何秀玲，孫 苗，石琳琳，李培鋒，關 紅，郭鳳英 (.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 000;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 職業(yè)技術(shù)學院,內(nèi)蒙古 包頭 0409)

代謝性炎癥(metaflammation)是一種慢性、低度的炎癥反應，是由營養(yǎng)過剩引起的，機體會表現(xiàn)出肥胖、糖脂代謝紊亂的癥狀，可使得體內(nèi)的代謝細胞大量募集免疫細胞，從而觸發(fā)代謝性炎癥，并增加TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的分泌量[1]。近幾年，我國寵物代謝性炎癥發(fā)病率逐年增高，嚴重影響寵物健康，但用于防治代謝性炎癥藥物的開發(fā)仍存在挑戰(zhàn)[2]。研究表明，膽酸(cholic acid,CA)有助于膽固醇的分解和脂肪的吸收，在高脂飼料中加入膽酸可抑制小鼠肥胖的發(fā)展[3]。研究者已發(fā)現(xiàn)膽酸對黏膜免疫和腸道炎癥中炎性因子的產(chǎn)生具有重要的調(diào)節(jié)作用，對小鼠因棉球?qū)е碌娜庋磕[、炎性組織中PGE2的含量以及對大鼠因甲醛引起的足跖腫脹均具有極顯著的抑制[4-6]。此外，膽酸可以抑制腹腔炎癥[7]。膽酸對代謝性炎癥的調(diào)節(jié)作用及其作用機制的研究目前尚未見有報道。據(jù)報道，參與糖脂代謝及炎癥反應相關的2個受體PPARα和LXRα與膽酸密切相關[8-9]，但膽酸促進脂肪分解，特別是調(diào)節(jié)代謝性炎癥的作用是否受PPARα、LXRα的調(diào)節(jié)，目前尚未闡明。

本研究檢測了膽酸處理的代謝性炎癥模型大鼠外周血中炎性因子和肝臟組織中的PPARα、LXRα兩者相關受體的變化，以期探討膽酸對代謝性炎癥的影響及其調(diào)控機理，為進一步開發(fā)寵物新型抗代謝性炎癥藥物提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級健康雄性SD大鼠，4周齡，體質(zhì)量110～130 g，購自北京維通利華生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑與儀器膽酸(純度98%以上，提取于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)藥理學與毒理學實驗室)；IL-1β ELISA試劑盒(ER008)購自上海依科賽生物有限公司；IL-6 ELISA試劑盒(CSB-F04640r)購自武漢華美生物試劑工程有限公司；MCP-1 ELISA試劑盒(Bsk23024)購自博奧森生物試劑有限公司；RNA提取試劑盒(AP-MN-MM-RNA-250)購自康寧科學有限公司；TB Green?Premix EX TaqTMⅡ(RR820A)、PrimeScriptTMRT Master Mix(RR-036A)購自日本TaKaRa 公司；4%多聚甲醛(BTN131248)購自索萊寶科技北京有限公司；石蠟(39601095)購自德國萊卡有限公司；無水乙醇(CFSR-10003218)、二甲苯(CFSR-100523418)購自國藥集團有限公司；蘇木精-伊紅染液(G1006)、Anti-PPAR alpha Rabbit pAb(GB11163)、Anti-LXR alpha Rabbit pAb(GB11350)購自武漢塞維爾生物有限公司。PCR儀(DYX-Ⅲ)購自上海森信公司；RT-PCR儀(VL1A7)購自美國ABI公司；電子顯微鏡(BX53F)購自日本奧林巴斯株式會社。

1.3 引物的合成用于定量分析的引物均由華大基因檢測公司合成，包括β-actin、IL-10、IL-8、MIP-1α、TNF-α，引物序列見表1。

表1 β-actin、IL-10、IL-8、MIP-1α、TNF-α基因引物序列

1.4 代謝性炎癥模型大鼠的構(gòu)建4周齡雄性SD大鼠60只，試驗將12只飼喂基礎飼料，48只則喂養(yǎng)高脂飼料并自由飲水。每日測定大鼠體質(zhì)量，計算增重率。造模成功的標準為高脂飼料的大鼠體質(zhì)量超過喂養(yǎng)普通飼料大鼠體質(zhì)量的20%[10]。

