郭明珠 梁珍珍 韓晶晶 龐 晶

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要病理類型，其占肺癌患者的80 %以上[1]。近年來(lái)，由于醫(yī)學(xué)水平的進(jìn)步，NSCLC的治療取得了一定進(jìn)展，但患者5年生存率依然較低[2]。目前，NSCLC的發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此探究NSCLC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制并尋找治療分子靶點(diǎn)尤為重要。人蛋白酶體α亞基3型(PSMA3)的反義RNA1(PSMA3-AS1)是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)，有報(bào)道稱，其在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)組織中表達(dá)明顯上調(diào)，上調(diào)PSMA3-AS1可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-101進(jìn)而上調(diào)EZH2表達(dá)增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，PSMA3-AS1有可能成為ESCC治療的分子靶標(biāo)[3]。然而，PSMA3-AS1對(duì)NSCLC發(fā)生發(fā)展的影響和分子機(jī)制還未知。LncBase Predicted v.2靶基因在線軟件預(yù)測(cè)顯示，PSMA3-AS1可能與miR-379-3p靶向結(jié)合。目前，miR-379-3p對(duì)NSCLC發(fā)生發(fā)展的影響也還未知。本研究主要觀察了PSMA3-AS1和miR-379-3p對(duì)NSCLC細(xì)胞系NCI-H1299增殖、遷移和侵襲的影響及PSMA3-AS1能否靶向miR-379-3p發(fā)揮作用，以期為NSCLC的靶向治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑

正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B及NSCLC細(xì)胞系NCI-H1299，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和MTT，北京索萊寶；miRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物；Trizol試劑和LipofectamineTM 2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PCR引物、si-PSMA3-AS1及對(duì)照序列si-NC、miR-379-3p mimcs及對(duì)照序列miR-NC、miR-379-3p抑制劑(anti-miR-379-3p)及陰性對(duì)照序列anti-miR-NC，上海吉瑪；兔抗人CyclinD1、MMP2、MMP9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體，北京中杉金橋生物試劑公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，上海碧云天。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B及NSCLC細(xì)胞系NCI-H1299均用含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)期NCI-H1299細(xì)胞接種于6孔板中(1×105個(gè)/孔)，參照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別轉(zhuǎn)染si-PSMA3-AS1(si-PSMA3-AS1組)、miR-379-3p mimcs(miR-379-3p組)、si-NC(si-NC組)、miR-NC(miR-NC組)、si-PSMA3-AS1與anti-miR-379-3p(si-PSMA3-AS1+anti-miR-379-3p組)、si-PSMA3-AS1與anti-miR-NC(si-PSMA3-AS1與anti-miR-NC組)。轉(zhuǎn)染6 h后，更換為新鮮培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)實(shí)驗(yàn) 用Trizol試劑、miRNA提取試劑盒分別提取細(xì)胞中總RNA和miRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，行PCR擴(kuò)增。引物序列：PSMA3-AS1上游5'-CGTGAACGTGCACCTGCATC-3'，下游5'-CGTGGAAGGACGTCGTG-3'；GAPDH上游5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA T-3'，下游5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA T-3'；miR-379-3p上游5'-GTCGAAAGTCGT CCCGGTAC-3'，下游5'-CGGTGAACACTTGTGCAC-3'；U6上游5'-CTTCGGCAGCACATA TACTAAAAT-3'，下游5'-AATATGGAACGCTTCACGA-3'。2-△△Ct法計(jì)算PSMA3-AS1和miR-379-3p的相對(duì)表達(dá)水平，其中PSMA3-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-379-3p以U6為內(nèi)參。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板中(1.0×104個(gè)/孔)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。加20 μl MTT(5 g/L)，孵育4 h。加150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻，酶標(biāo)儀(λ=490 nm)測(cè)光密度(OD)值。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 將各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞調(diào)整密度為5×104個(gè)/ml。遷移實(shí)驗(yàn)：取100 μl各組細(xì)胞懸液加至Transwell上室，500 μl含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基加至下室。培養(yǎng)24 h后，用多聚甲醛固定進(jìn)行，然后用結(jié)晶紫染色。置于倒置顯微鏡觀察、拍照，并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干后，再加100 μl細(xì)胞懸液，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Western Blot實(shí)驗(yàn) RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，經(jīng)BCA法定量、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別用CyclinD1(1∶1000)、MMP2(1∶800)、MMP9(1∶800)一抗4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后，再用山羊抗兔二抗(1∶2000)37 ℃孵育1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后曝光拍照。

