沈智峰，潘虹，胡鋼亮，姜荷，肖舒珺，袁海娜，肖功年*

(1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2.浙江省食品工業(yè)協(xié)會(huì)，浙江 杭州 310009；3.杭州千島湖康諾邦健康產(chǎn)品有限公司，浙江 杭州 311705；4.杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院 浙江省市場(chǎng)局乳及乳制品監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310052)

近年來(lái)，關(guān)于乳酸菌的研究主要集中在乳酸菌的篩選和功能探究方面，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是一類(lèi)典型的乳酸菌，屬于乳桿菌科乳桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性菌、兼性厭氧菌。環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，能在10 ℃環(huán)境下生長(zhǎng)，但溫度到達(dá)45 ℃不生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為30～35 ℃。耐酸堿性強(qiáng)，在pH 4.5～9.5環(huán)境下均能生長(zhǎng)，最適pH為6.5左右。植物乳桿菌呈短桿狀，少數(shù)呈鏈狀，不產(chǎn)生芽孢，在MRS瓊脂培養(yǎng)基中呈乳白色不透明、中間凸起、光滑、細(xì)小密集的菌落，屬于同型發(fā)酵菌，能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖等多種糖類(lèi)產(chǎn)酸。該類(lèi)菌的活菌數(shù)較其他乳酸菌高，在繁殖過(guò)程中能產(chǎn)生特有的乳酸桿菌素[1]。

目前關(guān)于功能性固體飲料開(kāi)發(fā)的企業(yè)越來(lái)越多，也有部分企業(yè)開(kāi)始關(guān)注乳酸菌與一些枇杷葉、抹茶粉、麥苗粉等新食品原料相結(jié)合，開(kāi)發(fā)具有地方特色的新產(chǎn)品。枇杷葉[2]為薔薇科植物枇杷(Eriobotryajaponica)的葉子，又名巴葉、蘆桔葉，含有三萜酸、黃酮、多酚、多糖等成分，具有清肺止咳、和胃利尿、止渴、降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎等功效，是衛(wèi)生部公告批準(zhǔn)的新資源食品[3]。枇杷葉粉為枇杷葉干燥研磨后的產(chǎn)物，呈棕黃色粉末狀，能溶于水[4-5]。本文以植物乳桿菌(LactobacillusplantarumKCTC3104)為研究對(duì)象，分析枇杷葉粉對(duì)其生長(zhǎng)特性的影響，探索碳源、氮源的生物轉(zhuǎn)化，以期為開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為植物乳桿菌(LactobacillusplantarumKCTC3104)，為本實(shí)驗(yàn)室自篩。

MRS肉湯、MRS瓊脂購(gòu)自杭州百思生物技術(shù)有限公司；瓊脂購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；枇杷葉粉購(gòu)自杭州千島湖康諾邦健康產(chǎn)品有限公司；蔗糖(分析純AR)購(gòu)自上海展云化工有限公司；脲(尿素)(分析純AR)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白和大豆蛋白購(gòu)自上海博微生物試劑有限公司；酵母浸膏購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司

1.2 主要儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；潔凈工作臺(tái)、HWS型恒溫恒濕器，寧波東南儀器有限公司；FA2004N電子天平，上海菁海儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；UV-5200PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；尼康YS100電子顯微鏡，上海澤仕光電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落特性觀(guān)察

將去離子水滴在干凈的載玻片中間，用灼燒后冷卻的接種環(huán)挑取菌落至載玻片上，在室溫下待水分自然蒸發(fā)后，用革蘭氏染色法對(duì)裝片進(jìn)行染色。

將染色完成后的裝片放置在電子顯微鏡下先用低倍鏡尋找菌落，后旋轉(zhuǎn)物鏡調(diào)至高倍鏡，調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋至圖像清晰，確保能看清相應(yīng)觀(guān)察目標(biāo)后對(duì)單個(gè)細(xì)菌進(jìn)行觀(guān)察。

1.3.2 單菌落分離試驗(yàn)

稱(chēng)取MRS肉湯5.2 g至錐形瓶中，加入0.1 L水，振蕩搖勻，使其完全溶解，分裝到若干試管中，塞上橡膠塞裹上牛皮紙滅菌，待滅菌完成后的培養(yǎng)基冷卻后，在超凈臺(tái)上用灼燒后冷卻的接種環(huán)蘸取菌液至試管中，將接種的試管放置在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h[6-7]。

稱(chēng)取MRS瓊脂6.4 g和相應(yīng)量的枇杷葉粉于裝有0.1 L水的錐形瓶中，塞上橡膠塞、振蕩搖勻后放入高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌15 min。滅菌完畢取出冷卻至45 ℃左右，在超凈工作臺(tái)倒平板，待培養(yǎng)基冷卻凝固后倒置。梯度濃度枇杷葉粉MRS瓊脂培養(yǎng)基配料見(jiàn)表1。

