黃豆·紅豆不同配比發(fā)酵對大豆異黃酮成分的影響

曹 陽，任 蓉，武天元，郭雪瑩，張樹明* (.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院,黑龍江哈爾濱 5006；.青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院,山東青島 66000；.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江哈爾濱 50040)

納豆(Natto)，起源于古代的豆豉，主要由黃豆經(jīng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)發(fā)酵而成。由于含有黃酮類等多種生物活性成分，同時(shí)具備降血脂、溶栓、調(diào)整胃腸、預(yù)防骨質(zhì)疏松等功效，現(xiàn)已被廣泛食用。近年來，利用不同豆類作為底物對納豆進(jìn)行改良的研究報(bào)道較多，其中紅豆是一種具有健脾益腎、養(yǎng)心補(bǔ)血、清熱解毒、利尿消腫等功效的藥食同源豆類食物，含有多酚、皂苷等活性成分。國內(nèi)有學(xué)者以單純紅豆為底物對納豆發(fā)酵工藝、性狀、品質(zhì)及總黃酮、總游離氨基酸含量進(jìn)行了研究，但尚缺乏以黃豆、紅豆按照不同配比進(jìn)行發(fā)酵制作納豆的研究。筆者采用高效液相色譜法測定樣品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素4種大豆異黃酮含量，考察紅豆、黃豆不同配比發(fā)酵后異黃酮含量差異。

1 材料與方法

原材料。中龍2號小粒黃豆：黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；紅豆：市售。

菌種?？莶菅挎邨U菌(CICC 20640)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

試劑。染料木苷(R-002-150802，HPLC>98%)、染料木素(R-001-150421，HPLC>98%)、大豆苷(D-013-150928，HPLC>98%)、大豆苷元(D-016-150423，HPLC>98%)：成都瑞芬思生物科技有限公司；甲醇、乙腈(色譜純)：美國Chroma Dex公司。

儀器。Waters 2695型高效液相色譜儀，立式壓力蒸汽滅菌器，BSC-1360型生物安全柜，DHP 9272 型恒溫培養(yǎng)箱。

菌株擴(kuò)繁。吸取菌液至培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，180 r/min下37 ℃搖瓶培養(yǎng)72 h，用菌落計(jì)數(shù)儀測定菌液濃度后用培養(yǎng)液調(diào)配成含菌量為1×10個(gè)，4 ℃冷藏，備用。

樣品制備。參考文獻(xiàn)[2]，分別稱取適量的中龍2號小粒黃豆、紅豆，加適量水浸泡過夜，按紅豆∶黃豆比例為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3混合100 g分別裝入三角瓶中，121 ℃滅菌30 min。冷卻后，按0.33 mL/瓶接種菌液，搖勻，37 ℃發(fā)酵24 h,取出置于4 ℃冰箱中后熟24 h，取出后置于-80 ℃冰箱備用。

樣品中大豆異黃酮含量測定。

色譜條件。色譜柱Symmetry?-C18 (4.6 mm×150 mm,5 μm )；流動(dòng)相：A相(甲醇)-B相(0.5%乙酸水)，梯度洗脫：0～2 min 5%A相，2～13 min 5%～30%A相，13～40 min 30%～60%A相；檢測波長254 nm；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備。精密稱取4種對照品配成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中大豆苷濃度為0.206 mg/mL，大豆苷元濃度為0.195 mg/mL，染料木苷濃度為0.208 mg/mL，染料木素濃度為0.199 mg/mL。

樣品前處理。分別精密稱取樣品各2 g，研磨后加入適量70%乙醇，超聲提取60 min后，用70%乙醇定容至25 mL，8 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2 結(jié)果與分析

從圖1可見，4個(gè)峰完全分離(分離度>1.5)，基線平穩(wěn)，分析時(shí)間為45 min。

注：1.大豆苷；2.染料木苷；3.大豆苷元；4.染料木素Note: 1.Daidzein;2.Genistein;3.Daidzein;4.Genistein圖1 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(a)和樣品(b)色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of soy isoflavones standard (a) and sample (b)

將紅豆、黃豆按照不同配比混合發(fā)酵后，測定4種異黃酮的含量， 結(jié)果見表1。由表1可知，與單純用紅豆發(fā)酵相比，單純用黃豆發(fā)酵樣品中大豆苷元和染料木素含量較高；紅豆與黃豆按照不同配比發(fā)酵樣品中，以配比為1∶1的樣品中大豆苷元和染料木素的含量最高，隨著黃豆配比量的增加，大豆苷元和染料木素的含量反而降低，且均高于紅豆單純發(fā)酵，低于黃豆單純發(fā)酵。

