趙怡凡，馬增友，方俊博，孟碟方，彭 輝

(福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建 福州 350002)

酪氨酸-色氨酸羥化酶激活蛋白(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein，又稱為YWHA蛋白)普遍存在于真核生物中且高度保守。YWHA蛋白通常以單體相對(duì)分子質(zhì)量約為30 kDa的同源或異源二聚體形式存在。該蛋白家族在哺乳動(dòng)物中有7個(gè)成員，分別為YWHAB、YWHAG、YWHAQ、YWHAH、YWHAZ、YWHAE和SFN[1-3]。YWHA蛋白又被稱為磷酸化絲氨酸/磷酸化蘇氨酸結(jié)合蛋白，有研究表明，YWHA蛋白可以與靶蛋白的磷酸化位點(diǎn)結(jié)合，如激酶、磷酸酶、跨膜受體、轉(zhuǎn)錄因子等[4]。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和生物化學(xué)方法已經(jīng)檢測(cè)到200多種可能與YWHA蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，這些蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝等生命活動(dòng)[5-6]。YWHA蛋白可結(jié)合特定的磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸序列，并通過(guò)改變靶蛋白細(xì)胞定位、改變酶活性和調(diào)節(jié)蛋白-蛋白相互作用來(lái)發(fā)揮功能[7-9]。

YWHAZ是YWHA蛋白家族成員之一，YWHAZ參與多種細(xì)胞信號(hào)通路，在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期中發(fā)揮作用[10]。有研究表明，C.elegans的PAR-5蛋白與哺乳動(dòng)物中的YWHAZ蛋白高度同源[11]，PAR-5在C.elegans早期胚胎非對(duì)稱發(fā)育中起重要作用，PAR-5蛋白水平顯著降低會(huì)導(dǎo)致胚系缺陷和不育[12]。YWHAZ蛋白在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR、Western blot、免疫熒光和RNAi等方法研究YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)、定位和作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性和雄性ICR小鼠購(gòu)自福建省福州市閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠飼養(yǎng)條件良好，自由采食及飲水，飼養(yǎng)過(guò)程中的晝夜明暗循環(huán)為14 h/10 h，室溫控制在25℃。

1.2 主要試劑人絨毛膜促性腺激素(hCG)和孕馬血清促性腺激素(PMSG)購(gòu)自寧波第二激素廠；YWHAZ兔多克隆抗體和KSOM培養(yǎng)液購(gòu)自Sigma；Ywhaz siRNA購(gòu)自Santa Cruz；siPORTTMAmine Transfection Agent購(gòu)自Applied Biosystems；CellAmpTMWhole Transcriptome Amplification Kit購(gòu)自TaKaRa。

1.3 早期胚胎的收集與培養(yǎng)8～10周齡雌性小鼠腹腔注射10 IU PMSG刺激卵泡生長(zhǎng)發(fā)育，48 h后注射10 IU hCG促排，將處理后的母鼠與公鼠合籠，14 h后檢查陰道栓，采取脫頸法將有陰道栓的雌性小鼠處死。取出輸卵管置于H-KSOM操作液中，在體視顯微鏡下用無(wú)菌的1 mL皮下注射器劃破輸卵管，釋放卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，再將卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體吸至透明質(zhì)酸酶溶液中，消化卵丘細(xì)胞收集合子，將合子轉(zhuǎn)移至平衡好的培養(yǎng)皿中，在37℃、5% CO2飽和濕度下恒溫培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR和qRT-PCR使用CellAmpTMWhole Transcriptome Amplification Kit試劑盒分別將10個(gè)1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚直接逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后對(duì)反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。合成的cDNA按50倍稀釋后作為模板分別進(jìn)行RT-PCR和qRT-PCR擴(kuò)增，特異性引物參見(jiàn)表1。

表1 基因特異性引物信息

1.5 Western blot檢測(cè)收集1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚各50個(gè)，將胚胎加入含有全蛋白酶抑制劑(Roche)和IP裂解液(1∶25)的離心管中，冰上孵育2 min使胚胎充分裂解，再加入SDS上樣緩沖液，煮沸變性10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%封閉液室溫孵育4 h，之后將NC膜浸入一抗中4℃孵育過(guò)夜。0.1% TBST搖洗3次，IRDye?近紅外熒光二抗按1∶10 000的比例稀釋，NC膜浸入二抗溶液中室溫避光孵育2 h。0.1% TBST搖洗3次后，再用TBS搖洗3次，將NC膜置于雙色紅外激光成像系統(tǒng)Odyssey CLx中曝光拍照。

