟水培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)2 d。

1.4.4 麩皮紅曲培養(yǎng)

每500 mL三角瓶中加入30 g麩皮，并加入30 mL水，拌勻，121 ℃高壓滅菌30 min。降溫冷卻至30 ℃左右時(shí)，以20%的接種量接入培養(yǎng)好的紅曲霉種子，在30 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)成熟后得到麩皮紅曲。

1.4.5 大米紅曲培養(yǎng)

大米室溫下浸泡4～6 h，在500 mL三角瓶?jī)?nèi)裝入50 g浸泡后的大米，121 ℃滅菌30 min。冷卻后接入10%的液體種子，30 ℃培養(yǎng)8 d。

1.4.6 紅曲糖化力測(cè)定

稱取5 g紅曲樣品，加入90 mL水和10 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，攪勻。35 ℃水浴1 h，用脫脂棉過濾，棄去最初5 mL，接收其余澄清濾液進(jìn)行淀粉酶解糖測(cè)定，測(cè)定方法參照斐林定糖法[19]。

式中：V0表示加空白溶液后消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積(mL)；V表示加麩曲糖化液后消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積(mL)；C表示標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度(g/mL)。

1.4.7 不同培養(yǎng)條件對(duì)麩皮紅曲糖化力的影響

以1.4.4為基礎(chǔ)，進(jìn)行不同培養(yǎng)基、初始加水量、培養(yǎng)溫度及發(fā)酵時(shí)間等參數(shù)試驗(yàn)，探究其對(duì)紅曲糖化力的影響。

1.4.7.1 不同培養(yǎng)基的影響

麩皮培養(yǎng)基：麩皮∶水為100∶100；麩皮酒尾培養(yǎng)基：麩皮∶水∶酒尾為100∶100∶20；麩皮玉米面培養(yǎng)基：麩皮∶水∶玉米面為80∶100∶20。其他條件為培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間7 d。

以選擇的培養(yǎng)基進(jìn)行1.4.7.2～1.4.7.6及1.4.8試驗(yàn)。

1.4.7.2 不同裝料量的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入10，30，50 g麩皮，其他條件為料水比1∶1、培養(yǎng)溫度 30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間7 d。

1.4.7.3 不同培養(yǎng)時(shí)間的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入30 g麩皮，料水比為1∶1，培養(yǎng)溫度為30 ℃，分別在培養(yǎng)時(shí)間6，7，8，9 d取樣分析。

1.4.7.4 不同初始加水量的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入30 g麩皮，料水比分別為0.8∶1、1∶1、1.2∶1、1.4∶1，培養(yǎng)溫度為 30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為7 d。

1.4.7.5 不同接種量的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入30 g麩皮，接種量分別為10%、15%、20%、25%、30%，其他條件為料水比1∶1、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間7 d。

1.4.7.6 不同培養(yǎng)溫度的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入30 g麩皮，料水比為1∶1，分別在25，30，35，40 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間7 d。

1.4.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)對(duì)紅曲糖化力影響較大的裝料量、初始料水比、接種量、溫度進(jìn)行三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化紅曲培養(yǎng)條件[20-21]。

1.4.9 紅曲風(fēng)味物質(zhì)分析

以干重計(jì)稱取5 g紅曲，置于250 mL磨口三角瓶中，加入100 mL 70%乙醇室溫下浸泡2 d，提取液置于50 mL離心管中，3000 r/min，10 min，取上清液進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)分析。

風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定：采用氣相色譜法檢測(cè)風(fēng)味物質(zhì)的含量。色譜條件參照楊強(qiáng)等[22]的方法并略作修改：LZP-930石英毛細(xì)管色譜柱(50 m×0.32 mm×1.00 μm)；氫火焰離子化檢測(cè)器(flame ionization detector，F(xiàn)ID)，檢測(cè)器溫度230 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：50 ℃保持3 min，以6 ℃/min升至130 ℃，再以20 ℃/min升至180 ℃，保持1 min；載氣為氮?dú)?N2)；吹掃流量為3 mL/min；分流比為1∶30。根據(jù)保留時(shí)間定性[23]，采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物為乙酸正戊酯(質(zhì)量濃度0.117 g/L)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)麩皮紅曲糖化力的影響

