肖明昆，嚴 煒，熊賢坤，沈紹斌，宋記明，易懷鋒，張林輝

（云南省農(nóng)業(yè)科學院 熱帶亞熱帶經(jīng)濟作物研究所，云南 保山 678000）

密碼子是mRNA 分子中一系列三聯(lián)體核苷酸，在遺傳信息傳遞中起著重要作用[1-3]。在翻譯過程中編碼同種氨基酸的幾個同義密碼子使用頻率不均等的現(xiàn)象被定義為密碼子偏好性[4]。密碼子偏好性被認為是影響外源基因表達的重要因素，密碼子偏好性不僅反映了物種起源、進化及突變方式，另外也會對蛋白質的表達及基因功能等造成影響[5-7]。因此，密碼子使用偏好性在解釋基因調控的分子生物學原理、蛋白質結構、基因表達和遺傳信息傳遞等方面均具有極其重要的意義[8-10]。生物中普遍存在同義密碼子非均衡使用，在進化過程中形成了獨特的密碼子使用偏好性。密碼子偏好性不僅受到長期進化過程中的環(huán)境因素、堿基突變、基因漂移的影響，而且還受到基因組大小、tRNA 豐度和基因表達水平的影響[4]。突變和自然選擇壓力是影響密碼子使用偏好性的兩個主要因素，對導致云南樟葉綠體基因組密碼子偏好性的相關因素進行剖析，可以明確影響密碼子使用偏好性的主要因素。

葉綠體是高等植物所特有的能量轉換器，擁有相對獨立的遺傳物質，其結構高度保守，在揭示物種起源、進化、親緣關系等方面具有重要作用[11]。除此之外，葉綠體基因拷貝數(shù)多，細胞內(nèi)的葉綠體基因組數(shù)量較多[12]，如果將目的基因成功轉入到其基因組內(nèi)，便可迅速獲得高表達量的轉基因后代[13]。目前，葉綠體基因工程已在擬南芥Arabidopsis thaliana[14]和棉花Gossypium hirsutum[15]等植物中轉化成功。但是從現(xiàn)有的研究看來，對葉綠體基因工程的涉獵仍較少。對葉綠體基因組密碼子的堿基組成進行研究，有助于提高遺傳轉化效率及目的基因的穩(wěn)定表達[4]，而基于最優(yōu)密碼子設計的葉綠體基因表達載體可以提高葉綠體基因組的基因表達水平[16]。在云南樟葉綠體基因組中檢測到密碼子的使用模式和最佳密碼子，可能對探索物種進化和提高外源性基因的表達具有重要意義。

云南樟Cinnamomum glanduliferum是我國重要的經(jīng)濟樹種。其終年常綠，外形美觀，具有優(yōu)良的材質，是園林綠化的首選良木。同時，提取的樟腦及樟油在醫(yī)藥、工業(yè)、香料等行業(yè)具有廣泛的應用前景，木材可制作家具，根、樹皮、葉及果等可入藥[17-19]。因此，云南樟具有較高的栽培利用價值。然而目前關于云南樟的研究多集中在良種選育、栽培、引種馴化和精油成分等方面[20-21]，缺乏分子生物學等方面的研究，關于云南樟葉綠體基因組密碼子偏好性的研究尚未見報道。鑒于此，本研究對云南樟葉綠體基因組密碼子的使用模式、偏好性及其成因進行分析，以期為云南樟葉綠體基因組學的研究提供理論依據(jù)，同時豐富云南樟分子生物學的研究內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材 料

在云南省農(nóng)科院熱帶亞熱帶經(jīng)濟作物研究所種質資源圃中采集幼嫩完整的云南樟葉片，樣品保存于干冰中，由浙江安諾優(yōu)達生物科技有限公司進行葉綠體基因組的測序，后將測序結果提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫中（登錄號為：MW369062）。對云南樟葉綠體基因組進行分析時，為降低誤差，從83 條CDS（Coding DNA sequence）中剔除序列長度小于300 bp、內(nèi)部含有終止密碼子的序列和重復基因，最終篩選出52 條以ATG 為起始密碼子，TAA、TGA、TAG 為終止密碼子的基因序列用于后續(xù)分析。

