麻芯茹，郭 寒，張 偉，李 銘，趙瑩瑩，王 爽，呂鑫泉，李 享，徐 闖*，楊 威*，張冰冰*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶163319)

奶牛業(yè)是畜牧業(yè)的重要組成部分，奶牛飼養(yǎng)業(yè)是現(xiàn)代國(guó)家農(nóng)業(yè)的核心行業(yè)，與此同時(shí)奶牛相關(guān)營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病的發(fā)病率也在不斷升高[1]。除了牧場(chǎng)的日常管理與預(yù)防，奶牛其自身機(jī)體的免疫也是極其重要的。其中先天免疫作為動(dòng)物機(jī)體的第一道防線，中性粒細(xì)胞(PMN)是先天免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞,約占白細(xì)胞總量的70%[2]，細(xì)胞顯示出強(qiáng)大的抗菌功能，包括遷移、黏附、吞噬、脫粒和中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)。NETs形成過(guò)程的主要特征是核重排：核小葉丟失，伴有染色質(zhì)縮合并同時(shí)使顆粒解體。在后期階段核膜解體，隨后細(xì)胞內(nèi)容物被彈射到細(xì)胞膜上，細(xì)胞外空間形成NETs[3]。NETs可以結(jié)合微生物，阻止微生物傳播，NETs的產(chǎn)生和網(wǎng)狀組織被認(rèn)為是無(wú)菌性炎癥中非常重要的武器。PMN衍生的微囊泡代表了另一種機(jī)制，通過(guò)這種機(jī)制，PMN可以放大炎癥過(guò)程，在損傷部位和血液中都能發(fā)現(xiàn)高水平的炎癥過(guò)程[4]。

有研究表明，NETs的形成可以在保留PMN功能的情況下進(jìn)行，包括吞噬和趨化功能。這種現(xiàn)象被稱為生命性NETs；相反則稱為自殺性NETs。自殺性NETs與生命性NETs的主要區(qū)別在于刺激的性質(zhì)，其中自殺性NETs多由佛波肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)誘導(dǎo)[5]?？赏ㄟ^(guò)激活蛋白激酶C活化泛素連接酶-促分裂原活化的蛋白激酶-胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，進(jìn)而促發(fā)NETs釋放[6-7]。PMA具有廣泛的生物學(xué)活性,在動(dòng)物體內(nèi)可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的生成、調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞、促癌因子作用等[8]。旨在研究不同時(shí)間與濃度的PMA刺激PMN對(duì)NETs形成的影響。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+是最重要的第二信使，對(duì)真核細(xì)胞的廣泛生物學(xué)過(guò)程至關(guān)重要[9]，Ca2+釋放激活的Ca2+(CRAC)通道是細(xì)胞內(nèi)鈣的主要來(lái)源，由鈣通道蛋白Orai1組成，形成通道的Ca2+滲透孔。Ca2+升高有利于ROS代謝途徑的產(chǎn)生進(jìn)而增加活性氧(ROS)的表達(dá)[10]，而NETs細(xì)胞死亡過(guò)程不同于凋亡和壞死，取決于NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS[11]。ROS可以觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)NETs的增加并通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)膜上的Ca2+傳感器和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)調(diào)節(jié)Ca2+的水平[12]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自黑龍江省大慶市某集約化奶牛場(chǎng)選取體況相似的健康奶牛，尾靜脈采血,肝素抗凝管抗凝。

1.2 主要試劑牛外周血PMN分離試劑盒、多聚賴氨酸購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PBS緩沖液購(gòu)自Hyclone公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、PMA購(gòu)自Sigma；Hoechst33342核染抗熒光衰減封片劑(含DAPI)購(gòu)自北京索萊寶試劑公司；Ca2+熒光探針購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；siOrai1 RNA與siRNA-mate轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.3 奶牛血液PMN的分離在清晨喂料之前，選取體況相近且無(wú)任何疾病的奶牛，固定后通過(guò)尾靜脈采血后收集到肝素抗凝管內(nèi)，根據(jù)牛外周血PMN分離試劑盒分離PMN，在15 mL離心管內(nèi)按比例先后加入試劑盒中的A液、C液與血液，離心收集細(xì)胞，待紅細(xì)胞裂解液完全后，洗滌3次即為PMN。

1.4 NETs檢測(cè)將包被好的多聚賴氨酸爬片放入12孔板，調(diào)整PMN濃度后將細(xì)胞放入板內(nèi)，添加PMA刺激后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。棄掉12孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS清洗3次，吸盡PBS后，加入300 μL的4%多聚甲醛固定，重復(fù)PBS清洗。去除爬片上的多余液體，載玻片上滴1滴Hoechst33342核染抗熒光衰減封片劑，避光，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5 在不同PMA刺激時(shí)間的條件下培養(yǎng)PMN將1.3分離的健康組的PMN分成6組，每組分別用加入100 nmol/L的PMA的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)37℃、5% CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)1，2，3，4，5，6 h，根據(jù)1.4步驟通過(guò)激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 在不同PMA濃度的條件下培養(yǎng)PMN將1.3分離的健康組的PMN分成4組，每組分別用加入10，50，100，200 nmol/L PMA的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，根據(jù)1.4步驟通過(guò)激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 沉默Orai1基因?qū)⒎蛛x出的PMN調(diào)整濃度后，為穩(wěn)定細(xì)胞，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后，根據(jù)吉瑪基因轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)siOrai1 RNA引物序列(表1)，設(shè)計(jì)引物沉默Orai1基因。設(shè)計(jì)對(duì)照組，不加入siOrai1 RNA沉默24 h。

