基于16S rDNA測序技術探究參苓白術散對潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群的影響

馬 琪，董 婧，翁與競，杜紅旭，2 (.西南大學 動物醫(yī)學院，重慶 402460；2.西南大學 醫(yī)學研究院 免疫研究中心，重慶 402460)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病，本病的病變區(qū)域位于大腸黏膜及黏膜下層，主要涉及直腸和結腸，尤其是乙狀結腸，有時也可能遍及降結腸乃至整個結腸。臨診主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、排血便等。目前普遍認為，UC機體存在腸黏膜炎癥免疫耐受紊亂，腸黏膜免疫反應異常激活是UC發(fā)生、發(fā)展的重要因素[1]。對UC治療的經(jīng)典藥物有5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等，該類藥物在發(fā)揮功效的同時，不可避免地帶來相應的副作用[2]。有研究表明，中醫(yī)藥對UC有良好的治療作用，且不良反應較少[3]。

中醫(yī)認為UC屬于“瀉下”、“痢疾”、“腸風”等范疇，并認為UC是由于感受外邪、內(nèi)傷飲食、情志失調(diào)和脾胃虛弱所致，病位在脾、胃和大、小腸。其病因為外感濕熱，飲食不節(jié)，導致脾、胃、小腸和大腸傳導失調(diào)，水谷運行不暢，久而閉塞，傷及腸胃，氣血瘀滯，以致便血?！豆沤襻t(yī)鑒》云：“夫泄瀉者，注下之癥也，蓋大腸為傳送之官，脾胃為水谷之海，或為飲食生冷所傷，或為暑濕風寒之所感，脾胃停滯，以致闌門清濁不分，發(fā)注于下，而為泄瀉也?！盪C證型實證中以大腸濕熱為主，虛證中以脾虛證為主，在虛實夾雜證型中，多以脾虛為基礎，并見濕熱、寒濕、氣滯和血瘀[4]。而在臨床上，大腸濕熱證、脾胃氣虛證及脾虛夾濕熱證三證型臨床多見，符合中醫(yī)學理論的病初起多屬于實證，發(fā)展日久耗傷正氣則形成虛證或虛實夾雜證的疾病發(fā)展觀[5]。本研究探討脾虛泄瀉型UC的病機關鍵為脾虛濕盛，運化失健[6]。中醫(yī)認為，脾喜燥而惡濕，外來濕邪，最易困阻脾土，以致升降失調(diào)，清濁不分，水谷雜下而發(fā)生泄瀉，即所謂“無濕不成泄”，故《雜病源流犀燭·泄瀉源流》說：“濕盛則飧泄，乃獨由于濕耳”。因此，健脾溫腎、行氣導滯是中藥治療 UC 的重要原則[7]。

參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》，是中醫(yī)治療脾虛夾濕證的經(jīng)典方劑，由黨參、白術、茯苓、山藥、白扁豆、薏苡仁、砂仁、桔梗、蓮子、炙甘草組成，諸藥配伍，有健脾止瀉，祛濕行滯之功。該方將補脾與祛濕合用，正邪兼顧；脾肺兼調(diào)，主在補脾，寓“培土生金”之義，常用于治療脾虛夾濕證，近年發(fā)現(xiàn)其在臨床消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多個領域治療疾病應用廣泛，并取得顯著成效[8]。

腸道菌群的平衡在構建腸黏膜屏障、維持正常免疫功能等方面發(fā)揮著重要作用，其機制包括產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、與有害菌競爭黏附、對宿主免疫調(diào)節(jié)等[2]。有研究表明中藥通過口服進入消化道，一部分直接通過胃黏膜吸收入血，另一些生物利用度較低的部分未經(jīng)上消化道吸收，通過小腸到達大腸，與腸道菌群接觸并發(fā)生相互作用，中藥有效部位成分不僅能改變腸道菌群代謝，且被腸道菌群轉化或代謝[9]。中藥還可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群阻止腸道細菌和內(nèi)毒素發(fā)生移位，平衡有益菌與致病菌，能明顯提高黏膜細胞的再生能力，降低過高的黏膜通透性，從而改善黏膜的屏障功能[10]。因此，本研究通過探討參苓白術散對DSS誘導的UC模型小鼠腸道菌群的影響，進一步探究參苓白術散治療小鼠UC的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物32 只SPF級雄性BALB/c小鼠，6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[(湘)2019-0004]，飼養(yǎng)于西南大學動物實驗室[SYXK(渝)2019-0003]。飼養(yǎng)期間各組小鼠為自由飲水、采食。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在25℃ 左右。所有操作均符合西南大學動物實驗倫理學要求(審批號：IACUC-20190620-02)。