1.5 試驗給藥持續(xù)時間將大鼠分為陰性對照組(NC)、模型組(MOD)、膽酸低劑量組(CL)、膽酸中劑量組(CM)及膽酸高劑量組(CH)。膽酸為白色粉末狀藥物，用純水做溶劑，稱取大鼠體質(zhì)量，計算給藥量。給藥方式、給藥劑量見表2。

表2 試驗分組及給藥

1.6 代謝性炎癥模型大鼠肝臟組織形態(tài)學的觀察大鼠的肝臟形態(tài)以HE染色法觀察。取同部位的大鼠肝臟組織，于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，并對固定完成的組織塊進行脫水、透明、包埋、切片、染色及封片，顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)。

1.7 膽酸對代謝性炎癥模型大鼠相關炎性因子的影響

1.7.1膽酸對代謝性炎癥模型大鼠外周血中炎性因子含量的測定 大鼠血清中IL-1β、IL-6及MCP-1的含量用ELISA法檢測。根據(jù)標準孔繪制標準曲線，并根據(jù)標曲公式計算樣品中的IL-6、IL-1β及MCP-1含量。

1.7.2膽酸對代謝性炎癥模型大鼠肝臟中炎性因子表達量的檢測 大鼠肝臟組織中IL-10、TNF-α、MIP-1α及IL-8 mRNA相對表達量用RT-qPCR法檢測。將大鼠的肝臟組織研磨并提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行擴增，目的基因mRNA的相對表達量需用2-△△Ct計算。計算公式如下：

△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct試驗組-△Ct陰性對照組。

1.8 膽酸對代謝性炎癥模型大鼠肝臟中PPARα和LXRα分布及表達的影響大鼠肝臟組織中PPARα和LXRα表達的分布及其表達量用免疫組化法檢測。將肝臟組織切片進行脫蠟及水化、抗原修復、降低染色劑非特異性結(jié)合、孵育一抗、孵育二抗、顯色及封片，然后在顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 膽酸對代謝性炎癥模型大鼠肝臟細胞形態(tài)的影響結(jié)果如圖1所示，蘇木精染液把肝臟細胞核呈現(xiàn)為藍紫色，伊紅染液把細胞質(zhì)呈現(xiàn)為紅色。顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織HE染色切片，陰性對照組大鼠的肝臟細胞核大呈現(xiàn)圓形、核膜界限清晰、細胞排列整齊；與陰性對照組大鼠的肝臟組織對比，模型組大鼠的肝臟組織中出現(xiàn)脂肪空泡以及巨噬細胞為主的炎性細胞聚集，而給予膽酸治療的高、中、低劑量組大鼠的肝臟細胞中細胞形態(tài)和大小均正常，且炎性細胞減少以及脂肪蓄積得到改善。

注：模型組圖中白色箭頭所指位置有炎性細胞聚集，綠色箭頭所指位置為脂肪空泡圖1 肝臟組織HE染色切片結(jié)果 (HE，×40)

2.2 膽酸對代謝性炎癥模型大鼠相關炎性因子的影響

2.2.1膽酸對代謝性炎癥模型大鼠外周血中炎性因子的影響 結(jié)果如圖2～4所示，與陰性對照組相比，模型組大鼠外周血中IL-1β的含量雖有增加的趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)，而MCP-1的含量則顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，膽酸中、低劑量組大鼠外周血中MCP-1的含量顯著降低(P<0.05)，而膽酸高劑量組大鼠外周血中MCP-1的含量極顯著性降低(P<0.01)，且膽酸高劑量組大鼠外周血中IL-6的含量較模型組顯著降低(P<0.05)；膽酸高劑量組大鼠外周血中IL-6的含量組較低劑量組極顯著降低(P<0.01)，膽酸高劑量組大鼠外周血中MCP-1的含量較中劑量組顯著升高(P<0.05)。