1.2 方 法

運用CodonW 1.4.2 軟件對云南樟葉綠體基因組中篩選出的52 條CDS 進行分析，獲得各CDS的有效密碼子數(shù)（ENC）和同義密碼子相對使用頻率（RSCU）。通過在線軟件CUSP 分析獲得不同基因的GC 總含量及各個密碼子第1 位（GC1）、第2 位（GC2）、第3 位（GC3）堿基的GC 含量，根據(jù)獲得的參數(shù)繪制相關系數(shù)矩陣圖。以GC12（GC1、GC2 的平均值）為縱坐標、GC3 為橫坐標進行中性繪圖分析，初步判斷云南樟葉綠體基因組密碼子使用偏好性受選擇的影響或受突變的影響。以GC3 為橫坐標、ENC 值為縱坐標進行ENC-plot分析，分析突變在云南樟葉綠體基因組密碼子使用模式中的作用。以A3/（A3+T3）為縱坐標，G3/（G3+C3）為橫坐標進行PR2-plot 分析（偏倚分析），分析云南樟葉綠體基因各密碼子第3 位堿基A、T和G、C 之間突變是否平衡。通過以上分析探明云南樟葉綠體基因組密碼子的使用偏好性。以云南樟葉綠體基因52 條CDS 的ENC 值為偏好性標準，由低到高對其進行排序，分別選出兩端10%的基因，建立高、低表達庫，ENC 值小的為高表達庫，ENC 值大的為低表達庫。選取RSCU 值＞1 的為高頻密碼子，ΔRSCU≥0.08（ΔRSCU=RSCU 高表達?RSCU 低表達）的密碼子作為高表達密碼子[22]，將同時滿足高頻和高表達的密碼子確定為云南樟葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子。

2 結果與分析

2.1 云南樟密碼子堿基組成

應用CodonW 1.4.2 和在線軟件CUSP 對符合要求的CDS的堿基組成及ENC值進行分析（圖1）。結果表明，GC1 含量為35.02%～58.62%，平均值為47.61%；GC2 含量為27.67%～55.73%，平均值為40.28%；GC3 含量為22.44%～36.29%，平均值為30.67%。全部3 個位置的GC 含量為32.09%～45.45%，平均值為39.55%。各位置的GC 含量平均值從高到低依次為GC1＞GC2＞GC3，其第3 位平均GC 含量遠低于第1 位和第2位，表明云南樟密碼子3個位置的堿基組成不均衡，且第3 位密碼子尤其偏好使用A 和T（U）堿基。

圖1 云南樟葉綠體基因組密碼子不同位置的GC 含量及ENC 值Fig.1 GC content and ENC value of different codon positions in Cinnamomum glanduliferum chloroplast genome

ENC 的理論值在20～ 61 之間，值越小表示偏好性越強。一般以ENC 值為35 來區(qū)分密碼子偏好性強弱[23]，當ENC 值大于35 時表明密碼子使用偏好性較弱。根據(jù)此標準對云南樟的ENC值進行判別，發(fā)現(xiàn)云南樟各CDS 的ENC 值在36.82～57.85 之間，52 條CDS 序列的ENC 值均大于35，說明云南樟葉綠體基因組密碼子偏好性較弱。

對云南樟密碼子偏好性參數(shù)進行相關性分析（圖2），結果顯示，GC 與GC1、GC2、GC3 之間呈顯著或極顯著相關關系（P＜0.05），GC3和GC1、GC2 之間無顯著相關關系，說明密碼子3 個位置堿基的組成存在差異性。ENC 與GC3 呈顯著相關關系，表明第3 位堿基對云南樟密碼子的使用偏好性影響較大。GC3、ENC 與N（密碼子數(shù)目）呈顯著相關關系，表明基因序列長度會對GC3 和有效密碼子數(shù)產(chǎn)生影響。

圖2 密碼子數(shù)各位置GC 含量、數(shù)量與ENC 值的相關系數(shù)圖Fig.2 Correlation coefficient diagram of GC content,quantity and ENC value of different codons

對云南樟葉綠體基因組的同義密碼子相對使用頻率進行分析（圖3），發(fā)現(xiàn)RSCU＞1 的密碼子有31 個，分別為UCU、CGU、GUU、ACU、

圖3 云南樟各氨基酸的同義密碼子RSCU 分析Fig.3 Relative synonymous codon usage analysis of each amino acid in C.glanduliferum