表1 混合后發(fā)酵樣品中大豆異黃酮4種成分的含量Table 1 The contents of 4 kinds of soy isoflavones in mixed fermentation sample mg/g

將單純用黃豆、紅豆發(fā)酵的樣品按照不同配比混合后，置于4 ℃冰箱中后熟，測定4種大豆異黃酮的含量變化，結(jié)果見表2。由表2可知，將單純發(fā)酵樣品按不同配比混合后后熟的樣品中，以配比為1∶3的樣品中大豆苷元和染料木素的含量最高，均高于單純的紅豆發(fā)酵，但低于單純黃豆發(fā)酵樣品。綜合表1、2可知，發(fā)酵對大豆異黃酮含量影響較大，例如將紅豆與黃豆混合發(fā)酵，并非黃豆的含量越多越好，而是按照1∶1配比時(shí)大豆苷元+染料木素含量最高，比1∶2配比提高了15.35%，比1∶3時(shí)提高了26.40%；與發(fā)酵混合樣品相比較，比相同配比1∶1時(shí)提高了17.88%。

表2 發(fā)酵后混合樣品中大豆異黃酮4種成分的含量Table 2 The contents of 4 kinds of soy isoflavones in mixed samples after fermentation mg/g

3 討論

紅豆為豆科植物紅小豆或紅豆的種子，李時(shí)珍《本草綱目》中記載，紅豆性平，味甘、酸，歸心、小腸經(jīng)，除可食用外還具有利水消腫、補(bǔ)脾養(yǎng)胃、補(bǔ)益氣血、清熱解毒等藥用價(jià)值和保健作用，應(yīng)用歷史較為悠久。尤其是對于女性來說，紅豆含有極其豐富的膳食纖維，可以促進(jìn)人體胃腸蠕動(dòng)，加快腸道垃圾的排出，具有潤腸通便的作用；含有礦物質(zhì)鉀具有利水消腫瘦身的功效，有利于水腫型肥胖和體內(nèi)濕氣過重的人群。同時(shí)，紅豆不僅富含鐵質(zhì)，還含豐富的VB、VB、VB、葉酸、煙酸等B族維生素，具有美容養(yǎng)顏、補(bǔ)益氣血、養(yǎng)心安神的功效，經(jīng)常食用紅豆制品，可以調(diào)理氣血，使面部紅潤。納豆由于制備工藝簡單，是保健功能較多的大豆發(fā)酵食品，逐漸被國內(nèi)人群所食用。大豆異黃酮是一種主要存在于豆類中的植物性雌激素，具有延緩女性細(xì)胞衰老，預(yù)防骨質(zhì)疏松，與骨細(xì)胞上的雌激素受體結(jié)合，可減少骨質(zhì)流失，促進(jìn)機(jī)體對鈣的吸收。因此，進(jìn)入更年期的女性更應(yīng)該食用發(fā)酵豆類產(chǎn)品。宋軍霞通過對比研究不同豆類發(fā)酵樣品，發(fā)現(xiàn)紅豆發(fā)酵后的納豆具有粗壯黏絲，整體顏色為暗紅色，其中黏多糖、氨基酸含量較其他豆類發(fā)酵品高，且稍有氨味，發(fā)酵效果較好。王琳等考察了單純采用紅豆發(fā)酵納豆的工藝，以納豆激酶的酶活力對接種量、種齡、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，得到具有納豆香味，色澤誘人的紅豆納豆，但是并未對納豆中的異黃酮類成分進(jìn)行考察。該試驗(yàn)單純采用紅豆進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮含量偏低。因此，以大豆異黃酮作為指標(biāo)，將紅豆和黃豆進(jìn)行配比，期望得到一種既含有較高異黃酮含量，又具有紅豆特性的新型納豆產(chǎn)品。

該試驗(yàn)通過黃豆與紅豆的不同配比，經(jīng)發(fā)酵后測定大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量。結(jié)果表明，混合后發(fā)酵對大豆異黃酮含量影響較大，按照1∶1配比時(shí)大豆苷元+染料木素含量最高，且隨著黃豆含量增加而降低，大豆苷元+染料木素含量比1∶2時(shí)提高了15.35%，比1∶3時(shí)提高了26.40%；與發(fā)酵后混合樣品相比較，大豆苷元染料木素含量比相同配比1∶1時(shí)提高了17.88%。該試驗(yàn)可初步確定紅豆與黃豆混合發(fā)酵的配比為1∶1，為進(jìn)一步考察添加紅豆的新型納豆產(chǎn)品奠定了理論基礎(chǔ)，但混合發(fā)酵后大豆異黃酮的含量并不隨黃豆的量增加而增加，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。