1.6 免疫熒光檢測(cè)收集1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚各10個(gè)，PBS洗滌3次，將各時(shí)期胚胎置于4%多聚甲醛溶液中固定1 h。之后將胚胎吸入0.1% Triton X-100中，室溫孵育20 min，增加細(xì)胞膜通透性。通透打孔后的胚胎在免疫染色封閉液中室溫封閉4 h，將封閉后的胚胎吸入一抗溶液中4℃孵育過(guò)夜。免疫熒光洗滌液搖洗3次后加入熒光二抗，室溫避光孵育2 h。免疫熒光洗滌液搖洗3次，加入DAPI染色液染核10 min，免疫熒光洗滌液搖洗3次后將胚胎吸至載玻片上，滴加熒光抗淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 siRNA轉(zhuǎn)染收集合子置于酸性臺(tái)氏液中10～20 s消化透明帶，然后向培養(yǎng)皿中加入1 mL H-KSOM終止消化，吸出合子用H-KSOM清洗2次備用。在Opti-MEM培養(yǎng)基中加入siPORTTMAmine Transfection Agent，室溫孵育10 min。將siRNA加入到Opti-MEM培養(yǎng)基中。將上述配好的試劑1∶1混合，室溫靜置孵育10 min使siRNA和轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合。用Opti-MEM沖洗電轉(zhuǎn)皿，最后吸取混合液加入電轉(zhuǎn)皿的兩根電極之間，再將合子加入到電轉(zhuǎn)皿的凹槽中并使合子呈線性排列。電轉(zhuǎn)儀的參數(shù)設(shè)置為：電壓22 V、脈沖時(shí)間1 ms、脈沖間隔500 ms、脈沖次數(shù)3次。電轉(zhuǎn)之后，用吸卵針吸出處理后的合子并在H-KSOM操作液中清洗，置于平衡好的KSOMaa培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2飽和濕度下恒溫培養(yǎng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析各試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次，所有分析均采用SPSS 19.0軟件，使用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1YwhazmRNA及蛋白在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)利用RT-PCR方法對(duì)Ywhaz在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，YwhazmRNA在1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚中均有表達(dá)(圖1A)。同時(shí)，提取不同時(shí)期早期胚胎的蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳使蛋白分離，再通過(guò)Western blot檢測(cè)YWHAZ蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中均能檢測(cè)到該蛋白的表達(dá)(圖1B)。

A.Ywhaz mRNA在小鼠早期胚胎中的表達(dá)；B.YWHAZ 蛋白在小鼠早期胚胎中的表達(dá)

2.2 YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎中的定位取小鼠的1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚進(jìn)行免疫熒光染色，研究YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎中的定位。結(jié)果表明，YWHAZ蛋白定位在小鼠早期胚胎的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(圖2)。

藍(lán)色熒光為細(xì)胞核；綠色熒光為YWHAZ蛋白

2.3YwhazsiRNA的沉默效率為了研究YWHAZ在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用，首先通過(guò)電轉(zhuǎn)方式向1-細(xì)胞胚胎中轉(zhuǎn)入YwhazsiRNA，檢測(cè)基因沉默效率。結(jié)果顯示，當(dāng)YwhazsiRNA濃度達(dá)到0.7 μmol/L時(shí)，該基因的沉默效率為91%(圖3A)。使用Western blot檢測(cè)干擾組與陰性對(duì)照組的YWHAZ蛋白表達(dá)差異，結(jié)果表明，Ywhaz干擾培養(yǎng)24 h后，YWHAZ蛋白表達(dá)明顯減少(圖3B)。經(jīng)Image studio軟件分析顯示，YWHAZ蛋白表達(dá)量減少了45%(圖3C)。

A..沉默Ywhaz降低其mRNA水平的表達(dá)；B.沉默Ywhaz降低其蛋白水平的表達(dá)；C.YWHAZ蛋白在對(duì)照組和干擾組中的表達(dá)分析

