董佳妮 趙龍山 薄彧坤 楊丹 楊雪苗 譚誼萌 安明 鄔國棟

關(guān)鍵詞天然低共熔溶劑;肉蓯蓉;苯乙醇苷類成分;響應(yīng)曲面法;遺傳算法;抗氧化活性;提取效率

肉蓯蓉為列當(dāng)科植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 或管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、新疆、寧夏和甘肅等地區(qū)，素有“沙漠人參”之美譽(yù)[1]。研究表明，苯乙醇苷類成分是肉蓯蓉的主要功能性成分，且其含量最高，具有抗氧化、抗病毒、保護(hù)神經(jīng)和保肝等作用[2]。其中，松果菊苷是文獻(xiàn)記載的首個(gè)，也是植物界具有代表性的苯乙醇苷類成分，同時(shí)其也是肉蓯蓉中主要的指標(biāo)性成分[3]。支雅婧等[4]從化學(xué)成分特有性、可測性、傳統(tǒng)功效和藥性等方面進(jìn)行預(yù)測，指出毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷和松果菊苷可作為肉蓯蓉的質(zhì)量標(biāo)志物。

目前，針對肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分提取的研究大多采用50%甲醇為溶劑，具有毒性大、易揮發(fā)、易造成環(huán)境污染及提取效率低等缺點(diǎn)[5-6]。Abbott 等[7]于2003 年首次發(fā)現(xiàn)一種可替代傳統(tǒng)溶劑和離子液體的新型綠色低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs），其具有低蒸汽壓、低成本、良好的生物降解性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)。隨著研究的深入，Choi 等[8]又發(fā)現(xiàn)了DESs 的類似物——天然低共熔溶劑（natural deep eutectic solvents，NADESs）。與DESs 相比，NADESs 的組成成分均為天然化合物或生物體初級代謝產(chǎn)物，因此，其經(jīng)濟(jì)性和環(huán)境保護(hù)作用均優(yōu)于DESs，已作為一種綠色可調(diào)節(jié)的提取介質(zhì)應(yīng)用于藥物活性成分的提取中[9]。

響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，被廣泛用于多因素的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。箱式組合設(shè)計(jì)（Box-Behnken Design，BBD）是RSM中最常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、簡單和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)[10]。遺傳算法（genetic algorithm，GA）具有全局尋優(yōu)的特點(diǎn)，能取得較好的優(yōu)化和預(yù)測效果，在生物活性物質(zhì)提取方面具有很大潛力[11]。鑒于此，本研究擬采用RSM結(jié)合GA優(yōu)化NADESs 提取肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分（松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷）的工藝，以期為肉蓯蓉的綠色提取和高值化利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Thermo U3000 型高效液相色譜儀、Multiskan GO 型酶標(biāo)儀（美國Thermo FisherScientific 公司），BSA224S-CW型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），KQ-500E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

肉蓯蓉藥材（批號190802003）購自內(nèi)蒙古聚誠中藥飲片有限公司，由包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院安明教授鑒定為肉蓯蓉C. deserticola Y.C.Ma 的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)。將其干燥，粉碎（過四號篩），備用。

松果菊苷對照品（批號AF20051710，純度98%）、毛蕊花糖苷對照品（批號AF20110904，純度98%）、異毛蕊花糖苷對照品（批號AF20051701，純度98%）均購自成都埃法生物技術(shù)有限公司;1，3- 丁二醇（批號C11230698，純度99%）購自上海麥克林生化科技有限公司;氯化膽堿（批號RH221064，純度98%）、1，3-丙二醇（批號RH210167，純度98%）、1，4- 丁二醇（批號RH273071，純度99%）、丙二酸（批號RH246485，純度99.5%）、DL-蘋果酸（批號RH246485，純度99.5%）、硫酸亞鐵（批號RH246512，純度98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）（ 批號RH207202，純度≥98.5%）均購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;維生素C（vitamin C，VC）（批號20210525，純度≥99.7%）購自天津市鼎盛鑫化工有限公司;尿素（批號20190410，純度≥99%）、葡萄糖（批號20190529，純度≥99%）均購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;乳酸（批號980826，純度90%）購自天津市化學(xué)試劑一廠;乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷含量測定

采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。色譜條件：采用Supersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～9min，90%B→83%B;9～18 min，83%B→80%B;18～30min，80%B）;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測器為紫外檢測器;檢測波長為330 nm;進(jìn)樣量為10 μL。按照2020 年版《中國藥典》（四部）“9101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”進(jìn)行方法學(xué)考察[12]，結(jié)果均滿足要求。