2.1.1 不同培養(yǎng)基對(duì)糖化力的影響

培養(yǎng)基是微生物生長(zhǎng)、代謝目的產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)。不同的培養(yǎng)基組成會(huì)極大影響代謝產(chǎn)物的合成。從幾種培養(yǎng)基的培養(yǎng)來看，不同培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速度差別較大，麩皮玉米面培養(yǎng)基生長(zhǎng)最快，麩皮酒尾培養(yǎng)基生長(zhǎng)最慢。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基加玉米面后營(yíng)養(yǎng)更豐富，有利于紅曲霉生長(zhǎng)，而酒尾中含有乙醇、有機(jī)酸等物質(zhì)，培養(yǎng)初期可能會(huì)對(duì)紅曲霉的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)糖化力的影響Fig.1 Effect of different media on saccharifying power

由圖1可知，幾種培養(yǎng)基中，采用麩皮酒尾培養(yǎng)基的糖化力最高，后續(xù)試驗(yàn)采用麩皮酒尾培養(yǎng)基進(jìn)行工藝優(yōu)化培養(yǎng)試驗(yàn)。

2.1.2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)糖化力的影響

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)糖化力的影響Fig.2 Effect of different fermentation time on saccharifying power

發(fā)酵時(shí)間短，發(fā)酵不完全，發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，發(fā)酵指標(biāo)不一定增加較多，甚至可能降低，從發(fā)酵指標(biāo)、設(shè)備利用率等方面考慮，確定合理的發(fā)酵時(shí)間非常必要。由圖2可知，麩皮紅曲的糖化力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵7 d 時(shí)效果最好，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，紅曲糖化力反而下降，后續(xù)試驗(yàn)采用7 d發(fā)酵。

2.1.3 不同裝料量對(duì)糖化力的影響

圖3 不同裝料量對(duì)糖化力的影響Fig.3 Effect of loading volume on saccharifying power

裝料量不同，導(dǎo)致微生物的生長(zhǎng)環(huán)境不同，進(jìn)而影響微生物的代謝產(chǎn)物代謝流程。由圖3可知，從500 mL三角瓶裝料量發(fā)酵結(jié)果來看，裝料30 g的糖化力最高，裝料量少，保濕效果差，物料容易發(fā)干，影響培養(yǎng)；裝料量多，溶氧效果差，也影響培養(yǎng)效果。在本試驗(yàn)條件下，裝料量以30 g效果最好。

2.1.4 不同接種量對(duì)糖化力的影響

圖4 不同接種量對(duì)糖化力的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on saccharifying power

接種量也是影響微生物發(fā)酵的重要因素之一。接種量小，發(fā)酵代謝緩慢，也容易感染雜菌；接種量過大，發(fā)酵速度過快，也會(huì)影響微生物代謝產(chǎn)物合成。由圖4可知，20%接種量效果最好，接種量過大，紅曲糖化力反而下降。

2.1.5 初始加水量對(duì)糖化力的影響

圖5 不同初始加水量對(duì)糖化力的影響Fig.5 Effect of initial water additive amount on saccharifying power

微生物的生長(zhǎng)、代謝離不開水，不同微生物的生長(zhǎng)代謝對(duì)水分的要求也不同。由圖5可知，初始加水量影響發(fā)酵效果，隨著初始加水量的增加，麩皮紅曲的糖化力也出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在本試驗(yàn)條件下，初始加水量為120%時(shí)效果最好。

2.1.6 不同培養(yǎng)溫度對(duì)糖化力的影響

圖6 不同溫度對(duì)糖化力的影響Fig.6 Effect of different temperatures on saccharifying power

微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成是在各種酶的催化活動(dòng)下進(jìn)行的，而酶的催化活動(dòng)受溫度的影響。由圖6可知，隨著溫度升高，紅曲的糖化力先上升后下降，以30 ℃的糖化力最高。

2.2 正交試驗(yàn)

依據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，重新選定各因素較為適宜的試驗(yàn)水平范圍進(jìn)行正交試驗(yàn)(見表1)，試驗(yàn)選定A(裝料量)、B(接種量)、C(初始加水量)、D(溫度)設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)確定最佳組合。