表1 siOrai1 RNA引物序列

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鈣為了分析Orai1基因?qū)ETs內(nèi)鈣的影響，將收集到的PMN調(diào)整密度后，按照1.7方法沉默24 h后加入PMA刺激3 h，清洗后經(jīng)改良臺(tái)氏液重懸后，經(jīng)Fluo-3AM試劑盒配比稀釋染色，避光37℃孵育30 min，清洗后上機(jī)檢測(cè)。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS為了分析Orai1基因?qū)ETs內(nèi)ROS水平的影響，將收集到的PMN調(diào)整密度后，進(jìn)行1.7步驟沉默24 h后加入PMA刺激3 h，經(jīng)改良臺(tái)氏液重懸后，根據(jù)普利來(lái)ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，清洗后通過(guò)FCM測(cè)定熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 不同PMA刺激時(shí)間的條件下PMN NETs檢測(cè)經(jīng)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，奶牛PMN經(jīng)PMA刺激3 h，NETs的形成效果最好(圖1)。

2.2 不同PMA刺激濃度的條件下PMN NETs檢測(cè)如圖2所示，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明，PMA濃度為100 nmol/L時(shí)，奶牛血液PMN細(xì)胞NETs的形成效果最好。

A.～D.分別為10，50，100，200 nmol/L PMA刺激3 h形成的NETs

2.3 檢測(cè)PMA刺激下PMN內(nèi)Ca2+水平如圖3可見(jiàn)，沉默PMNOrai1后， NETs內(nèi)Ca2+極顯著降低，表明NETs通過(guò)Orai1影響Ca2+水平(P<0.01)。

A.轉(zhuǎn)染siNEG和siOrai1細(xì)胞中的Ca2+表達(dá)水平；B.轉(zhuǎn)染siNEG和siOrai1細(xì)胞中的Ca2+水平相對(duì)豐度；“**”表示對(duì)照組和沉默PMN Orai1呈現(xiàn)極顯著性差異

2.4 檢測(cè)PMA刺激下PMN內(nèi)ROS水平由圖4可見(jiàn)，沉默Orai1后，NETs內(nèi)ROS水平明顯降低(P<0.05)。

A.轉(zhuǎn)染siNEG和siOrai1細(xì)胞中的ROS表達(dá)水平；B.轉(zhuǎn)染siNEG和siOrai1細(xì)胞中的ROS水平相對(duì)豐度；“**”表示對(duì)照組和沉默PMN Orai1呈現(xiàn)極顯著性差異

3 討論

PMN是維持機(jī)體生理狀態(tài)穩(wěn)定的重要細(xì)胞，其能對(duì)破壞機(jī)體屏障的病原體做出快速和多樣化的反應(yīng)，并使組織恢復(fù)到無(wú)菌狀態(tài)。PMN能有效地吞噬和殺死微生物，在動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用[13]。NETs形成是一種新的PMN程序性死亡方式，是一個(gè)多步驟的死亡途徑[14]，通過(guò)髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)對(duì)抗細(xì)胞外微生物。而NE缺陷型小鼠不能形成NETs，表現(xiàn)出免疫缺陷[15]。

PMA刺激的PMN釋放DNA，形成細(xì)胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，修飾殺菌蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)PMA誘導(dǎo)1 h后NETs形成較少，在刺激2～3 h后NETs形態(tài)逐漸增加，4～6 h后開(kāi)始下降。分別用10，50，100，200 nmol/L PMA刺激3 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100 nmol/L的PMA形成NETs效果最好。

Ca2+在細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和執(zhí)行功能等各方面發(fā)揮著重要作用，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的體積小，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+儲(chǔ)量減少會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)Ca2+的增加很小。所以當(dāng)細(xì)胞被激活時(shí)，儲(chǔ)存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+被釋放。進(jìn)而細(xì)胞內(nèi)的主要來(lái)源是由Ca2+釋放激活Ca2+產(chǎn)生的，Ca2+通過(guò)釋放激活位于質(zhì)膜中，由鈣通道蛋白Orai組成，這些通道蛋白具有很高的Ca2+選擇性，形成通道的Ca2+滲透孔，從而使鈣流入細(xì)胞，以確保連續(xù)的細(xì)胞外來(lái)源的Ca2+。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)PMN沉默Orai1,NETs內(nèi)Ca2+水平極顯著降低，證明PMN成功沉默Orai1，影響奶牛血液PMN Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。NETs的形成取決于ROS的產(chǎn)生，ROS使PMN能夠通過(guò)NADPH氧化酶激活來(lái)滿足其抗菌功能。沉默Orai1導(dǎo)致NETs內(nèi)ROS表達(dá)極顯著下降，由于沉默Orai1影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+，從而影響NETs狀態(tài)下的ROS水平。

奶牛PMN在100 nmol/L的PMA條件下刺激3 h NETs形成的效果最好。沉默PMN膜上Orai1蛋白，導(dǎo)致NETs內(nèi)Ca2+和ROS水平降低。