1.2 試劑葡聚糖硫酸鈉(DSS)(批號：S0948，MW：36000-50000)購自MP Biomedicals；聯(lián)鄰甲苯胺(批號：C10659221)購自上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇(批號：20190818)購自成都金山化學試劑有限公司；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SASP)(批號：C10865372)購自上海麥克林生化科技有限公司；過氧化氫(批號：200506)購自四川省伊潔士醫(yī)療科技有限公司；冰醋酸(批號：20170501)購自重慶川東化工有限公司。參考《太平惠民和劑局方》中參苓白術散的配方組成，藥材蓮子、薏苡仁、砂仁、桔梗、白扁豆、茯苓、黨參、甘草、白術、山藥購自重慶榮昌布美大藥房，經(jīng)西南大學動物醫(yī)學院劉娟教授鑒定。其中蓮子為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥成熟種子，薏苡仁為禾本科植物薏苡Coix.Lacryma-jobiL.var.mayuen(Roman)Stapf的干燥成熟種仁，砂仁為為姜科植物陽春砂AmomumvillosumLour.的干燥成熟果實，桔梗為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，白扁豆為豆科植物扁豆DolichoslablabL.的干燥成熟種子，茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.的干燥根，甘草為豆科植物甘草ClycyrrhizauralensisFisch.的干燥根莖，白術為菊科植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppasitaThunb.的干燥根莖。

1.3 方法

1.3.1試驗試劑制備 參苓白術散制備：以《太平惠民和劑局方》中記載的處方配比為基礎，稱取蓮子肉、薏苡仁、砂仁、桔梗(炒)各3.2 g，扁豆(炒)4.8 g，茯苓、黨參、甘草、白術(炒)、山藥各6.4 g，先后煎煮2次。過濾后合并濾液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至1 000 g/L，再用乙醇醇沉2次，所得上清液再蒸發(fā)至1 000 g/L，放入溫箱烘干制得浸膏備用，灌胃時以羧甲基纖維素溶解配置為6.28 g/(kg·d)。柳氮磺胺吡啶溶液配制：灌胃時以羧甲基纖維素溶解配置為450 g/(L·d)。DSS配制：用純凈水配置為3.5%的溶液。聯(lián)鄰甲苯胺冰醋酸溶液配制：用1∶1無水乙醇和冰醋酸將聯(lián)鄰甲苯胺配置為15.0%的溶液，低溫、避光保存。

1.3.2實驗動物處理 將BALB/c小鼠適應性喂養(yǎng)7 d，采用隨機數(shù)字表法把小鼠分為8 只/組：參苓白術散治療組(SLBZS)、柳氮磺胺吡啶治療組(SASP)、對照組、模型組(Model)。SLBZS、SASP、Model組飲用3.5% DSS 水溶液，對照組飲用純凈水。每天更換新鮮飲水，連續(xù)7 d。各組分別以參苓白術散、柳氮磺胺吡啶、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素按10 mL/kg灌胃，共7 d。

1.4 觀察指標

1.4.1小鼠臨床表現(xiàn)觀察 造模及治療期間，觀察并記錄小鼠體質(zhì)量、糞便、毛發(fā)狀況、精神狀態(tài)等變化，以此評估小鼠狀態(tài)。

1.4.2小鼠結直腸長度測量 治療結束后，頸椎脫臼處死小鼠，采集小鼠結直腸，于冰上去除腸系膜和脂肪組織，然后置于玻璃板上用直尺測量肛門到回直結合部距離。

1.4.3結腸黏膜損傷眼觀評分 將小鼠結腸沿腸系膜側縱向切開，用PBS溶液洗滌腸道內(nèi)容物后進行腸黏膜損傷量化評分(表1)。

表1 結腸黏膜損傷眼觀評分標準 分

1.4.4疾病活動指數(shù)(DAI)評分 通過體質(zhì)量下降分數(shù)、糞便性狀分數(shù)和糞便隱血分數(shù)評估小鼠的疾病活動指數(shù)(DAI)。公式為DAI=(體質(zhì)量下降分數(shù)+糞便性狀分數(shù)+糞便隱血分數(shù))/3(表2)。

表2 DAI評分標準

其中小鼠糞便隱血程度采用聯(lián)鄰甲苯胺法判定，判定方法如下：用竹簽將糞便涂于玻片或濾紙上，分別滴加15%鄰甲苯胺冰醋酸溶液和3%過氧化氫液2～3滴于糞便上，根據(jù)顏色深淺和出現(xiàn)時間可判定，在2 min內(nèi)顯藍褐色為陽性(表3，圖1)。