注：大寫字母相同，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；大小寫字母均不同表示差異極顯著(P<0.01)；含相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)?！?#”表示模型組與陰性對照組相比差異極顯著(P<0.01)；“#”表示模型組與陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)。下同圖2 大鼠外周血清中IL-6含量

圖3 大鼠外周血清中MCP-1含量

圖4 大鼠外周血清中IL-1β含量

2.2.2膽酸對代謝性炎癥模型大鼠肝臟中相關炎性因子表達量的影響 結(jié)果如圖5～8所示，與陰性對照組相比，模型組大鼠肝臟內(nèi)IL-10的表達量雖增加，但無顯著性差異(P>0.05)，而TNF-α的表達量顯著增加(P<0.05)，IL-8及MIP-1α的表達量極顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，膽酸中、低劑量給藥組大鼠肝臟內(nèi)IL-10的表達量均顯著性降低(P<0.05)，膽酸高劑量組大鼠肝臟內(nèi)IL-10的表達量極顯著性降低(P<0.01)，膽酸中劑量組大鼠肝臟內(nèi)TNF-α的表達量極顯著性降低(P<0.01)，膽酸高、中、低劑量組大鼠肝臟內(nèi)IL-8及MIP-1α的表達量極顯著降低(P<0.01)；膽酸中劑量組大鼠肝臟內(nèi)IL-8的表達量極顯著低于膽酸低、高劑量組(P<0.01)。

圖5 IL-10 mRNA表達量

圖6 IL-8 mRNA表達量

圖7 TNF-α mRNA表達量

圖8 MIP-1α mRNA表達量

2.3 膽酸對代謝性炎癥模型大鼠肝臟中PPARα和LXRα分布和表達的影響

2.3.1大鼠肝臟中PPARα分布和表達 結(jié)果如圖9所示，大鼠肝臟組織細胞內(nèi)PPARα抗原與其抗體反應后，染色越深表明PPARα表達量越高；而陰性對照組，因無抗原抗體結(jié)合反應，細胞核呈藍染。

注：圖中紅色箭頭所指為PPARα在肝臟中的分布及表達量圖9 PPARα免疫組化結(jié)果 (IHC,×40)

平均光密度分析結(jié)果如圖10所示，與陰性對照組相比，模型組大鼠肝臟中的PPARα陽性表達量極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，膽酸高、中劑量組大鼠肝臟中的PPARα陽性表達量極顯著升高(P<0.01)，膽酸低劑量組大鼠肝臟中的PPARα陽性表達量顯著升高(P<0.05)；膽酸高、中劑量組大鼠肝臟中的PPARα陽性表達量極顯著高于低劑量組(P<0.01)。

圖10 PPARα表達量

2.3.2大鼠肝臟中LXRα分布及表達 圖11結(jié)果顯示，肝臟組織細胞內(nèi)LXRα抗原與其抗體反應后，染色越深表明LXRα的表達量越高；而陰性對照組，無抗原抗體結(jié)合的細胞核呈藍染。

注：圖中紅色箭頭所指為LXRα 在肝臟中的分布及表達量圖11 LXRα免疫組化結(jié)果 (IHC，×40)

圖12平均光密度分析結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，模型組大鼠肝臟中的LXRα陽性表達量無顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比，膽酸高、中、低劑量組大鼠肝臟中的LXRα陽性表達量極顯著降低(P<0.01)；膽酸高、中、低劑量組大鼠肝臟中的LXRα陽性表達量之間無顯著性差異(P>0.05)。