2.2 NADESs的篩選

2.2.1 不同組成NADESs 的制備根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法，分別以氯化膽堿、多元醇和有機(jī)酸等為原料，以水為溶劑，制備11 種NAEDSs（表1），具體方法為：按照組成成分摩爾比將原料置于各自錐形瓶中，在80 ℃下加熱攪拌，直至形成均勻透明的液體，冷卻至室溫后備用。

2.2.2 樣品溶液的制備及提取效率的計(jì)算取肉蓯蓉粉末0.3 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，分別加入不同組成的NADESs 及傳統(tǒng)溶劑（50%甲醇，對照）適量，混勻后在一定溫度下超聲（功率為500 W，頻率為40kHz）提取一定時(shí)間，冷卻至室溫后，以5 000 r/min 離心10 min，取上清液，用水稀釋4 倍，然后過0.45 μm濾膜，收集濾液，即得樣品溶液。按“2.1”項(xiàng)下方法測定各樣品溶液中松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的含量，并計(jì)算各成分的提取效率：提取效率（%）=（C×V×N/M×1 000）×100%。式中，C為樣品中被測物質(zhì)的質(zhì)量濃度（mg/mL），V 為樣品溶液的體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，M為肉蓯蓉粉末的質(zhì)量（g）。

2.2.3 最佳NADESs 的篩選NADESs 的組成成分會(huì)影響其理化性質(zhì)，如極性、黏度、溶解度及表面張力等，從而決定其對目標(biāo)成分的提取效率[14]。因此，本研究以松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率為考察指標(biāo)篩選NADESs。結(jié)果顯示，除NADES-7 和NADES-8 外，其余NADESs對目標(biāo)成分的提取效率均優(yōu)于50%甲醇。其中，以1，4-丁二醇和丙二酸為原料合成的NADES-11 對松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率達(dá)到最大值。因此，本研究選擇NADES-11 作為最佳提取溶劑。結(jié)果見圖1。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

在肉蓯蓉提取的過程中，NADESs 組成成分的摩爾比、NADESs 含水量和液料比等因素對提取效率有著重要影響[15-16]。因此，本工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，筆者選擇NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比、NADES-11含水量、液料比、提取時(shí)間和提取溫度為因素進(jìn)行考察。

2.3.1 NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比固定NADES-11 含水量為30%、液料比為15 mL/g、提取溫度為30 ℃、提取時(shí)間為40 min，考察不同比例1，4-丁二醇和丙二酸（摩爾比1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5）組成的NADES-11 對提取效率的影響，結(jié)果見圖2A。如圖2A所示，當(dāng)NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2 時(shí)，松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率達(dá)到最大值。因此，本實(shí)驗(yàn)確定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2。

2.3.2 NADES-11 含水量固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2、液料比為15 mL/g、提取溫度為30 ℃、提取時(shí)間為40 min，考察不同含水量（10%、20%、30%、40%、50%）的NADES-11 對提取效率的影響，結(jié)果見圖2B。如圖2B所示，當(dāng)NADES-11 含水量為20%時(shí)，松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率達(dá)到最大值。因此，本實(shí)驗(yàn)確定NADES-11 的含水量為20%。

2.3.3 液料比固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2、提取溫度為30 ℃、NADES-11 含水量為20%、提取時(shí)間為40 min，考察不同液料比（10、20、30、40、50 mL/g）對提取效率的影響，結(jié)果見圖2C。如圖2C所示，當(dāng)液料比為30 mL/g 時(shí)，松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率達(dá)到最大值。因此，本實(shí)驗(yàn)確定液料比為30 mL/g。

2.3.4 提取時(shí)間固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2、提取溫度為30 ℃、NADES-11 含水量為20%、液料比為30 mL/g，考察不同提取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）對提取效率的影響，結(jié)果見圖2D。如圖2D所示，當(dāng)提取時(shí)間為30 min 時(shí)，松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率達(dá)到最大值。因此，本實(shí)驗(yàn)確定提取時(shí)間為30 min。

2.3.5 提取溫度固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2、提取時(shí)間為30 min、NADES-11 含水量為20%、液料比為30 mL/g，考察不同提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）對提取效率的影響，結(jié)果見圖2E。如圖2E所示，不同提取溫度對松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取效率影響差別不大。因此，本研究從降低能耗的角度考慮，選擇在30 ℃下進(jìn)行樣品提取。

2.4 BBD實(shí)驗(yàn)聯(lián)合GA優(yōu)化提取工藝

2.4.1 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果本研究在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷提取效率影響顯著的3 個(gè)因素——NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比（X1）、NADES-11 含水量（X2）和液料比（X3）為自變量，以肉蓯蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷總提取效率（Y）為響應(yīng)值，使用DesignExpert 12.0 軟件設(shè)計(jì)3 因素3 水平的BBD實(shí)驗(yàn)。BBD實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表2，實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表3。