表3 隱血檢測判斷標準 分

圖1 隱血判定示意圖

1.4.5結腸組織病理學評分 將小鼠整個結腸泡入10%中性甲醛固定后，用石蠟包埋，制成切片(約5 μm)后進行伊紅-美藍(HE)染色制成病理切片。采用Leica DFC 顯微拍照系統(tǒng)對病理切片進行觀察與拍照并進行組織病理學評分[11]，評分內(nèi)容包括腸上皮細胞損傷程度和炎癥浸潤程度，結果可用于評價結腸組織損傷程度(表4)。

表4 組織病理學評分標準 分

1.4.616S rDNA測序 采用CTAB方法對各組小鼠盲腸內(nèi)容物樣本的基因組DNA進行提取，并對DNA的純度和濃度進行檢測。根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物和高保真DNA聚合酶對選定的V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行切膠回收，膠回收采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)。參照電泳初步定量結果，對PCR擴增回收產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST 藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。使用NEB NextRUltraTMDNA Library Prep Kit建庫試劑盒進行文庫構建。構建好的文庫通過Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit進行質(zhì)檢，文庫質(zhì)檢合格后進行上機測序。

2 結果

2.1 小鼠臨床表現(xiàn)在適應性喂養(yǎng)期間各組小鼠進食、飲水、排便情況均正常，小鼠被毛整潔、平滑有光澤，活潑好動。Model組小鼠在造模期間隨著DSS攝入逐漸表現(xiàn)為精神沉郁、怕冷扎堆、不愿走動、腹瀉拉血便，肛周及尾根部黏附有干結的糞便，毛發(fā)逐漸變得干枯無光澤同時大量脫毛。SLBZS與SASP組隨著灌胃給藥，腹瀉及血便情況、精神狀態(tài)、毛發(fā)情況逐漸轉好(圖2)。

圖2 小鼠一般狀況

2.2 小鼠體質(zhì)量及疾病活動指數(shù)(DAI)變化在試驗期間，對照組小鼠的體質(zhì)量基本呈上升狀態(tài)，SLBZS和SASP組小鼠的體質(zhì)量隨著治療進行有所恢復趨近于對照組，且均明顯高于Model組，具有極顯著性差異(P<0.01)，說明2組的治療均取得顯著效果。但SLBZS組的體質(zhì)量明顯高于SASP組，且差異極顯著(P<0.01)，說明參苓白術散的治療效果明顯優(yōu)于SASP組。同時，Model組體質(zhì)量呈明顯下降趨勢，與對照組相比有極顯著性差異(P<0.01)(圖3A)。與對照組相比，Model組DAI評分極顯著升高(P<0.01)。與Model組相比，SLBZS和SASP組DAI評分均明顯降低(P<0.05)(圖3B)。

A.小鼠體質(zhì)量變化；B.DAI評分。與Model組比較，*.P<0.05, **.P<0.01；與對照組比較,#.P<0.05，##.P<0.01。下同圖3 小鼠體質(zhì)量變化及DAI評分

2.3 小鼠結直腸長度變化小鼠結腸長度縮短是UC炎癥的重要特征[12]。與對照組相比，Model組結腸長度明顯縮短(P<0.01)。與Model組相比，SLBZS組結腸長度明顯增加(P<0.01)。SASP組結腸長度與Model組相比有顯著性差異(P<0.05)(圖4)。

A.小鼠結直腸長度；B.小鼠結直腸長度變化圖4 小鼠結直腸長度變化

2.4 小鼠結腸黏膜損傷眼觀評分根據(jù)小鼠結直腸剖檢結果可見，Model組小鼠結直腸黏膜存在一定病變，腸壁充血腫脹，特別是結腸端有明顯出血和潰瘍。對照組小鼠結直腸基本無損傷，且結腸黏膜損傷眼觀評分與Model組差異極顯著(P<0.01)。同時SLBZS與SASP組小鼠結腸炎癥狀況較Model組明顯改善，黏膜腫脹充血程度明顯減輕(圖5A)。在黏膜損傷評分中，SLBZS組相較于Model組有極顯著性差異(P<0.01)，SASP組相較于Model組有顯著性差異(P<0.05)(圖5B)。