圖12 LXRα表達量結(jié)果

3 討論

本研究觀察經(jīng)口服給予代謝性模型大鼠不同劑量的膽酸30 d后的肝臟組織病理形態(tài)學變化，測定了血清和肝臟中的炎性因子，結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟組織出現(xiàn)了脂肪空泡及炎性細胞的聚集，血清和肝臟中TNF-α、MCP-1、IL-8、MIP-1α含量均顯著升高,這與有關報道相一致。據(jù)報道，用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠，持續(xù)10周左右，就會出現(xiàn)因肥胖造成的攝食量降低，行動遲緩，容易應激的表現(xiàn)，處死檢測血清中IL-6、TNF-α、MCP-1、IL-1β等炎癥因子的含量較普通飼料喂養(yǎng)的大鼠有所升高[11]。肝臟在動物體內(nèi)有調(diào)節(jié)能量代謝、免疫反應和解毒的功能，而長期高脂喂養(yǎng)的大鼠，肝臟會隨喂養(yǎng)時間出現(xiàn)不同程度脂肪變性，脂肪細胞的凋亡、細胞內(nèi)JAK2酶、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激都是促進炎癥反應的因素[12]。本研究結(jié)果表明，膽酸可顯著降低模型組大鼠IL-6含量及IL-10表達量(P<0.05)，極顯著降低MCP-1含量及TNF-α、IL-8、MIP-1α的表達量(P<0.05)，且結(jié)合病理形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)給予膽酸治療的代謝性炎癥大鼠，肝臟組織中炎性細胞減少，提示膽酸能降低代謝性炎癥模型大鼠的炎癥反應。

文獻表明，膽酸通過降低代謝性炎癥模型大鼠脂肪濕重、脂肪系數(shù)、TG、CHO的含量，緩解大鼠體內(nèi)脂肪蓄積，從而降低大鼠增重率；伴隨著脂肪含量的降低，由脂肪代謝障礙引起的炎癥因子，如IL-6、MCP-1的含量、TNF-α、IL-8、MIP-1α的表達量也顯著降低。肝臟作為脂肪代謝的重要調(diào)節(jié)器官，為了研究膽酸對代謝性炎癥的調(diào)節(jié)機制，采用肝臟組織免疫組化試驗，確定了2個與代謝性炎癥相關，并且在肝臟細胞核內(nèi)表達的受體PPARα和LXRα。據(jù)報道，膽酸的天然受體FXR可以介導脂肪代謝，抗炎免疫調(diào)節(jié)以及血糖調(diào)節(jié)等能量代謝[13]。PPARα及LXRα作為核受體，與FXR關系密切，同樣調(diào)節(jié)體內(nèi)能量代謝和抗炎免疫系統(tǒng)[14]。激活FXR，能上調(diào)PPARα的表達，抑制SREBP-1c及下游通路，進而降低膽固醇、脂肪酸及TG的生成，從而降低大鼠體質(zhì)量的增長[15]。PPARα被激活后可以抑制NF-κB信號，降低促炎因子的分泌，阻遏炎癥反應[16]。LXRα被激活后，則上調(diào)SREBP-1c及下游通路，促使HDL、LDL以及TG的生成?；罨腇XR又通過激活SHP的表達，從而抑制LXRα及下游通路SREBP-1c的轉(zhuǎn)錄表達，降低脂肪的合成[17]。本研究對免疫組化切片做平均光密度分析的結(jié)果表明，不同劑量的膽酸給予代謝性炎癥模型大鼠后，大鼠肝臟細胞內(nèi)PPARα表達量上調(diào)，而LXRα的表達則受到抑制，該結(jié)果與相關報道的結(jié)果相一致，提示膽酸是通過極顯著上調(diào)代謝性炎癥大鼠肝臟細胞內(nèi)PPARα的表達，以及極顯著抑制LXRα的表達降低脂肪的生成，從而抑制代謝性炎癥反應。此外，本試驗建立的代謝性炎癥模型大鼠PPARα表達量極顯著低于陰性對照組(P<0.01)，這可能與線粒體功能受損，PPARα對脂肪酸的β氧化受到抑制，引起負反饋調(diào)節(jié)，從而使PPARα的表達量下調(diào)。