2.4.2 統(tǒng)計(jì)分析及模型擬合采用Design Expert 12.0軟件對表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到3種目標(biāo)成分的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=1.221 54+0.003 64X1+0.018 18X2 + 0.029 30X3 - 0.001 71X1X2 + 0.003 17X1X3 +0.000 06X2X3 - 0.013 38X12 - 0.000 43X22 - 0.000 64X32。同時(shí)，采用Design Expert 12.0軟件對表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。由表4 可知，模型回歸系數(shù)R2為0.993 1、Radj2為0.984 2，表明該模型相關(guān)度良好，且與實(shí)測值能較好地?cái)M合;總模型P<0.000 1，表明此模型的建立顯著;此外，模型失擬項(xiàng)P>0.05，表明模型擬合良好。

2.4.3 響應(yīng)面分析在響應(yīng)曲面圖中，曲面坡度越陡，表明該因素影響越顯著;等高線圖的形狀反映了兩兩因素交互影響的強(qiáng)弱，橢圓形表示顯著，圓形表示不顯著[17]。運(yùn)用Design Expert 12.0 軟件繪制各因素對目標(biāo)成分總提取效率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖（圖3）。通過響應(yīng)曲面圖可知，3 個(gè)響應(yīng)曲面均為開口向下的凸性曲面，表明最佳提取條件均在設(shè)定的條件范圍內(nèi)，且各因素對目標(biāo)成分影響的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篨3>X1>X2。通過等高線圖可知，X1與X2、X1與X3的交互影響較為顯著。

2.4.4 GA優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)利用BBD 實(shí)驗(yàn)所建立的模型作為GA的適應(yīng)度函數(shù)，使用Matlab R2020b 軟件中的GA優(yōu)化工具箱進(jìn)一步對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化。在迭代57 次后，最佳適應(yīng)度與平均適應(yīng)度均基本保持穩(wěn)定，表明總提取效率已達(dá)到最大值（圖4）。GA優(yōu)化求解的結(jié)果為：NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比1 ∶2.49、NADES-11 含水量18.11%、液料比29.74 mL/g，最佳適應(yīng)度（目標(biāo)成分的總提取效率）為1.83%。為便于操作，本研究將實(shí)驗(yàn)條件修正為：NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比1 ∶2.5、NADES-11 含水量18%、液料比30 mL/g。按修正后的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到3 種目標(biāo)成分的總提取效率為（1.82 ±0.01）%，與預(yù)測值1.83%接近，表明優(yōu)化的工藝條件準(zhǔn)確、可行。

2.5 NADES-11 與傳統(tǒng)溶劑的提取效果比較

2.5.1 提取效率的比較分別以NADES-11 為溶劑按“2.4.4”項(xiàng)下最優(yōu)條件和以2020 年版《中國藥典》（一部）肉蓯蓉項(xiàng)下傳統(tǒng)溶劑（50%甲醇）進(jìn)行樣品提取[18]，比較兩者的提取效率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用SPSS 18.0 軟件中t 檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x±s 表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果顯示，NADES-11 對松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取效率均顯著高于50%甲醇（P<0.05）。結(jié)果見圖5。

2.5.2 抗氧化活性的比較按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備2 種樣品提取液，精密量取2 種樣品提取液0、25、50、100、150、200、500、1 000 μL，分別置于10 mL量瓶中，用水稀釋得質(zhì)量濃度為0、0.08、0.17、0.33、0.50、0.67、1.67、3.34mg/mL 的供試品溶液。并制備相同質(zhì)量濃度的VC 溶液，作為陽性對照檢測液。

（1）DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[19]，吸取100 μL NADES-11 提取物、50%甲醇提取物、VC溶液于96 孔板中，加入0.38 mmol/L DPPH 溶液100μL，混勻，室溫避光孵育30 min，然后采用酶標(biāo)儀在517nm波長處檢測各溶液的吸光度（A）。同時(shí)，將供試品溶液+DPPH溶劑（無水乙醇）的檢測結(jié)果記為A0，樣品溶劑（水）+DPPH 溶液的檢測結(jié)果記為A1。計(jì)算各樣品對DPPH自由基的清除率：DPPH自由基清除率（%）=[1-（A-A0）/A1]×100%。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。采用SPSS 18.0 軟件計(jì)算各樣品對DPPH 自由基的半數(shù)清除濃度（IC50）及抗壞血酸當(dāng)量（ascorbic acid equivalent antioxidantcapacity，AEAC）。結(jié)果顯示，在研究質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各樣品對DPPH自由基均有一定的清除活性，其強(qiáng)弱順序依次為VC>NADES-11 提取物>50%甲醇提取物。結(jié)果見表5。