A.小鼠結腸黏膜病變；B.結腸黏膜損傷眼觀評分圖5 小鼠結腸黏膜病變損傷情況

2.5 小鼠結腸組織病理切片及病理學評分HE染色結果所示(圖6A)，Model組小鼠結腸黏膜上皮結構破壞，正常形態(tài)消失，上皮細胞及皺襞變矮，整個腸壁變薄，黏膜下層有炎性細胞浸潤，組織病理學評分與對照組相比差異顯著(P<0.05) 。同時，SLBZS組小鼠結腸黏膜比較完整，與Model組相比組織病理學評分差異顯著(P<0.05)(圖6B)。

A.小鼠結腸組織病理切片(HE染色，×100，n=3)；B.組織病理學評分圖6 小鼠結腸組織病理學變化

2.6 小鼠樣品16S rDNA測序質(zhì)量評估及多樣性分析根據(jù)各樣品測序量在不同測序深度時微生物多樣性指數(shù)構建Shannon 曲線，當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息(圖7A)。采用Venn圖分析 OTUs 數(shù)量及不同組之間共有、特有OTUs，Model和對照組總 OTUs 為181 727個，Model組特有OTUs為82 309個，對照組特有OTUs為79 067個，共有OTUs為20 351個，占總OTUs的11.20%。與對照組相比，Model組腸道菌群物種豐度降低(圖7B)。以Observed_Species指數(shù)組間差異分析組間物種多樣性，SLBZS組Observed_Species指數(shù)高于Model組，同時低于對照組(圖7C)。

A.小鼠樣品Shannon曲線；B.Venn圖；C.Observed_Species指數(shù)組間差異箱形圖圖7 小鼠腸道菌群多樣性分析

2.7 門水平小鼠腸道菌群結構組成分析選取在門水平(Phylum)上最大豐度排名前 10 的各組小鼠腸道菌群物種，首先，厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度最高，各組占比均在80% 以上，其次為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)等(圖8A)。各組Firmicutes與Bacteroidetes豐度比值(即F/B值)由高到低依次為：對照組(3.37)>SLBZS組(1.70)>SASP組(1.36)>Model組(1.21)。采用heatmap在Phylum上進行物種豐度聚類情況分析，Proteobacteria的豐度在Model組中最高(0.081)，SASP組次之(0.075)，SLBZS組(0.042)與對照組(0.034)接近；在對照組中Deferribacteres和Actinobacteria的豐度顯著高于其他各組(圖8B)。

2.8 屬水平小鼠腸道菌群結構組成分析選取在屬水平(genus)上最大豐度排名前10的各組小鼠腸道菌群物種，在對照組中，乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度最高(18.74%)，其次為Mucispirillum(3.80%)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(3.72%)；在SLBZS組中，擬桿菌屬(Bacteroides)的豐度明顯低于SASP和Model組；在Model組中，Lactobacillus的豐度明顯低于SLBZS和SASP組(圖9)。

圖9 屬水平小鼠腸道菌群豐度

2.9 小鼠腸道菌群組間差異分析采用基于Weighted Unifrac距離[13]構建UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic mean)樣品聚類樹分析不同樣品間的相似性，與Model組相比，SLBZS和SASP組與對照組距離小，相似性較高(圖10)。根據(jù)分類學組成對樣本按照不同分組條件進行線型判別分析(LDA)，找出對樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種[14]。Model與SLBZS組的差異類群為Lactobacillales，Model與對照組的差異類群為Proteobacteria和Firmicutes。

圖10 小鼠腸道菌群組間差異分析

3 討論

UC是一種黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥，病變主要在結腸和直腸，臨診主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、排血便等?！夺t(yī)學心悟》指出：“濕多成五瀉，瀉之屬濕明矣。然有濕熱，有寒濕，有積食，有脾虛，有腎虛，皆能致瀉，宜分而治之。”參苓白術散有健脾滲濕之功，是用于治療脾虛泄瀉型UC的有效方劑。研究表明中醫(yī)藥辨證治療UC，尤其是慢性階段的UC治療，有藥物不良反應較小、療效顯著的優(yōu)勢[15]。

絕大多數(shù)中藥給藥途徑以湯劑、丸劑、散劑等口服為主，腸道菌群主要參與中藥有效成分的吸收、代謝和轉化[16]。近年來，越來越多的研究表明，除遺傳、免疫、環(huán)境等因素外，UC的發(fā)生與腸道菌群失調(diào)密切相關[2]。健康成人腸道內(nèi)約有1 000多種細菌，是人體組織細胞總數(shù)的10倍，腸道菌群同腸上皮層、黏液層、腸道淋巴系統(tǒng)一起構成腸黏膜機械、化學及生物屏障，該屏障有天然保護作用，可防止致病菌的入侵，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，同時定植于腸道內(nèi)的菌群可促進免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟[17]。微生物菌群失調(diào)可通過破壞結腸上皮緊密連接而減少腸道屏障，從而增加腸道的供血能力，使細菌轉移進入血液循環(huán)，導致毒性物質(zhì)的轉移[18]。

