鄭慧華，張玉珠，高文睿，唐欣悅，杜崇濤，謝光洪

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

隨著犬的壽命延長(zhǎng)，癌癥的發(fā)病率也隨之增加。乳腺腫瘤是母犬中最常見的腫瘤，其中約50%是惡性的，其病因尚不清楚[1]。目前為止，唯一有效的治療方法是手術(shù)切除術(shù)，包括乳房全切和局部腫瘤切除。通常，還會(huì)同時(shí)進(jìn)行子宮卵巢切除術(shù)(ovariohysterectomy,OHE)，但OHE并不是對(duì)所有犬都有預(yù)防乳腺腫瘤的作用[2]。在大多數(shù)惡性腫瘤病例中，還需要進(jìn)行化學(xué)治療或放射治療。然而，這2種治療方法費(fèi)用高，而且對(duì)犬乳腺腫瘤(canine mammary tumor,CMT)療效的信息也很有限[3]。因此，早期發(fā)現(xiàn)CMT對(duì)患犬的預(yù)后至關(guān)重要，而腫瘤標(biāo)志物對(duì)此可以提供有用的信息，其評(píng)估可能是腫瘤早期診斷和評(píng)估疾病進(jìn)展及其對(duì)化療反應(yīng)的里程碑[4]。不幸的是，臨床上對(duì)CMT標(biāo)志物知之甚少。故本文簡(jiǎn)要介紹了CMT常見的標(biāo)志物。

1 癌細(xì)胞增殖和凋亡的標(biāo)志物

腫瘤細(xì)胞增殖活性的預(yù)測(cè)有助于判斷腫瘤的惡性程度，且高增殖率與腫瘤生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)。增殖細(xì)胞核抗原(Ki-67)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和基質(zhì)細(xì)胞蛋白(POSTN)是腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，而腫瘤抑制蛋白p53(tumor protein p53,p53)是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化和凋亡的標(biāo)志物。

1.1 Ki-67作為CMT最常用的預(yù)后標(biāo)志物，Ki-67是一種非組蛋白性核蛋白，其表達(dá)僅限于細(xì)胞增殖周期的G1、S、G2和M期[5]。它是一種血清或細(xì)胞標(biāo)志物，可以在犬乳腺細(xì)針活檢的細(xì)胞學(xué)樣本中進(jìn)行評(píng)估，這為腫瘤的早期診斷提供了選擇。有研究表明，CMT血清中Ki-67水平與腫瘤病理學(xué)等級(jí)呈正相關(guān)，而在健康犬中未檢測(cè)到[6]。免疫組化(IHC)檢測(cè)Ki-67表達(dá)情況，結(jié)果表明惡性CMT的Ki-67水平明顯高于良性腫瘤，且與腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良、生存時(shí)間短呈正相關(guān)；Ki-67在臨床和組織病理學(xué)特征較差的腫瘤中表達(dá)量高，如體積大、伴隨乳腺炎癥及潰瘍、侵犯周圍組織、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤[5]。目前，這一腫瘤標(biāo)志物存在廣闊的應(yīng)用前景，但仍需要在同質(zhì)性更高的群體中做進(jìn)一步的研究。

1.2 PCNA作為增殖指數(shù)(proliferation index,PI)的一個(gè)標(biāo)志物，PCNA是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，在細(xì)胞分裂的DNA合成期表達(dá)于細(xì)胞核，并參與DNA修復(fù)、細(xì)胞周期控制、染色質(zhì)組裝和RNA轉(zhuǎn)錄[7]。PCNA在CMT病例中高表達(dá)，且在腫瘤惡性程度高、腫瘤體積大、皮膚潰瘍、組織學(xué)分級(jí)Ⅱ或Ⅲ級(jí)以及存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中表達(dá)更強(qiáng)。BORGHESI等[8]研究證實(shí)，PCNA在非腫瘤性鄰近組織中的表達(dá)量低于腫瘤組織，表明腫瘤存在早期微轉(zhuǎn)移和更高的侵襲性，這一點(diǎn)在組織學(xué)上也得到了證實(shí)。由此可判斷，PCNA的高表達(dá)與預(yù)后不良和存活率降低有關(guān)。但細(xì)胞因子刺激也可能導(dǎo)致PCNA表達(dá)升高，故建議結(jié)合Ki-67來評(píng)估PCNA的表達(dá)。

