飼糧添加色氨酸對熱應激肉雞肝臟、腸道抗氧化能力和炎癥反應的影響

歐陽經(jīng)鑫，李秋粉，周 華，鄭 俊，郭帥鵬，劉三鳳，黎觀紅* (1.江西農(nóng)業(yè)大學 江西省動物營養(yǎng)重點實驗室,江西 南昌 330045；.江西農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，江西 南昌 330045)

隨著全球氣候變暖以及集約化養(yǎng)殖的普及，加之中國南方地區(qū)高溫高濕的氣候特征，熱應激是畜牧業(yè)發(fā)展需面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。當環(huán)境溫度超過機體的等熱區(qū)上限，機體不能維持產(chǎn)熱和散熱的穩(wěn)態(tài)，就會發(fā)生熱應激[1]。而家禽因其代謝速率快、體溫偏高、被覆羽毛、缺乏汗腺等生理特性，更容易受到熱應激[2]。熱應激對肉雞的影響涉及許多方面，包括使畜禽體溫度升高，采食量降低，代謝異常，氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，免疫機能、屏障功能下降等現(xiàn)象，進而導致機體組織器官的損傷甚至是死亡[3-6]。當機體組織受損后，受損細胞釋放內(nèi)源性損傷相關分子模式(DAMPs)并激活下游信號通路，誘導炎癥因子的分泌而引發(fā)炎癥反應[7-9]。研究表明活性氧，特別是來自線粒體的活性氧，可以激活NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)炎癥小體，增加白細胞介素(IL)-1β、IL-18的釋放[10-12]。張宏男等[13]研究發(fā)現(xiàn)熱應激可以激活NLRP3炎癥小體，敲除NLRP3基因可以減輕全身性炎癥反應，維持腸道屏障的完整性，減輕組織的損傷程度。因此，NLRP3炎癥小體的激活可能參與了熱應激導致的炎癥反應過程。

色氨酸(Trp)是畜禽的必需氨基酸，也是家禽飼糧中的限制性氨基酸[14]。色氨酸及其代謝產(chǎn)物在動物采食量、行為、應激和免疫反應等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[15]。岳云雙[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加色氨酸可以提高應激條件下肉雞的生產(chǎn)性能，抑制應激反應引起的腸道促炎細胞因子分泌，維持腸道正常屏障功能。褪黑素是色氨酸的代謝產(chǎn)物之一，被認為是一種有效的自由基清除劑和氧化還原活性酶的調(diào)節(jié)劑[17]。尹華祺[18]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以增加熱應激小鼠血液中白細胞、單核細胞、粒細胞等免疫細胞數(shù)量，調(diào)節(jié)免疫功能，提高超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性，降低丙二醛(MDA)的含量，有效緩解熱應激導致的組織損傷。因此，本研究以AA肉雞為試驗對象，探討熱應激對肉雞肝臟和腸道抗氧化能力及炎癥反應的影響和飼糧添加色氨酸的調(diào)節(jié)作用，為色氨酸緩解動物應激損傷提供進一步的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計選取健康、體質(zhì)量接近的180只18日齡雌性AA肉雞，隨機分為3個處理組，每組6個重復，每個重復10只。適應性飼養(yǎng)至21日齡開始進行溫度控制，試驗期為21 d。適溫組(TN)肉雞飼養(yǎng)于正常溫度(23±1)℃，飼喂基礎飼糧；熱應激組(HS)肉雞飼養(yǎng)于高溫環(huán)境(34±1)℃、8 h/d，飼喂基礎飼糧；熱應激+0.18%色氨酸組(HS+0.18% Trp)肉雞飼養(yǎng)于高溫環(huán)境(34±1)℃、8 h/d，飼喂基礎飼糧+0.18%色氨酸。本試驗所用的L-色氨酸購自韓國希杰食品有限公司，純度>98%。

1.2 試驗日糧與動物飼養(yǎng)管理本試驗采用玉米-豆粕型基礎飼糧，參考NRC(1994)推薦的營養(yǎng)水平進行配制，基礎日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。通過調(diào)節(jié)谷氨酸添加量使各組飼糧保持等氮等能水平。試驗在江西農(nóng)業(yè)大學試驗基地的試驗雞房進行。試驗雞采用4層籠籠養(yǎng)。試驗開始前對雞舍及周圍環(huán)境進行充分沖洗和嚴格消毒，雞只按正常免疫程序進行免疫。試驗期熱應激從21日齡開始至42日齡結束。HS組溫度控制如下：每天從9:00-17:00 維持(34±1)℃ 8 h，共21 d。試驗期間雞只自由采食和飲水。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎) %

1.3 樣品采集與制備于42日齡時，肉雞提前禁食12 h，期間自由飲水。從每個重復中隨機選取 1 只雞，斷頸處死，剖開腹腔，取肝臟、空腸和回腸，用PBS沖洗干凈腸道內(nèi)容物，吸水紙吸干后，刮取空腸、回腸黏膜，置于無菌無酶凍存管中，液氮速凍，-80℃ 保存用于后續(xù)分析。

