不同海拔牦牛骨骼肌肌纖維類型和MYHC基因表達(dá)的比較

周 娟，孟祥瓊，秦鴻楠，萬瑞東，李 琳，張勤文，荊海霞，魏 青 (青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，青海 西寧 810016)

骨骼肌占機(jī)體體質(zhì)量的40%～60%，是牦牛在高原低氧環(huán)境中能良好運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)。肌纖維是構(gòu)成骨骼肌的基本單位，其分布和分型是闡述骨骼肌功能的重要組織學(xué)依據(jù)。傳統(tǒng)方法將骨骼肌肌纖維分為2類：紅肌和白肌。紅肌肌紅蛋白豐富，肌纖維較細(xì)，收縮力小，但耐力持久，可保持較長(zhǎng)時(shí)間的收縮力，也稱慢肌纖維。白肌肌紅蛋白較少，肌纖維粗大，收縮力強(qiáng)，有爆發(fā)力和速度，但收縮持續(xù)時(shí)間短，也稱快肌纖維?，F(xiàn)常用分類方法是根據(jù)MYHC亞型的不同，分成4型：Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb型。MYHC的分型是建立在慢肌和快肌的基礎(chǔ)上，Ⅰ(慢速氧化型)型即為慢肌，Ⅱ型為快肌，Ⅱ型又可分為Ⅱa型(快速氧化糖酵解型)，以及Ⅱx型(快速糖酵解型)和Ⅱb型(快速糖酵解型)，其中Ⅱx是一種中間型，其功能及代謝能力介于Ⅱa和Ⅱb之間，收縮速率從大到小依次為Ⅱb、Ⅱx、Ⅱa、Ⅰ型[1-3]。

MYHC亞型主要決定肌原纖維的ATP酶活性，因此肌纖維類型與MYHC表達(dá)的亞型有關(guān)[4]。根據(jù)MYHC的亞型不同，將肌纖維分為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb型4種類型，這4種亞型分別由MYH7、MYH2、MYH1及MYH4基因編碼[5]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以測(cè)定MYHC亞型相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，而這種表達(dá)量是確定骨骼肌肌纖維類型的依據(jù)。

動(dòng)物出生后骨骼肌肌纖維的數(shù)量基本維持恒定，但肌纖維類型在生長(zhǎng)過程中可發(fā)生轉(zhuǎn)化，且其轉(zhuǎn)化是環(huán)境等外界因素和機(jī)體內(nèi)部因子協(xié)同調(diào)控的結(jié)果[6]。耐力或運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以誘導(dǎo)Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維轉(zhuǎn)化[7]。肌纖維組成的變化是肌肉對(duì)環(huán)境適應(yīng)性的功能基礎(chǔ)。有研究表明[8]，牦牛與普通牛相比，牦牛骨骼肌中MYH7基因表達(dá)量明顯低于普通牛，即牦牛體內(nèi)肌纖維類型與普通牛有差異。為了給機(jī)體運(yùn)動(dòng)提供所需能量，骨骼肌肌纖維類型的組成在不同物種中會(huì)發(fā)生明顯變化[9]，牦牛在高原低氧環(huán)境中能夠很好的運(yùn)動(dòng)，并成為牧民重要的生產(chǎn)生活工具，與其有發(fā)達(dá)的肌肉是分不開的。因此，為了觀察高原低氧對(duì)牦牛骨骼肌MYHC基因表達(dá)的影響，闡明低氧對(duì)牦牛骨骼肌肌纖維的影響，選取不同海拔梯度高原牦牛，利用免疫組織化學(xué)方法觀測(cè)其骨骼肌中快肌、慢肌含量及比例和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)牦牛骨骼肌MYHC各亞型mRNA的變化，來探討低氧對(duì)肌纖維類型的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及處理從青海省祁連縣(海拔3 900 m，以下簡(jiǎn)稱“祁連牦牛”)、青海省海晏縣(海拔3 200 m，以下簡(jiǎn)稱“海晏牦?！?、青海省循化縣(海拔2 200 m，以下簡(jiǎn)稱“循化牦?！?選擇臨床健康的牦牛各3頭。實(shí)驗(yàn)牛均于放牧地頸動(dòng)脈放血處死，迅速剖檢并采取部分骨骼肌組織置于4%多聚甲醛固定液中，另取部分置于液氮中保存，備用。所有實(shí)驗(yàn)牛取材部位相同。