1.3 POSTN成纖維細(xì)胞(CAF)是一種在腫瘤基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的、與癌癥相關(guān)的細(xì)胞，其在血管生成中起作用，并可增加細(xì)胞遷移，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移。作為CAF等癌癥間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物之一，POSTN是一種參與腫瘤轉(zhuǎn)化過程的蛋白質(zhì)，在人類的各種類型癌癥中都發(fā)現(xiàn)了高水平的POSTN。BORECKA等[9]研究證明了POSTN可以在CMT中表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤病理學(xué)等級(jí)和Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)，表明POSTN可能會(huì)影響腫瘤的侵襲性并參與乳腺腫瘤的發(fā)展。因此，POSTN可能是評(píng)估CMT癌變間質(zhì)的有用標(biāo)志物，并具有判斷預(yù)后的意義。

1.4 p53p53作為細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化、細(xì)胞分裂和凋亡的重要標(biāo)志物，負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，是必要的腫瘤抑制因子。在腫瘤形成過程中，p53積聚在腫瘤組織中，由于其基因突變，開始發(fā)揮癌基因的作用。p53基因突變?cè)贑MT中比較常見，且與腫瘤發(fā)展有關(guān)，突變型p53的高表達(dá)通常提示預(yù)后不良以及存活率降低[10]。KLOPFLEISCH等[11]研究表明，大型犬的p53表達(dá)較高，表明可能存在可遺傳的基因突變和品種易感性。但也有研究表明p53突變對(duì)腫瘤發(fā)展及患犬存活率的影響并不明顯[12]，因此，p53作為CMT的預(yù)后標(biāo)志物尚需進(jìn)一步的研究。

2 腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的標(biāo)志物

另一組重要的標(biāo)志物是某些指示腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的標(biāo)志物。腫瘤轉(zhuǎn)移的能力取決于細(xì)胞與彼此或鄰近組織的黏附，而黏附強(qiáng)度是通過參與這些過程的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平來衡量的。黏附分子有多種類型，如整合素、選擇素、免疫球蛋白樣顆粒和鈣黏附素。鈣黏附素是一種鈣依賴的跨膜蛋白，是評(píng)價(jià)腫瘤轉(zhuǎn)移的良好指標(biāo)。此外，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和糖鏈抗原15-3(carcinoembryonic antigen,CA15-3)是參與細(xì)胞內(nèi)黏附的糖蛋白，是最常被評(píng)估的乳腺癌生物標(biāo)志物之一。

2.1 上皮鈣黏素(E-cadherin)E-cadherin是一種細(xì)胞黏附分子，負(fù)責(zé)維持上皮組織的結(jié)構(gòu)和功能完整性[13]。其基因CDH1 SNP rs850805755，rs852280880和rs852639930與CMT的低風(fēng)險(xiǎn)和低侵襲性臨床病理特征之間存在關(guān)聯(lián)[14]。且E-cadherin的低表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、惡性程度、轉(zhuǎn)移侵襲和總生存時(shí)間短有關(guān)[15]。E-cadherin與β鏈蛋白(β-catenin)連接形成絡(luò)合物，絡(luò)合物的任何功能障礙都會(huì)降低細(xì)胞黏附能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[13]。E-cadherin在患犬中的表達(dá)與預(yù)后不良具有相關(guān)性，但應(yīng)與Ki-67一起評(píng)估。

2.2 CEACEA是一種參與細(xì)胞內(nèi)黏附的糖蛋白，由胃腸黏膜產(chǎn)生，定位于上皮細(xì)胞膜，在結(jié)腸、乳腺和肺部的癌細(xì)胞中過度表達(dá)，且是最早發(fā)現(xiàn)的乳腺癌生物標(biāo)志物之一。有研究證實(shí)在正常犬血清中也可以檢測(cè)到CEA，但患乳腺腫瘤犬的CEA濃度更高，且存在顯著性差異[16]。事實(shí)上，CEA既不是CMT初步診斷的特異性標(biāo)志物，也不是敏感性標(biāo)志物，但可以作為輔助標(biāo)志物檢測(cè)CMT。其可以用作早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，但不能用于確診，要確定其在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用，還需要進(jìn)一步的研究。