1.4 測定指標與方法

1.4.1肝臟、腸道黏膜抗氧化指標的測定 用生理鹽水制備10%的組織勻漿，離心取上清進行試驗檢測，采用BCA法測定上清液的蛋白濃度。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，嚴格按照說明書操作測定肝臟、腸道黏膜SOD、過氧化氫酶(CAT)、GSH-Px的活力、總抗氧化能力(T-AOC)和MDA的含量。

1.4.2肝臟細胞因子含量的測定 用PBS制備10%的肝臟組織勻漿，5 000×g離心10 min取上清進行檢測，采用BCA法測定上清液的蛋白濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，檢測肝臟中IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。檢測方法嚴格按照說明書進行。

1.4.3實時熒光定量PCR 使用TransZol Up(北京全式金生物技術有限公司)裂解樣品，提取肉雞肝臟和腸道黏膜總RNA，具體操作按說明書進行。RNA提取完成后，用微量紫外分光光度計(NanoDrop ND-1000)測定RNA樣品的純度和濃度，保證D260 nm/D280 nm比值均在1.8～2.0之間，使用EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)，按說明加入相應體系，將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒進行實時熒光定量反應，采用以下熱循環(huán)條件:94℃預變性30 s；94℃變性5 s，在57～60℃退火延伸30 s，共循環(huán)42次。目的基因和內(nèi)參基因β-actin的引物序列見表2，并由華大基因設計合成。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表2 熒光定量PCR引物序列

2 結果

2.1 飼糧添加色氨酸對熱應激肉雞肝臟和腸道黏膜抗氧化能力的影響由表3可知，與TN組相比，HS組肉雞肝臟GSH-Px、回腸黏膜CAT活性和T-AOC顯著降低(P<0.05)，肝臟CAT、回腸黏膜SOD活性極顯著降低(P<0.01)；與HS組相比，HS+0.18%Trp組肝臟、空腸黏膜T-AOC顯著升高(P<0.05)，肝臟CAT、空腸和回腸黏膜SOD活性極顯著升高(P<0.01),然而各組間的MDA含量無顯著性差異(P>0.05)。

表3 飼糧添加色氨酸對熱應激肉雞肝臟和腸道黏膜抗氧化能力的影響

2.2 飼糧添加色氨酸對熱應激肉雞肝臟炎癥細胞因子含量的影響由表4可知，與TN組相比，熱應激顯著升高肝臟IL-6和TNF-α的含量(P<0.05)，極顯著提高肝臟IL-1β和IL-18的含量(P<0.01)。與HS組相比，添加0.18% Trp顯著降低熱應激肉雞肝臟IL-1β和TNF-α的含量(P<0.05)，極顯著降低熱應激肉雞肝臟IL-18的含量(P<0.01)。

表4 飼糧添加色氨酸對熱應激肉雞肝臟炎癥細胞因子含量的影響 ng/g

2.3 飼糧添加色氨酸對熱應激肉雞肝臟、腸道黏膜炎癥小體相關基因相對表達量的影響由表5可知，與TN組相比，熱應激顯著升高肝臟IL-1β和IL-18以及空腸黏膜IL-12A、IL-12B和IL-18的mRNA相對表達量(P<0.05)，并極顯著提高空腸黏膜NLRP3、IL-1β和TNF-α的mRNA相對表達量(P<0.01)。與TN組相比，熱應激顯著升高回腸黏膜NLRP3的mRNA相對表達(P<0.05)，并極顯著升高回腸黏膜Caspase-1、IL-1β和TNF-α的mRNA相對表達量(P<0.01)。與HS組相比，飼糧添加色氨酸顯著降低熱應激肉雞肝臟TNF-α以及空腸黏膜IL-12A和IL-12B的mRNA相對表(P<0.05)，并極顯著降低熱應激肉雞空腸黏膜NLRP3、IL-18和TNF-α的mRNA相對表達量(P<0.01)。與HS組相比，飼糧添加色氨酸極顯著降低熱應激肉雞回腸黏膜NLRP3、Caspase-1、IL-1β和TNF-α的mRNA相對表達量(P<0.01)。