由上海生工根據(jù)LncBase Predicted v.2靶基因在線軟件預(yù)測(cè)顯示的PSMA3-AS1與miR-379-3p的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成PSMA3-AS1野生型熒光素酶載體(WT-PSMA3-AS1)及突變型熒光素酶載體(MUT-PSMA3-AS1)。將NCI-H1299細(xì)胞接種于24孔板中(2.5×104個(gè)/孔)，分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PSMA3-AS1與miR-379-3p mimics或miR-NC、MUT-PSMA3-AS1與miR-379-3p mimics或miR-NC。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并裂解。3500 r/min離心5 min后，取上清，利用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NSCLC細(xì)胞系中PSMA3-AS1和miR-379-3p的表達(dá)

與BEAS-2B細(xì)胞比較，NSCLC細(xì)胞系NCI-H1299中PSMA3-AS1的表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-379-3p的表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NSCLC細(xì)胞系中miR-379-3p和PSMA3-AS1表達(dá)量

2.2 下調(diào)PSMA3-AS1對(duì)NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-NC組、si-PSMA3-AS1組NCI-H1299細(xì)胞中PSMA3-AS1表達(dá)水平分別為(1.00±0.11)、(0.42±0.040，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.866，P<0.05)，說(shuō)明下調(diào)PSMA3-AS1的NCI-H1299細(xì)胞構(gòu)建成功。與si-NC組比較，si-PSMA3-AS1組NCI-H1299細(xì)胞OD值、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均降低(P<0.05)，與增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白CyclinD1、MMP2和MMP9的表達(dá)水平均下降(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表2。

注：A為Transwell檢測(cè)下調(diào)PSMA3-AS1后NCI-H1299細(xì)胞遷移和侵襲，放大倍數(shù)×200；B為Western Blot檢測(cè)Transwell檢測(cè)下調(diào)PSMA3-AS1后NCI-H1299細(xì)胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)。

表2 下調(diào)PSMA3-AS1對(duì)NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 上調(diào)miR-379-3p對(duì)NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

miR-NC組、miR-379-3p組NCI-H1299細(xì)胞中miR-379-3p表達(dá)水平分別為(1.00±0.11)和(2.76±0.22)，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.466，P<0.05)，說(shuō)明上調(diào)miR-379-3p的NCI-H1299細(xì)胞構(gòu)建成功。與miR-NC組比較，miR-379-3p組NCI-H1299細(xì)胞OD值、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均降低(P<0.05)，與增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白CyclinD1、MMP2和MMP9的表達(dá)水平均下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表3。

表3 上調(diào)miR-379-3p對(duì)NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 Western Blot檢測(cè)結(jié)果

2.4 PSMA3-AS1靶向調(diào)控miR-379-3p

LncBase Predicted v.2靶基因在線軟件預(yù)測(cè)顯示的PSMA3-AS1與miR-379-3p的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖3。miR-379-3p mimics與WT-PSMA3-AS1共轉(zhuǎn)染NCI-H2170細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性降低[(0.42±0.04)比(1.00±0.10)，t=16.155，P<0.05)]，而miR-379-3p mimics與MUT-PSMA3-AS1共轉(zhuǎn)染NCI-H1299細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化[(0.99±0.09)比(1.01±0.12)，t=0.400，P=0.694)]。下調(diào)PSMA3-AS1表達(dá)后，NCI-H2170細(xì)胞中miR-379-3p的表達(dá)升高[(1.66±0.12)比(1.01±0.10)，t=12.484，P<0.05)]。這表明PSMA3-AS1在NCI-H2170細(xì)胞中與miR-379-3p靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控其表達(dá)。

圖3 PSMA3-AS1與miR-379-3p核苷酸序列的結(jié)合位點(diǎn)

2.5 下調(diào)miR-379-3p逆轉(zhuǎn)下調(diào)PSMA3-AS1對(duì)NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-PSMA3-AS1+anti-miR-NC組、si-PSMA3-AS1+anti-miR-379-3p組NCI-H1299細(xì)胞中miR-379-3p表達(dá)水平分別為(1.00±0.11)和(0.38±0.03)，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.313，P<0.05)，說(shuō)明NCI-H1299細(xì)胞中miR-379-3p下調(diào)。與si-PSMA3-AS1+anti-miR-NC組比較，si-PSMA3-AS1+anti-miR-379-3p組NCI-H1299細(xì)胞OD值、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均升高(P<0.05)，細(xì)胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平均增高(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表4。

圖4 同時(shí)下調(diào)PSMA3-AS1和miR-379-3p后細(xì)胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)