2.3 CA15-3CA15-3是一種跨膜糖蛋白，是Muc1基因的產(chǎn)物，表達(dá)在腺上皮細(xì)胞的頂端。研究表明血清CA15-3與犬的腫瘤組織學(xué)等級(jí)呈正相關(guān)，其高水平與臨床分期差、預(yù)后不良有關(guān)，此外，研究證實(shí)乳腺癌的腫瘤大小、皮膚潰爛、壞死、炎癥和組織學(xué)類型與血清CA15-3水平無關(guān)。且患病犬與健康犬之間存在顯著性差異[16]。CA15-3是乳腺癌患者中應(yīng)用最廣泛的血清標(biāo)志物，對(duì)CMT的預(yù)后具有重要意義。由于CA15-3比CEA更為靈敏，同時(shí)檢測(cè)兩者可以提高診斷準(zhǔn)確性，有助于選擇確切的輔助治療方法。

3 血管生成的標(biāo)志物

每一個(gè)腫瘤生長(zhǎng)發(fā)展過程都包括在原有血管的基礎(chǔ)上形成新的血管，這對(duì)為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和維持組織內(nèi)環(huán)境平衡尤為重要。隨著腫瘤的生長(zhǎng)，血管生成過程也隨之推進(jìn)。因此，這些標(biāo)志物對(duì)于確定腫瘤是否生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的。

3.1 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)VEGF可以控制血管生成，是人類醫(yī)學(xué)中最常用的標(biāo)志物。VEGF是由4個(gè)基因VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D編碼的蛋白質(zhì)，與血管和淋巴管生成密切相關(guān)。在人類醫(yī)學(xué)中，VEGF過度表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，而其下調(diào)則會(huì)抑制腫瘤發(fā)展[17]。在CMT中，組織中VEGF蛋白表達(dá)與患病犬的年齡、腫瘤大小無關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；血清中VEGF水平升高與臨床分期差、預(yù)后不良、生存率低呈正相關(guān)，通常在惡性程度較高且有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的患犬中升高，這就是其被認(rèn)為是腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志的主要原因[8,18]。總之，VEGF是一種很好的血清和細(xì)胞標(biāo)志物，且對(duì)早期發(fā)現(xiàn)CMT特別有用。

3.2 表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR、ErbB-1或HER1)EGFR是一種跨膜型酪氨酸激酶受體，屬于人表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)家族。惡性腫瘤中的EGFR被認(rèn)為是癌細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)劑，已有研究揭示了EGFR在惡性CMT發(fā)展和疾病進(jìn)展中的作用，其在腫瘤組織中的高表達(dá)與腫瘤體積大、腫瘤壞死、高分裂指數(shù)、腫瘤惡性程度的組織學(xué)分級(jí)和不良的臨床分期相關(guān)，與年齡也有一定的關(guān)聯(lián)[19]。EGFR還可以調(diào)節(jié)VEGF的合成和分泌。也有關(guān)于EGFR抑制劑在CMT治療中作用的研究，單獨(dú)使用EGFR抑制劑或聯(lián)合環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase 1,COX-2)抑制劑可能是晚期惡性CMT的良好治療選擇[19]。

3.3 人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)HER-2也被認(rèn)為是重要的腫瘤標(biāo)志物，具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和分化的功能，可以在大約30%的CMT中表達(dá)，且在血清和組織中呈正相關(guān)[20]。其表達(dá)水平與腫瘤體積、有絲分裂指數(shù)和組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，被認(rèn)為是預(yù)后不良的標(biāo)志[21]。但是也有研究存在不一致的結(jié)果，HER-2在良性腫瘤和惡性腫瘤中的表達(dá)沒有差異，甚至表達(dá)HER-2的惡性腫瘤犬比HER-2陰性犬顯示出更長(zhǎng)的存活率[22]。因此，HER-2可能參與腫瘤的形成，但不一定參與其惡性轉(zhuǎn)化，或者至少不是一個(gè)良好的惡性腫瘤標(biāo)志物，但對(duì)此還需進(jìn)一步研究。