1.2 免疫組化方法

1.2.1石蠟切片免疫熒光同源雙標(biāo)試驗(yàn) 將固定的肌肉組織做石蠟切片，石蠟切片后經(jīng)過常規(guī)的二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，進(jìn)行修復(fù)抗原程序，然后將切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，封閉內(nèi)源性的過氧化物酶。用PBS洗滌3次(5 min/次)，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS，滴加封閉血清，輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。再洗去一抗，后加對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育50 min。再用PBS洗滌3次(5 min/次)，切片稍甩干后在滴加TSA，避光室溫孵育10 min。孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次(5 min/次)。組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH 8.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理，然后滴加第2種一抗以及相對(duì)應(yīng)的二抗，方法同上。滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。用PBS 洗滌3次，5 min/次，洗去染液，然后加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片，最后于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光或者綠光，紅色為快肌，綠色為慢肌。

1.2.2圖像采集與結(jié)果判讀 將切片放入全景切片掃描儀，移動(dòng)成像形成文件夾。使用CaseViewer 2.2掃描瀏覽軟件選取目的區(qū)域進(jìn)行200倍成像。Image-Pro Plus 6.0分析軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)快、慢肌纖維的數(shù)量，測(cè)量每個(gè)視野快、慢肌纖維像素面積并計(jì)算出面積占比。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.3.1引物的設(shè)計(jì)與合成 于GenBank查詢牦牛(Bosmutus)MYH7、MYH2、MYH1、MYH4基因(XM_005909803.2、XM_014481982.1、XM_010-815980.3、XM_005907201.1)序列及β-actin內(nèi)參基因(XM_005887322.2)序列，利用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(引物信息序列見表1)，并交由生工生物工程有限公司合成。

表1 牦牛MYH7、MYH2、MYH1、MYH4基因引物序列

1.3.2總RNA提取和cDNA第一條鏈的合成 按照總RNA提取試劑盒說明書提取牦牛各組織中總RNA，使用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定濃度后，取2 μgD260/D280值介于1.8～2.0之間的RNA樣品，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄出cDNA的第一條鏈，置-20℃ 冰箱保存，備用。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系(總體積為20.0 μL)：cDNA 2.0 μL，目的上、下游引物各0.6 μL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ酶10.0 μL，ddH2O 6.8 μL,配制標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系。以β-actin為內(nèi)參，目的和內(nèi)參分別設(shè)3個(gè)平行。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s，變性-退火-延伸：95℃ 5 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s。采用相對(duì)ΔΔCt 法(2-ΔΔCt)對(duì)MYHC相關(guān)基因mRNA在牦牛骨骼肌組織中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 不同海拔牦牛骨骼肌中快、慢肌數(shù)量及面積比由圖1可知，3個(gè)海拔高度牦牛骨骼肌肌纖維快肌數(shù)量明顯多于其慢肌纖維數(shù)量，快肌纖維面積均明顯大于慢肌纖維。海晏牦牛骨骼肌纖維細(xì)胞核數(shù)量最多，骨骼肌結(jié)構(gòu)致密；祁連牦牛骨骼肌纖維細(xì)胞核最少，骨骼肌結(jié)構(gòu)較疏松；循化牦牛骨骼肌致密程度介于兩者之間。

2.1.1不同海拔高原牦?？?、慢肌數(shù)量比 由圖1～2可知，3個(gè)海拔高度牦牛快肌數(shù)量比隨海拔升高而增大，且各組兩兩相比差異顯著(P<0.05)，而慢肌數(shù)量比隨海拔升高而減小，差異顯著(P<0.05)。

A.循化牦牛骨骼肌(2 200 m)；B.海晏牦牛骨骼肌(3 200 m)； C.祁連牦牛骨骼肌(3 900 m)。紅色為快肌，綠色為慢肌，藍(lán)色為肌細(xì)胞細(xì)胞核圖1 循化牦牛、海晏牦牛與祁連牦牛骨骼肌光鏡結(jié)構(gòu) (×200)

注：上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同圖2 不同海拔高原牦?？?、慢肌數(shù)量比

2.1.2不同海拔高原牦牛快、慢肌面積比 由圖1,3結(jié)果可知，3個(gè)海拔高度牦?？旒∶娣e比隨海拔升高而增大，且各組兩兩相比差異顯著(P<0.05)，而慢肌面積比隨海拔增高而減小，差異顯著(P<0.05)。