3 討論

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)生發(fā)展與原癌基因的激活及抑癌基因的失活有關(guān)，探究NSCLC中異常表達(dá)的基因分子及對(duì)NSCLC發(fā)生發(fā)展的影響，可為NSCLC的治療提供分子靶點(diǎn)。lncRNA是真核生物中廣泛存在的超度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，研究已表明，多種lncRNA在NSCLC中異常表達(dá)，參與調(diào)控NSCLC細(xì)胞的惡性表型。Zha等[4]研究顯示，lncRNA NCK1-AS1高表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后較差，lncRNA NCK1-AS1可通過(guò)激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展。Qiu等[5]研究顯示，肺癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1表達(dá)上調(diào)，下調(diào)lncRNA PVT1可通過(guò)靶向miRNA-526b進(jìn)而抑制組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(EZH2)表達(dá)減弱肺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞活力。這些lncRNA作為促癌基因參與肺癌的發(fā)展進(jìn)程。而lncRNA ZNF674-AS1[6]、LncRNA MIR503HG等[7]lncRNA在NSCLC組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可阻礙NSCLC細(xì)胞增殖，抑制肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，并加劇肺癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制肺癌發(fā)展進(jìn)程。

表4 下調(diào)miR-379-3p逆轉(zhuǎn)下調(diào)PSMA3-AS1對(duì)NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

PSMA3-AS1是今年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，目前其影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)報(bào)道還很少見(jiàn)。本研究首先以正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B為對(duì)照，采用RT-qPCR法檢測(cè)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H1299中PSMA3-AS1的表達(dá)，結(jié)果顯示，PSMA3-AS1在NCI-H1299細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于BEAS-2B細(xì)胞，提示PSMA3-AS1可能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展；進(jìn)一步下調(diào)NCI-H1299細(xì)胞中PSMA3-AS1表達(dá)后，NCI-H1299細(xì)胞OD值、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均降低，且與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白CyclinD1、MMP2和MMP9的表達(dá)量減少，這說(shuō)明下調(diào)PSMA3-AS1可阻礙NCI-H1299細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與Shen等[8]報(bào)道的敲減PSMA3-AS1可抑制NSCLC細(xì)胞增殖的結(jié)果一致，這提示PSMA3-AS1有可能成為NSCLC治療的分子靶點(diǎn)。

lncRNA可發(fā)揮miRNA分子海綿作用，通過(guò)靶向結(jié)合miRNA來(lái)調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用[9-11]。本研究證實(shí)了PSMA3-AS1可在NSCLC細(xì)胞系NCI-H1299中靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-379-3p，這與NCI-H1299細(xì)胞中PSMA3-AS1表達(dá)升高，而miR-379-3p表達(dá)降低的結(jié)果一致。研究顯示，胃腺癌組織樣品中miR-379-3p呈低表達(dá)，上調(diào)miR-96-5p可誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡，miR-96-5p在胃腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用[12]；miR-96-5p在結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤、卵巢癌和甲狀腺乳頭狀癌等腫瘤中表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性表型，作為促癌基因發(fā)揮作用[13-15]。本研究結(jié)果顯示，miR-379-3p表達(dá)的上調(diào)對(duì)NCI-H1299細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲起抑制作用，這提示miR-379-3p也作為抑癌基因阻礙非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展。Guo等[16]研究顯示，LncRNA UCA1在胰腺癌患者血清外泌體中的表達(dá)水平高于健康對(duì)照者，其可通過(guò)充當(dāng)miR-96-5p海綿，減輕miR-96-5p對(duì)靶基因AMOTL2表達(dá)的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)miR-379-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了下調(diào)PSMA3-AS1對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1299增殖、遷移和侵襲的抑制作用，進(jìn)一步提示下調(diào)PSMA3-AS1通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-379-3p發(fā)揮作用。

綜上所述，PSMA3-AS1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H1299中呈高表達(dá)，而miR-379-3p呈低表達(dá)；下調(diào)PSMA3-AS1可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1299增殖、遷移和侵襲，其調(diào)控機(jī)制與負(fù)調(diào)控miR-379-3p表達(dá)，PSMA3-AS1/miR-379-3p軸可能為非小細(xì)胞肺癌的靶向分子治療提供了新的靶點(diǎn)。本研究接下來(lái)將進(jìn)一步探究miR-379-3p的靶基因及下游信號(hào)通路對(duì)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的影響，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PSMA3-AS1/miR-379-3p軸在非小細(xì)胞肺癌中的作用。