2.4 沉默Ywhaz對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育的影響為了研究YWHAZ在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中是否發(fā)揮作用，本試驗(yàn)將YwhazsiRNA轉(zhuǎn)入1-細(xì)胞胚胎，之后在體外將其培養(yǎng)至囊胚。胚胎發(fā)育4.5 dpc時(shí)，其形態(tài)學(xué)特征如圖4A所示。陰性對(duì)照組與干擾組之間發(fā)育情況存在明顯差異，干擾組2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚的發(fā)育率極顯著低于對(duì)照組(P< 0.01)。在4.5～5.0 dpc的過(guò)程中，對(duì)照組囊胚率無(wú)明顯變化，而干擾組囊胚率顯著增加，但

A.Ywhaz沉默后的胚胎培養(yǎng)4.5 dpc的形態(tài)學(xué)特征；B.培養(yǎng)不同天數(shù)的胚胎發(fā)育百分率；*P<0.05；** P<0.01

對(duì)照組與干擾組間仍存在顯著性差異(P<0.05)(圖4B)，表明沉默Ywhaz可導(dǎo)致小鼠早期胚胎發(fā)育率降低，雖大部分胚胎能發(fā)育到囊胚，但存在明顯的胚胎發(fā)育延遲現(xiàn)象。

3 討論

本研究通過(guò)RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)了YwhazmRNA及其編碼的蛋白在小鼠早期胚胎中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YwhazmRNA在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá)，并且表達(dá)較為穩(wěn)定。本試驗(yàn)結(jié)果與Ywhaz基因在人、兔、牛等早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況一致[13-15]。本研究結(jié)果顯示，YWHAZ蛋白在小鼠早期胚胎的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，同時(shí)定位于早期胚胎的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，提示該蛋白可能在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。

小鼠受精卵在體內(nèi)經(jīng)過(guò)3.5 dpc可發(fā)育至囊胚，體外培養(yǎng)條件下需要4.0～4.5 dpc發(fā)育至囊胚。本研究采取1.5，2.5，3.0，3.5，4.5 dpc時(shí)觀察2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚發(fā)育情況。結(jié)果顯示，Ywhaz沉默組各時(shí)期發(fā)育率都顯著低于對(duì)照組，表明沉默Ywhaz可導(dǎo)致小鼠早期胚胎發(fā)育率降低。將觀察時(shí)間延長(zhǎng)至5.0 dpc，沉默組囊胚率顯著增高，但仍低于對(duì)照組，提示沉默Ywhaz可影響早期胚胎發(fā)育進(jìn)程，囊胚發(fā)育延遲。有研究表明，YWHAZ蛋白通過(guò)與CDC25蛋白結(jié)合并調(diào)節(jié)其功能而參與了G1/S期轉(zhuǎn)變和G2/M期轉(zhuǎn)變，在有絲分裂間期發(fā)揮作用[16]。此外，YWHAZ與Polo樣激酶1(polo-like kinase 1,Plk1)在有絲分裂過(guò)程中存在相互作用，并共同定位于胞質(zhì)分裂過(guò)程中的中心體。YWHAZ的缺失導(dǎo)致細(xì)胞染色體分離滯后，處于胞質(zhì)分裂期的細(xì)胞明顯增多[17]，這也可能是沉默Ywhaz延遲早期胚胎發(fā)育的原因。

本試驗(yàn)雖然使用siRNA將Ywhaz基因的表達(dá)量降低了91%，但YWHAZ蛋白表達(dá)量?jī)H降低了45%，早期胚胎中殘留的YWHAZ蛋白可以繼續(xù)支持早期胚胎發(fā)育。此外，YWHA家族成員在結(jié)構(gòu)和功能上類似，不同的亞型可以與相同的配體結(jié)合。因此，YWHA家族其他成員也可能代償了YWHAZ蛋白的功能，以致Ywhaz沉默組大部分胚胎仍可以發(fā)育至囊胚。研究表明，YWHAZ通過(guò)形成同源或異源二聚體與靶蛋白結(jié)合而發(fā)揮作用[18]。在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，YWHAZ也可能與其他蛋白形成復(fù)合體進(jìn)而調(diào)節(jié)早期胚胎的發(fā)育，但該蛋白與何種蛋白形成復(fù)合體還有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究利用RT-PCR、Western blot、免疫熒光和RNAi技術(shù)闡明了YwhazmRNA及其編碼的蛋白在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)、定位和作用，揭示了在合子中沉默Ywhaz基因可導(dǎo)致小鼠早期胚胎發(fā)育率降低，且出現(xiàn)囊胚發(fā)育延遲現(xiàn)象。