表1 梯度濃度枇杷葉粉MRS固體培養(yǎng)基配料

用移液槍移取1 mL菌液于9 mL無(wú)菌水中進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)蚕♂?0-1、10-2、10-3、10-44個(gè)梯度進(jìn)行涂布分離，稀釋后各取0.5 mL菌液至含有不同濃度枇杷葉粉的平板上，用滅菌過(guò)的涂布器將菌液均勻涂抹開(kāi)，倒置后放入35 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12 h后觀(guān)察單菌落形態(tài)并記錄。

1.3.3 生長(zhǎng)動(dòng)力試驗(yàn)

在超凈臺(tái)用灼燒后冷卻的穿刺針蘸取菌液后垂直穿入MRS半固體培養(yǎng)基進(jìn)行接種，并置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 h后觀(guān)察試管內(nèi)植入乳桿菌的生長(zhǎng)情況并記錄。培養(yǎng)基的配置如表2所示。

表2 梯度濃度枇杷葉粉MRS液體培養(yǎng)基配料

1.3.4 生長(zhǎng)曲線(xiàn)初步測(cè)定

用接種環(huán)蘸取菌液接種到各個(gè)試管中，并設(shè)置不接種菌液的培養(yǎng)基為對(duì)照組，接種完后用無(wú)枇杷葉粉的培養(yǎng)基作為對(duì)照組對(duì)分光光度計(jì)(D595)進(jìn)行調(diào)零，對(duì)各濃度試管進(jìn)行吸光值的測(cè)量，每隔2～4 h測(cè)量1次。

1.3.5 枇杷葉粉濃度對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響

重復(fù)1.3.4中步驟用接種環(huán)蘸取菌液接種到各個(gè)試管中，每個(gè)梯度濃度均設(shè)置一組對(duì)照組，每組測(cè)量均用對(duì)應(yīng)的對(duì)照組進(jìn)行調(diào)零后進(jìn)行吸光值測(cè)量，繪制菌種進(jìn)行0～12 h的生長(zhǎng)曲線(xiàn)(測(cè)量時(shí)間取接種后0、4、8、12 h)。

1.3.6 額外碳、氮源作用下枇杷葉粉對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響

配置MRS液體培養(yǎng)基于錐形瓶，待完全溶解后分裝到若干試管中，標(biāo)注A～F，加塞后放入高壓蒸汽滅菌鍋，121 ℃滅菌15 min[8]，滅菌完畢后置于試管架上冷卻后接種。添加枇杷葉粉和額外碳、氮源的MRS液體培養(yǎng)基配料見(jiàn)表3。試驗(yàn)步驟參考Fatmawati等[9-10]。

表3 梯度濃度枇杷葉粉MRS液體培養(yǎng)基

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特性

植物乳桿菌菌種為直或稍有彎曲的桿狀，單個(gè)、偶有成對(duì)或成鏈狀，無(wú)鞭毛，革蘭氏陽(yáng)性菌。對(duì)菌落進(jìn)行顯微觀(guān)察，目標(biāo)菌種以直桿狀為主，少數(shù)呈彎桿狀，偶有成對(duì)和成鏈狀菌，菌種四周光滑，無(wú)鞭毛等結(jié)構(gòu)；通過(guò)革蘭氏染色法染色后，菌種在顯微鏡(×100油鏡)下呈現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)紫色(圖1)，是明顯的革蘭氏陽(yáng)性性狀。

圖1 電子顯微鏡下的植物乳桿菌

對(duì)電子顯微鏡下菌種形態(tài)對(duì)比分析可見(jiàn)，圖1中A菌種呈紫色、桿狀，特性明顯，個(gè)體清晰，菌種邊緣光滑，無(wú)鞭毛等器官；圖1中B和C菌種呈紫色，少數(shù)呈藍(lán)紫色，桿狀，形態(tài)明顯，個(gè)體較為清晰，菌種邊緣光滑，無(wú)鞭毛，少數(shù)有桿狀連續(xù)個(gè)體。綜合圖1中A、B、C，此菌種性狀符合植物乳桿菌菌種形態(tài)特征，確定為本試驗(yàn)所需菌種。

2.2 植物乳桿菌的菌落形態(tài)

植物乳桿菌單菌落形態(tài)為凸起，呈圓形，表面光滑、細(xì)密、色白，偶有淺黃或深黃色。對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行單菌落分離試驗(yàn)，目標(biāo)菌單菌落呈現(xiàn)白色圓形凸起狀，偶有淡黃色，菌落表面光滑，周?chē)饣瑹o(wú)明顯鋸齒，細(xì)密。綜合所觀(guān)察到的單菌落特點(diǎn)，符合植物乳桿菌單菌落形態(tài)特征(圖2～4)。

圖2 植物乳桿菌單菌落形態(tài)