圖3 不同海拔高原牦?？臁⒙∶娣e比

2.2 組織總RNA提取隨機(jī)選取D260 nm/D280 nm值介于1.8～2.0的各組織總RNA 進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，28S、18S、5S清晰可見(圖4)，說明所提取的RNA完整良好。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一條鏈。

2.3 牦牛骨骼肌組織中MYH7、MYH2、MYH1、MYH4 mRNA的比較

2.3.1牦牛骨骼肌中MYH7、MYH2、MYH1、MYH4 mRNA相對(duì)定量 由圖5可見目的基因和內(nèi)參基因熔解曲線峰值單一，引物特異性良好。由圖6可知，循化牦牛、海晏牦牛和祁連牦牛骨骼肌中都是MYH2 mRNA表達(dá)最高，顯著高于MYHC其他3個(gè)亞型(P<0.05)。循化牦牛骨骼肌中MYH7 mRNA的表達(dá)高于MYH1和MYH4 mRNA的表達(dá)，差異不顯著(P>0.05)。海晏牦牛和祁連牦牛骨骼肌中MYH1 mRNA的表達(dá)顯著高于MYH7 mRNA(P<0.05)，循化牦牛MYH7 mRNA的表達(dá)顯著高于MYH4 mRNA(P<0.05)，祁連牦牛MYH7 mRNA的表達(dá)高于MYH4 mRNA，但差異不顯著(P>0.05)。

圖5 目的基因(MYH7、MYH2、MYH1、MYH4)與內(nèi)參基因(β-actin)qRT- PCR熔解曲線

圖6 牦牛骨骼肌中MYH7、MYH2、MYH1、MYH4 mRNA相對(duì)定量

2.3.2不同海拔牦牛骨骼肌中MYH7、MYH2、MYH1、MYH4 mRNA相對(duì)定量 通過比較MYHC 4種亞型在不同海拔牦牛骨骼肌中的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平(圖7)，結(jié)果顯示MYH7 mRNA在海晏牦牛骨骼肌中表達(dá)最高，與循化牦牛和祁連牦牛相比差異顯著(P<0.05)。MYH2 mRNA在不同海拔牦牛中表達(dá)差異都不顯著(P>0.05)。MYH1 mRNA和MYH4 mRNA在海晏牦牛和祁連牦牛骨骼肌中的表達(dá)顯著高于循化牦牛(P<0.05)，且隨海拔升高表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。

圖7 不同海拔牦牛骨骼肌中MYH7、MYH2、MYH1、MYH4 mRNA相對(duì)定量

3 討論

快、慢肌纖維的面積比和數(shù)量比是衡量骨骼肌組織學(xué)特性的重要指標(biāo)?？臁⒙±w維面積比的變化與動(dòng)物品種、營(yíng)養(yǎng)狀況、環(huán)境條件有關(guān)。已有研究顯示[6]，平原動(dòng)物快肌纖維直徑比慢肌纖維直徑大，牦牛作為高原土著動(dòng)物，其肌纖維主要由無氧能力強(qiáng)的快肌纖維構(gòu)成，主要靠無氧呼吸為機(jī)體供能。本研究中，隨海拔升高，牦牛骨骼肌快肌面積比表現(xiàn)為逐漸增大，這與張湑澤等[10]在高原鼢鼠低氧適應(yīng)研究中，發(fā)現(xiàn)在高原低氧條件下訓(xùn)練會(huì)引起肌纖維內(nèi)收縮蛋白含量增加，MHC及各亞型mRNA表達(dá)量均顯著升高，從而使高原鼢鼠骨骼肌肌纖維肥大，橫截面積增加的結(jié)果一致。隨海拔升高，牦牛骨骼肌慢肌面積比表現(xiàn)為逐漸減小，這與山萌等[11-12]在甘肅鼢鼠適應(yīng)低氧的肌纖維類型和代謝特征的研究中，發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境下，骨骼肌中慢肌纖維因無法獲得足夠氧氣導(dǎo)致肌纖維發(fā)生萎縮，比例下降，蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)減少，蛋白分解相關(guān)基因表達(dá)增加，肌纖維橫截面積減小的結(jié)果一致。