CCU、GGU、GCU、AUU、UAU、UUU、CAU、UGU、GAU、AAU、CUU、AGU、UUA、UAA、AAA、GAA、CAA、UCA、CGA、GUA、ACA、CCA、GGA、GCA、AGA、UUG、UCC。其中，以U 結尾的最多，有16 個，以A 結尾13 個，以G 結尾1 個，以C 結尾1 個。說明云南樟葉綠體基因組偏好以A 或U 結尾的密碼子。

2.2 中性繪圖分析

中性繪圖分析表明（圖4），GC12 范圍在0.341～0.550 之間，GC3 在0.224～0.368 之間，GC12 與GC3 的相關系數(shù)為0.040，回歸系數(shù)為-0.055 1?？梢?，云南樟葉綠體基因組中GC12和GC3 無顯著的相關性，說明GC1、GC2、GC3的堿基組成存在差異，因此，選擇是云南樟葉綠體基因組密碼子偏好性主要影響因素。

圖4 云南樟葉綠體基因組中性繪圖分析Fig.4 Neutrality plot analysis of C.glanduliferum chloroplast

2.3 ENC-plot 分析

ENC-plot 分析顯示結果（圖5），云南樟的部分基因在標準曲線周圍分布，而大部分基因落在標準曲線下方，離標準曲線較遠。對ENC 比值進行計算（表1）發(fā)現(xiàn)ENC 比值在-0.05～0.05 之間的有19 個，與預期ENC 值較為接近，而有33個基因則分布在這個區(qū)間以外，與預期ENC 值差距較大。因此，選擇是云南樟葉綠體基因組密碼子使用偏好性的主要影響因素，其他因素的影響較弱。

圖5 云南樟葉綠體基因組ENC-plot 繪圖分析Fig.5 ENC-plot analysis in the chloroplast of C.glanduliferum

表1 云南樟葉綠體基因組ENC 比值頻數(shù)分布表Table 1 Distribution table of ENC ratios in the chloroplast of C.glanduliferum

2.4 PR2-plot 分析

偏倚分析結果（圖6）顯示了云南樟葉綠體基因組密碼子第3 位堿基的使用情況。對云南樟編碼基因的堿基使用情況進行分析，發(fā)現(xiàn)各個區(qū)域中的基因位點未呈現(xiàn)均勻分布。多數(shù)基因位處在中心點稍右下的位置，在第3 位堿基的選擇上密碼子具有偏好性，且堿基T 的使用頻率高于A，堿基G 的使用頻率高于C，說明云南樟葉綠體基因組密碼子偏好性受到選擇的影響，也受其他因素的影響。

圖6 云南樟葉綠體基因組PR2-plot 繪圖分析Fig.6 Analysis of PR2 bias plot in the chloroplast of C.glanduliferum

2.5 最優(yōu)密碼子的確定

結合高頻（RSCU＞1）及高表達密碼子（ΔRSCU≥0.08）對云南樟葉綠體基因組最優(yōu)密碼子進行確定。結果（表2）表明，ΔRSCU≥0.08 的高表達密碼子有26 個，結合圖3挑選出的31 個高頻密碼子，最終確定云南樟葉綠體基因組最優(yōu)密碼子12 個，分別為UUA、UCU、ACA、UAU、GCU、UAG、CAA、AAA、GAU、GAA、CGA、AGA，其中有7 個以A 結尾，有4 個以U 結尾，僅1 個以G 結尾。

表2 云南樟葉綠體基因組最優(yōu)密碼子的確定?Table 2 Determination of optimal codons in the chloroplast genome of C.glanduliferum

3 討 論

植物葉綠體基因組結構高度保守，對于研究植物系統(tǒng)進化、物種鑒定等極其重要。對葉綠體基因組密碼子偏好性及其影響因素進行研究，有助于理解物種的起源與進化[24-25]。核苷酸組成是影響密碼子使用偏好性的重要因素之一，在基因組中，AT 及GC 含量與同義密碼子使用偏好性緊密相關[26-27]。本研究依托云南樟葉綠體基因組數(shù)據(jù)，篩選出52 條完整的CDS 序列，對密碼子的堿基構成及偏好性進行分析后發(fā)現(xiàn)云南樟葉綠體基因組的密碼子使用頻率表現(xiàn)為CG 結尾的密碼子低于AU 結尾的密碼子，總體上偏好使用堿基為A 或U的密碼子。在樟樹Cinnamomum camphora[28-29]和藿香Agastache rugosa[30]等物種的研究中也得出類似結論，這些研究均指出葉綠體基因組密碼子偏好使用A 堿基或U 堿基。