圖3 劃線(xiàn)分離

圖4 涂布分離

2.3 涂布分離單菌落

植物乳桿菌單菌落分離實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變培養(yǎng)基所含枇杷葉粉濃度，用控制變量法探究枇杷葉粉對(duì)植物乳桿菌菌落形成的影響。如圖5在0～20.0 g·L-1枇杷葉粉下，培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)出一定數(shù)量的單菌落，當(dāng)不添加枇杷葉粉時(shí)，植物乳桿菌單菌落分離狀況最佳，菌落分布均勻且菌落間區(qū)分明顯，計(jì)數(shù)清晰便捷。當(dāng)枇杷葉粉濃度提高，相同濃度的菌液所分離出的單菌落少于同等濃度下不加枇杷葉粉的組別。所以植物乳桿菌能在含有枇杷葉粉的環(huán)境下進(jìn)行正常的生長(zhǎng)繁殖，但是會(huì)受到枇杷葉粉的抑制作用，且枇杷葉粉濃度越高抑制作用越顯著。

圖5 枇杷葉粉濃度梯度涂布分離

2.4 生長(zhǎng)動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果

植物乳桿菌生長(zhǎng)動(dòng)力采用半固體培養(yǎng)基細(xì)菌穿刺試驗(yàn)開(kāi)展，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。試驗(yàn)兩組在不同濃度的枇杷葉粉環(huán)境下，半固體培養(yǎng)基內(nèi)接種的植物乳桿菌均呈現(xiàn)出沿穿刺路徑生長(zhǎng)，并未向四周生長(zhǎng)開(kāi)來(lái)的現(xiàn)象，生長(zhǎng)路徑整體呈現(xiàn)由粗至細(xì)的針狀，粗細(xì)變化較小。該現(xiàn)象說(shuō)明，植物乳桿菌在枇杷葉粉條件下細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性能較差[11-12]。

表4 枇杷葉粉濃度對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)動(dòng)力的影響

2.5 生長(zhǎng)曲線(xiàn)

以枇杷葉粉為培養(yǎng)基配料，探索不同濃度枇杷葉粉對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)特性的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖中可以看出，添加枇杷葉粉的植物乳桿菌與未添加枇杷葉粉的植物乳桿菌相比生長(zhǎng)情況較慢，說(shuō)明枇杷葉粉對(duì)植物乳桿菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，當(dāng)添加量為20.0 g·L-1時(shí)，植物乳桿菌基本上呈平緩曲線(xiàn)上升，而不添加枇杷葉粉時(shí)，植物乳桿菌基本呈陡直線(xiàn)上升，不添加枇杷葉粉在培養(yǎng)10 h后繁殖較快，快于5.0、10.0 g·L-1和20.0 g·L-1組，這可能是由于培養(yǎng)基中含有的枇杷葉粉對(duì)植物乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖或代謝活動(dòng)產(chǎn)生了抑制作用，并且隨著枇杷葉粉濃度的上升，抑制作用也更加顯著。

圖6 不同枇杷葉粉濃度對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

2.6 額外碳、氮源對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響

在添加了額外碳、氮源后植物乳桿菌的生長(zhǎng)特性曲線(xiàn)如圖7。從中可知，在10 h后不添加額外碳、氮源的實(shí)驗(yàn)組吸光值低于添加額外碳、氮源的組別，生長(zhǎng)速率也在10 h后低于其他組，說(shuō)明額外的碳、氮源能夠促進(jìn)植物乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖[13]。

圖7 額外碳源、氮源作用下0～12 h植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)

同時(shí)添加額外碳、氮源與枇杷葉粉，探究在添加枇杷葉粉后額外碳、氮源對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)特性的影響。如圖8，試驗(yàn)各組生長(zhǎng)速率差距較小，在10 h后，植物乳桿菌的生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)，并將逐漸到達(dá)穩(wěn)定，添加枇杷葉粉后植物乳桿菌更快進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖速率和衰亡速率趨于相等，說(shuō)明添加枇杷葉粉后的微生物環(huán)境容量降低，枇杷葉粉對(duì)于植物乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖起到了抑制作用。此外，添加枇杷葉粉后各組別吸光值差異較小，額外碳、氮源對(duì)于植物乳桿菌的促進(jìn)作用不顯著，說(shuō)明在添加枇杷葉粉后，植物乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖受到抑制。

圖8 梯度濃度枇杷葉粉環(huán)境中額外碳、氮源作用下0～12 h植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)

3 小結(jié)

本文以植物乳桿菌(LactobacillusplantarumKCTC3104)為研究對(duì)象，研究表明，植物乳桿菌能夠在有枇杷葉粉的環(huán)境下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，并且植物乳桿菌的分裂周期不受到影響，但枇杷葉粉的環(huán)境會(huì)抑制植物乳桿菌生長(zhǎng)活性，使菌種的生長(zhǎng)速率和最大環(huán)境容量降低，并且在試驗(yàn)所用濃度梯度下，枇杷葉粉濃度越高抑制作用越顯著，并在試驗(yàn)所設(shè)計(jì)濃度20.0 g·L-1時(shí)抑制作用最強(qiáng)，添加外源的蔗糖、脲、胰蛋白、大豆蛋白、酵母浸膏等碳、氮源物質(zhì)可促進(jìn)其生長(zhǎng)。