表5 飼糧添加色氨酸對熱應激肉雞肝臟、腸道黏膜炎癥小體相關基因相對表達量的影響

3 討論

熱應激是氧化應激的重要誘導因子[6]，使機體內(nèi)有毒性的活性氧自由基過度積累，導致機體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡，造成核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子的氧化損傷[19]。機體有自身抗氧化防御系統(tǒng)以維持機體自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，其中SOD、GSH-Px和CAT是組成抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，SOD能夠?qū)2-歧化成為H2O2，然后GSH-Px和CAT進一步將H2O2分解為H2O[20]。T-AOC能夠反映機體防御體系的總抗氧化能力。MDA是多不飽和脂肪酸過氧化的最終產(chǎn)物，其含量能夠反映機體脂質(zhì)過氧化的程度[21]。本試驗研究表明，與TN組相比，熱應激顯著降低SOD、GSH-Px、CAT抗氧化酶的活性及T-AOC的含量。這一結果與前人在肉雞、綿羊上的研究結果一致[22-24]，表明長期的熱應激會破壞機體組織氧化-還原平衡，降低機體的抗氧化能力。色氨酸是血清素和褪黑素的重要前體，在維持肉雞采食量、生長性能、免疫反應和抗應激等方面發(fā)揮著重要作用[25-26]。MUND等[27]研究發(fā)現(xiàn)，高于NRC推薦水平的色氨酸可提高肉雞的生長性能、免疫反應和抗氧化狀態(tài)。LIU等[28]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.15%色氨酸能夠提高斷奶仔豬空腸黏膜SOD、GSH-Px和CAT活性，降低MDA含量，緩解由敵草快引起的腸道氧化應激損傷。在本研究中，飼糧添加色氨酸提高了SOD、CAT的活力及T-AOC的含量，這一結果與前人研究結果一致。以上結果表明，飼糧中添加色氨酸能夠提高機體的抗氧化能力，清除過度產(chǎn)生的有毒性活性氧自由基，緩解熱應激引起的肉雞組織氧化應激損傷。

炎癥是一種機體對抗外界有害刺激或病原體的自然防御機制[29]。適度的炎癥反應可以幫助機體對抗病原體的入侵，清除壞死的細胞，促進機體正常功能的恢復。然而過度的炎癥反應反而會加重損傷[30]。氧化應激造成組織細胞損傷并釋放損傷相關模式分子，并被機體組織相應的模式識別受體識別進而激活下游信號通路，誘導炎癥因子的表達，引起組織細胞的不可逆損傷[31]。TNF-α、IL-1β、IL-6是炎癥反應中主要的炎癥因子，少量分泌能夠與免疫細胞上的受體結合發(fā)揮免疫調(diào)控作用，但隨其分泌量增加，炎癥反應被加劇而導致機體組織損傷[23]。IL-12能激活和誘導自然殺傷細胞的增殖、細胞毒性和細胞因子的產(chǎn)生[32]。DENG等[33]研究表明，34℃高溫環(huán)境下持續(xù)熱應激提高肉雞血清TNF-α、IL-6和皮質(zhì)酮的含量。TNF-α等促炎癥因子的過量產(chǎn)生可導致包括腸道在內(nèi)的器官出血和壞死[34]。李秋粉[35]研究報道，21 d的熱應激顯著升高肉雞血清促炎因子TNF-α、IL-6的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，與TN組相比，熱應激升高肝臟炎癥因子IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的含量，這與前人的研究結果一致，同時也說明熱應激能夠促進炎癥因子的分泌，引發(fā)機體炎癥反應。NLRP3炎癥小體是研究最為廣泛及深入的炎癥小體，并與多種人類自身炎癥和自身免疫疾病有關[36]。炎癥小體是由NOD樣受體蛋白3(NLRP3)、細胞凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)以及半胱天冬酶前體(pro-Caspase-1)組成的細胞內(nèi)多蛋白復合物，通過獨特的模式識別受體響應多種外源性(包括脂多糖、細菌鞭毛等)和內(nèi)源性危險信號(包括活性氧、K+外流、Ca2+內(nèi)流和溶酶體損傷等)的刺激，招募和激活促炎蛋白酶Caspase-1，活化的Caspase-1可將pro-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟的生物活性形式釋放[13,36-37]。王偉等[38]研究表明，熱應激可導致肝NLRP3炎癥小體的激活，促進下游級聯(lián)反應中Caspase-1、IL-1β、IL-6的表達上調(diào)，誘導肝臟炎癥損傷，而抑制NLRP3表達水平可有效拮抗下游促炎因子的表達。在本研究中，熱應激升高肉雞NLRP3、Caspase-1及促炎細胞因子的mRNA相對表達量，此結果表明，NLRP3炎癥小體激活下游級聯(lián)反應共同參與熱應激誘導的炎癥反應，這與前人的研究結果一致[38]。本研究中，飼糧添加色氨酸顯著降低熱應激肉雞肝臟炎癥細胞因子及NLRP3信號通路的mRNA表達。YUE等[39]研究發(fā)現(xiàn)，慢性應激導致IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎細胞因子mRNA水平升高以及抗炎細胞因子IL-10 mRNA表達量下降，而飼糧添加色氨酸能部分逆轉(zhuǎn)以上變化，這與本試驗結果基本一致。由此可見，色氨酸可能通過抑制NLRP3信號通路的表達，抑制機體的促炎反應，以此緩解由熱應激引起的機體炎癥損傷。

綜上所述，長期熱應激會導致肉雞肝臟和腸道產(chǎn)生氧化應激，降低組織的抗氧化能力，同時誘發(fā)肝臟和腸道炎癥反應。飼糧添加色氨酸能夠緩解熱應激引起的氧化應激損傷，通過抑制NLRP3炎癥小體及下游級聯(lián)反應，減輕炎癥反應。