表1 麩皮紅曲制作正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment of bran red koji

表2 麩皮紅曲試驗(yàn)正交水平表Table 2 The orthogonal level table of bran red koji experiment

由表2可知，對(duì)麩皮紅曲糖化力的影響因素為A>C>D>B，最佳培養(yǎng)條件為A(裝料量)30 g/500 mL三角瓶、B(接種量)20%、C(初始加水量)120%、D(溫度)30 ℃。

2.3 麩皮紅曲與小米紅曲風(fēng)味物質(zhì)分析

以氣相色譜分析麩皮紅曲、大米紅曲風(fēng)味物質(zhì)的差異，同時(shí)對(duì)原料麩皮、大米的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，見表3。

表3 紅曲及制曲原料風(fēng)味物質(zhì)分析Table 3 Analysis of flavor substances of red koji and koji-making raw materials mg/kg

在采用色譜條件下，從紅曲及制曲原料中共檢測(cè)到9種風(fēng)味物質(zhì)，醛類2種、酯類5種、醇類2種。在兩種紅曲及麩皮、大米中，都是醛類物質(zhì)含量最高，其次酯類物質(zhì)含量較高。在兩種紅曲中，麩皮紅曲的醛類物質(zhì)、酯類物質(zhì)含量高于大米紅曲，分別高53.34%、3.82%，但醇類物質(zhì)含量低于大米紅曲，約低9.08%。兩種紅曲風(fēng)味物質(zhì)含量的差別可能與制曲原料有關(guān)。麩皮紅曲與原料麩皮的風(fēng)味物質(zhì)含量相比，麩皮紅曲的酯類物質(zhì)含量高于麩皮，約高18.68%，但醛類物質(zhì)、醇類物質(zhì)含量低于麩皮，分別約低6.36%、6.51%。大米紅曲與原料大米的風(fēng)味物質(zhì)含量相比，大米紅曲的酯類物質(zhì)含量高于大米，約高58.63%，但醛類物質(zhì)、醇類物質(zhì)含量低于大米，分別約低64.02%、3.88%。

2.4 麩皮紅曲與大米紅曲成本分析

表4 麩皮紅曲與大米紅曲成本分析Table 4 The cost analysis of bran red koji and rice red koji

以麩皮2元/kg、大米4元/kg計(jì)，根據(jù)它們的出曲率計(jì)算噸曲原料直接成本。由表4可知，大米紅曲的出曲率低，但價(jià)格高于麩皮，麩皮紅曲噸成本遠(yuǎn)低于大米紅曲噸成本，約為大米紅曲成本的37%左右。從原料直接成本上來看，麩皮紅曲具有取代大米紅曲的經(jīng)濟(jì)可行性。

3 結(jié)論

經(jīng)過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，確定了最佳的麩皮紅曲發(fā)酵工藝條件：裝料量30 g/500 mL三角瓶、接種量20%、初始加水量120%、溫度30 ℃。

兩種紅曲及制曲原料經(jīng)過風(fēng)味物質(zhì)分析，主要含有醛類、醇類、酯類物質(zhì)，醛類物質(zhì)含量最高，其次為酯類物質(zhì)，兩種紅曲的風(fēng)味物質(zhì)含量無顯著差異。兩種紅曲風(fēng)味物質(zhì)含量的差別可能與制曲原料有關(guān)。

麩皮紅曲的出曲率要高于大米紅曲的出曲率，且麩皮價(jià)格遠(yuǎn)低于大米價(jià)格，麩皮紅曲直接原料成本要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大米紅曲，因此其具有取代大米紅曲的經(jīng)濟(jì)可行性。

麩皮紅曲能否在生產(chǎn)上應(yīng)用，首先要考察其對(duì)原酒品質(zhì)的影響，所生產(chǎn)原酒能否滿足作為基酒或調(diào)味酒的使用要求，其次由于紅曲霉在麩皮上生長(zhǎng)緩慢，需要實(shí)現(xiàn)麩皮紅曲的規(guī)?；a(chǎn)，以滿足生產(chǎn)應(yīng)用要求。