超過90%的正常人類腸道微生物群由4個主要細菌門中的物種組成：Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria和Actinobacteria[19]。而小鼠的優(yōu)勢菌門與人相似，測序結果表明各組在門水平豐度前10的物種中，豐度最高的均為Firmicutes和Bacteroidetes，占到80%以上，其次為Proteobacteria、Actinobacteria等。而Firmicutes和Bacteroidetes豐度比值(即F/B值)由高到低依次為對照組、SLBZS組、SASP組、Model組，在SLBZS組中，Bacteroides豐度明顯低于SASP和Model組。研究表明，F(xiàn)irmicutes相對于Bacteroidetes的相對豐度增加被認為是腸道微生物群生態(tài)失調(diào)的一個指標[20]。同時，有研究顯示腸道微生物群結構中適當數(shù)量的Firmicutes對慢性腸道炎癥有保護作用，在Firmicutes中包含幾種產(chǎn)丁酸的細菌[21]，而丁酸鹽是結腸上皮細胞的主要能量來源，可提供腸道內(nèi)的酸性環(huán)境進而抑制有害菌生長，維持水電解質(zhì)平衡，促進黏膜炎癥修復[22]。

另外，16S rDNA測序結果顯示在Model組中Proteobacteria的豐度最高，在對照組中Actinobacteria的豐度顯著高于其他組。研究表明，放線菌在腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的發(fā)展和維持中起著關鍵作用，它們產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸的能力被認為有助于維持腸道屏障[23]。 而天然腸道菌群通常只包含一小部分的Proteobacteria，且有研究表明腸道微生物群的失調(diào)通常是由Proteobacteria豐度的持續(xù)增加引起的[20]。由于機體不能將共生的變形桿菌維持在較低的豐度，導致微生物群落的定植能力降低，引發(fā)變形桿菌的不受控制的擴張，進一步促進外來病原體的入侵或炎癥的發(fā)展。因此，有學者提出可將Proteobacteria豐度的增加視為微生物群落失調(diào)的標志和疾病的潛在診斷標準[20]。

同時，在對照組中，Lactobacillus豐度最高(18.74%)，其次為Mucispirillum(3.80%)、Cory-nebacterium(3.72%)；在Model組中，Lactobacillus的豐度明顯低于SLBZS和SASP組。Lactobacillus可以改善小鼠的腸道菌群紊亂，降低腸道通透性，抑制腸道內(nèi)脂多糖移位，并減輕系統(tǒng)性低度炎癥[22]。同時，Lactobacillus促進產(chǎn)丁酸菌的生長及丁酸在低丁酸菌群體中的吸收和利用，減少炎癥反應[18]。覆蓋于腸道表面的黏液層是腸道黏膜屏障完整性的組成部分，在阻止腸腔微生物及其產(chǎn)物穿過腸黏膜起到重要的作用，Lactobacillus可通過保證腸黏膜的完整性來改善腸道屏障功能[24]。另外，研究表明Mucispirillum可以幫助宿主抵御鼠傷寒沙門菌引發(fā)的腸道炎癥，該菌在腸道內(nèi)與沙門菌競爭厭氧呼吸底物，抑制沙門菌毒力因子的表達，從而抵御結腸炎[25]。

16S rDNA測序結果顯示，Model與SLBZS組的差異類群為Lactobacillales，Model與對照組的主要差異類群為Proteobacteria、Firmicutes。同時，動物試驗結果表明參苓白術散能有效改善UC小鼠的腹瀉及血便情況、精神狀態(tài)、毛發(fā)情況，明顯恢復體質(zhì)量(P<0.01)、減少結腸長度的縮短(P<0.01)、改善結腸炎癥狀況、降低黏膜損傷評分(P<0.01)、降低DAI評分(P<0.05)、降低組織病理學評分(P<0.05)。以上結果均表明參苓白術散可以通過提高小鼠腸道菌群中有益菌的豐度、激發(fā)有益菌的微生物活性來抑制致病菌的生長，從而調(diào)節(jié)UC小鼠腸道菌群的多樣性、組成和相對豐度，同時改善屏障功能、提高免疫能力，以此達到治療UC的效果。