在蛋白質的轉錄翻譯過程中，突變和選擇會影響基因翻譯效率。密碼子偏好性的形成受到多種因素的共同影響[31]，研究表明自然選擇會促使密碼子使用偏好性形成[28]，并且與基因表達量密切相關[32]。本研究通過對云南樟葉綠體基因組密碼子相關參數(shù)及其影響因素進行分析，結果顯示云南樟葉綠體基因組中GC12和GC3的相關性不顯著，GC1、GC2、GC3 的堿基組成存在差異，說明選擇是影響云南樟樹葉綠體基密碼子使用偏好性的關鍵因素。有效密碼子數(shù)作為分析同義密碼子使用偏好性的關鍵參數(shù)，借助ENC 分析能夠判別密碼子使用偏好性的影響因素。本研究顯示有33 個基因與預期ENC 值差距較大，多數(shù)基因位處在中心點稍右下的位置，揭示了云南樟葉綠體基因組密碼子使用偏好性主要受選擇的影響，受其他因素的影響較弱。因此，自然選擇是影響云南樟葉綠體基因組密碼子偏好性的主要因素。在樟樹[28-29]、迎春櫻桃Cerasus discoidea[33]、云南藍果樹Nyssa yunnanensis[34]、馬尾松Pinus massoniana[35]等的研究中也得出類似結論，這些研究均指出選擇是影響密碼子偏好性的關鍵因素。但也有研究指出突變是密碼子偏好性的關鍵影響因素。朱沛煌等[27]的研究指出馬尾松密碼子使用偏好性形成主要受突變影響，其次受自然選擇等多重因素共同影響；原曉龍等[36]的研究表明受突是影響西南樺Betula alnoides葉綠體基因組密碼子偏好性的關鍵因素；趙森等[37]的研究也指出秋茄Kandelia candel葉綠體基因組密碼子使用偏好性主要受突變作用，同時自然選擇和堿基組成也有一定影響。由此可見，密碼子偏好性可能會受到多種因素的共同影響，且不同物種的影響因素可能不同。

結合高頻（RSCU＞1）及高表達密碼子（ΔRSCU≥0.08）對云南樟葉綠體基因組最優(yōu)密碼子進行篩選。最終確定云南樟葉綠體基因組最優(yōu)密碼子12 個，分別為UUA、UCU、ACA、UAU、GCU、UAG、CAA、AAA、GAU、GAA、CGA、AGA，其中有7 個以A 結尾，有4個以U 結尾，以G 結尾僅1 個。與羅茜等[38]和滕騰等[39]的研究結果類似，他們也發(fā)現(xiàn)最優(yōu)密碼子大多以A 或U 結尾。

本研究僅對云南樟葉綠體基因組密碼子使用偏好性進行了分析，未對樟屬其余物種進行分析，未能確定其是否與樟屬其他物種的偏好性一致。因此，下一步可對樟屬內(nèi)其他物種進行密碼子偏好性研究，探究其他樟屬物種是否也同時受到突變和選擇的影響，以此來確定造成同一屬間不同植物密碼子偏好性差異的因素是否相同。

4 結 論

對云南樟葉綠體基因組密碼子的偏好性及其影響因素進行研究，得出云南樟基因的密碼子偏好性比較弱，偏好以A 或U 結尾的密碼子。自然選擇是影響云南樟葉綠體基因組密碼子偏好性的關鍵因素。通過構建高低基因表達庫，結合高頻及高表達密碼子最終確定出云南樟葉綠體基因組的12 個最優(yōu)密碼子，且最優(yōu)密碼子大多以A 或U結尾。研究結果可為今后開展云南樟葉綠體基因工程、異源表達基因改造、種源鑒定等相關研究提供參考依據(jù)。