動(dòng)物出生后骨骼肌肌纖維的數(shù)量基本維持恒定，但肌纖維類型在生長(zhǎng)過程中可發(fā)生轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化受物種、遺傳、環(huán)境等因素影響。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨海拔升高，牦牛骨骼肌快肌數(shù)量比逐漸增大，慢肌數(shù)量比逐漸減小，這與高曉娟[13]在低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌增殖的影響研究中，發(fā)現(xiàn)低氧和低氧運(yùn)動(dòng)可以造成快、慢肌發(fā)生轉(zhuǎn)化，快肌增多，慢肌減少的結(jié)果一致。已有研究表明[14]，快、慢肌纖維的數(shù)量與動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力密切相關(guān)，肌纖維粗大，收縮力強(qiáng)，有爆發(fā)力和速度。本研究所采的肌肉部位是后肢運(yùn)動(dòng)肌，后肢肌肉較前肢肌肉發(fā)達(dá)，是推動(dòng)身體前進(jìn)的主要?jiǎng)恿?，牦牛為了在高原低氧環(huán)境下更好的運(yùn)動(dòng)，其后肢骨骼肌通過具有更多的快肌纖維的方式來適應(yīng)高原低氧環(huán)境。

骨骼肌纖維類型的轉(zhuǎn)化歸根結(jié)底是肌纖維的構(gòu)成蛋白多肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，是多核肌纖維內(nèi)反映不同種類特征的基因得以表達(dá)的結(jié)果[15]。不同亞型的MYHC基因是表征肌肉纖維類型多樣性的最好標(biāo)志。本試驗(yàn)結(jié)果表明，循化牦牛、海晏牦牛和祁連牦牛骨骼肌中都是MYH2 mRNA表達(dá)最高，其次是MYH1，且與MYH7相比差異顯著。當(dāng)前大量研究證實(shí)[16-18]，在平原動(dòng)物骨骼肌中MYH7基因表達(dá)占主導(dǎo)，即Ⅰ型肌纖維百分比總量高于Ⅱa型、Ⅱx型和Ⅱb型，而本試驗(yàn)結(jié)果表明，在高原低氧影響下，牦牛的MYH7基因表達(dá)顯著低于MYH2和MYH1，即Ⅰ型肌纖維顯著低于Ⅱa型和Ⅱx型，這種表達(dá)特點(diǎn)是由于低氧影響下，MYH2和MYH1基因表達(dá)增強(qiáng)，使Ⅱa型和Ⅱx型肌纖維明顯增多，以適應(yīng)高原低氧環(huán)境的一種適應(yīng)性變化。

不同海拔牦牛骨骼肌MYHC各亞型之間相互比較，海晏牦牛和祁連牦牛MYH1和MYH4基因相對(duì)表達(dá)量隨海拔的升高而增加，且與循化牦牛相比差異顯著。說明牦牛骨骼肌中調(diào)控快肌纖維表達(dá)的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平比調(diào)控慢肌纖維表達(dá)的基因高，低氧誘導(dǎo)MYH7和MYH2基因向MYH1和MYH4基因轉(zhuǎn)化，其所對(duì)應(yīng)的肌纖維類型也發(fā)生相應(yīng)的轉(zhuǎn)化(Ⅰ型、Ⅱa型向Ⅱx型、Ⅱb型轉(zhuǎn)化)，即骨骼肌肌纖維發(fā)生了從慢肌纖維轉(zhuǎn)化為快肌纖維的變化。該結(jié)果與周力等[19]在幼齡和成年牦牛肌纖維類型轉(zhuǎn)化的研究觀點(diǎn)一致。力量或者大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練會(huì)導(dǎo)致MYHC亞型由Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)化，耐力型訓(xùn)練會(huì)導(dǎo)致MYHC亞型由Ⅱ型向Ⅰ型轉(zhuǎn)化或Ⅱb向Ⅱa型轉(zhuǎn)化，所以肌纖維類型會(huì)因?yàn)橥庠葱砸蛩氐挠绊懱幱谝环N動(dòng)態(tài)變化中[20]。

綜上所述，MYHC相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量與其對(duì)應(yīng)的快肌纖維和慢肌纖維含量變化規(guī)律基本相符，牦牛骨骼肌表現(xiàn)出這種趨勢(shì)可能是因?yàn)槠涮幱诟咴h(huán)境，隨海拔增高，環(huán)境中的氧含量不斷減少，肌纖維的氧化能力受到限制，牦牛為適應(yīng)低氧的環(huán)境，其骨骼肌發(fā)生了從慢肌纖維向快肌纖維轉(zhuǎn)化的變化。