（2）羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[20]，取7.5 mmol/L的鄰二氮菲20 μL、0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液40 μL和樣品溶液30 μL于96 孔板中，混勻，再加入7.5 mmol/L 的FeSO4 溶液20 μL 和0.1%H2O2 溶液20 μL，在37 ℃下恒溫反應(yīng)60 min，采用酶標(biāo)儀在536nm波長處檢測A。同時(shí)，將樣品溶劑（水）代替樣品同法操作后所得結(jié)果記為A0;將樣品溶劑（水）代替樣品，同時(shí)以水代替0.1%H2O2同法操作后所得結(jié)果記為A1。計(jì)算各樣品對羥基自由基的清除率：羥基自由基清除率（%）=（A-A0）/（A1-A0）×100%。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。按照“2.5.2（1）”項(xiàng)下方法計(jì)算各樣品對羥基自由基的IC50和AEAC。結(jié)果顯示，在研究質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各樣品對羥基自由基均有一定的清除活性，其強(qiáng)弱順序依次為VC>NADES-11 提取物>50%甲醇提取物。結(jié)果見表5。

3 討論

NADESs作為一種新型的綠色可調(diào)節(jié)溶劑，與傳統(tǒng)溶劑相比，具有較高的提取效率及良好的生物降解性、生物相容性、穩(wěn)定性和可回收性等優(yōu)點(diǎn)[21]。Dai 等[22]研究表明，與水和40%乙醇相比，NADESs 提高了紅花中酚類物質(zhì)在高溫、光照和長期放置等條件下的穩(wěn)定性。熊蘇慧等[23]對以NADESs為溶劑得到的玉竹總黃酮提取液進(jìn)行純化回收，發(fā)現(xiàn)NADESs 可被回收再次利用，且回收后的NADESs 再次用于提取時(shí)也取得了較好的提取效率（回收利用率為94.56%）。并且，NADESs的組成成分在自然界中大量存在，具有成本低和生物可再生的特性。此外，NADESs 由天然的初級代謝物組成，被認(rèn)為是低毒或無毒的環(huán)境友好型提取溶劑，可以直接納入藥物、食品等配方中，不需額外進(jìn)行純化[24-25]。故本研究使用NADESs 代替有機(jī)溶劑用于肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分的提取，具有科學(xué)性和可行性。

本研究結(jié)果顯示，不同組成的NADESs 對松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取效率不同，筆者認(rèn)為主要是黏度不同導(dǎo)致的——黏度較低的NADESs有利于目標(biāo)成分的擴(kuò)散。因此，在NADES-11 含水量的考察中，隨著其含水量的增加，黏度降低，目標(biāo)成分提取效率也隨之升高;然而當(dāng)含水量大于20%時(shí)，目標(biāo)成分提取效率呈降低趨勢，這可能是由于過多的水會(huì)破壞NADES-11 的氫鍵網(wǎng)絡(luò)并改變其極性。隨著液料比的增加及提取時(shí)間的延長，目標(biāo)成分的總提取效率均呈先升高后降低的趨勢。合適的液料比有助于溶質(zhì)中目標(biāo)成分向溶劑擴(kuò)散。過短的提取時(shí)間不足以破碎藥物細(xì)胞壁，過長的提取時(shí)間則會(huì)使目標(biāo)化合物發(fā)生降解。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，經(jīng)BBD實(shí)驗(yàn)聯(lián)合GA優(yōu)化并進(jìn)行修正后得NADES-11 的最佳工藝條件為：NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比1 ∶ 2.5、NADES-11 含水量18% 、液料比30 mL/g、提取時(shí)間30 min、提取溫度30 ℃。經(jīng)驗(yàn)證，目標(biāo)成分總提取效率的實(shí)測值（1.82%）與預(yù)測值（1.83%）接近，表明模型優(yōu)化工藝條件準(zhǔn)確、可行。

綜上所述，本研究以優(yōu)化的NADESs 為提取溶劑，提取肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分的工藝穩(wěn)定、可行，符合天然產(chǎn)物綠色提取的理念。但是，由于藥物處理量的大小懸殊，實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)之間的差別較大，而本實(shí)驗(yàn)樣品量較小，很難對NADESs工業(yè)提取中的許多因素進(jìn)行充分考察。因此，本提取工藝若要應(yīng)用于工業(yè)大生產(chǎn)，還應(yīng)該經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室放大、中試和工業(yè)放大的數(shù)據(jù)驗(yàn)證。