4 激素受體

雌激素(ertrogenreceptor,ER)和孕激素受體(progestronereceptor,PR)是研究最多的CMT生物標(biāo)志物，對(duì)于正常乳腺組織的生長(zhǎng)和發(fā)育是必不可少的，同時(shí)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)也有一定的影響[22]。大多數(shù)乳腺腫瘤可以表達(dá)ER和/或PR，且催乳素和生長(zhǎng)激素也參與腫瘤的生長(zhǎng)過程。通常，ER和/或PR的表達(dá)在良性腫瘤中更為常見，其表達(dá)與預(yù)后良好有關(guān)[23]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，患惡性腫瘤犬中ER、PR和催乳素的表達(dá)水平升高[24]。在患犬ER和PR的檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，ER和PR+型CMT的臨床預(yù)后比ER+和PR+型差，但ER-和PR-型的預(yù)后是最差的[25- 26]。盡管有研究建議使用安全劑量的他莫昔芬治療CMT[27]，但關(guān)于這種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑治療CMT的療效還需要進(jìn)行更多的研究。

5 COX-2

環(huán)氧化酶催化蛛網(wǎng)膜下腔酸合成前列腺素，前列腺素E2形成的酶途徑失調(diào)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。許多研究證實(shí)了COX-2可以在CMT以及一些正常乳腺組織中表達(dá)，且在惡性腫瘤組織病理學(xué)分級(jí)之間存在顯著性差異[26,28-29]。在CMT小鼠模型中證明COX-2抑制劑可抑制腫瘤生長(zhǎng)，體外試驗(yàn)進(jìn)一步證明了COX-2抑制劑可以誘導(dǎo)CMT細(xì)胞呈依賴性凋亡[28,30]。COX-2在惡性CMT中的表達(dá)高于良性腫瘤，可以用COX-2抑制劑治療，如美洛昔康或吡羅昔康，但是其抗增殖作用的機(jī)制仍不清楚[29]。為了能達(dá)到良好的治療效果，必須提前檢測(cè)COX-2在腫瘤中的表達(dá)。

6 乳腺癌1基因和2基因突變(BRCA1、BRCA2)

在多種基因突變中，BRCA1和BRCA2突變?cè)贑MT形成中起著非常重要的作用。盡管CMT的遺傳模式仍在調(diào)查中，但有幾個(gè)品種被認(rèn)為易患病，且在與乳腺癌相關(guān)的10個(gè)不同基因突變中，只有BRCA1和BRCA2與腫瘤的發(fā)生顯著相關(guān)[31]。BRCA1與惡性腫瘤密切相關(guān)，而BRCA2在良性和惡性腫瘤中的表達(dá)并無明顯差異[32]。然而，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織相比，BRCA2在CMT中的表達(dá)減少[33]。盡管BRCA1和BRCA2已進(jìn)行了多項(xiàng)研究，但目前對(duì)他們的確切突變以及在CMT中表達(dá)降低的作用機(jī)制仍知之甚少，還需進(jìn)一步的研究。

7 MicroRNA(miRNA)

miRNAs是一種小的非編碼分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。其表達(dá)水平在不同類型的癌癥中都會(huì)發(fā)生變化，可以作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用，且?guī)缀鯀⑴c了所有重要的細(xì)胞過程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、血管生成、遷移和凋亡[34-35]。既可以作為血清生物標(biāo)記物，也可以作為組織生物標(biāo)志物。

目前，有研究對(duì)CMT組織中miRNA表達(dá)水平進(jìn)行了分析，10個(gè)與人類乳腺癌有關(guān)的miRNAs中有9個(gè)在CMT中具有相同的表達(dá)模式，且不同腫瘤類型的miRNA表達(dá)模式不同[34]。最近研究表明患乳腺腫瘤犬的血清miR-19b和miR-125a明顯高于正常犬，且miRNA在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性腫瘤中的表達(dá)存在顯著性差異，是一種良好的轉(zhuǎn)移生物標(biāo)志物[36]。JAIN等[16]證明了miR-21過表達(dá)和miR-29b下調(diào)與CMT的臨床分期有關(guān)，可作為早期診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。評(píng)估m(xù)iRNA是一種新穎且有效的癌癥診斷方法，因此，基于miRNA的藥物研發(fā)可能是一種具有廣闊應(yīng)用前景的靶向治療腫瘤的方法。

8 腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)

CSCs也被稱為腫瘤起始細(xì)胞，是一小部分具有自我更新能力的腫瘤細(xì)胞，也可以分化為不同的癌細(xì)胞。其被認(rèn)為是藥物、化療和放療耐藥、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)?，也是正常干?xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、成熟癌細(xì)胞去分化或誘導(dǎo)多潛能癌細(xì)胞的結(jié)果，而鑒定和分離這些細(xì)胞已經(jīng)成為新的治療策略的機(jī)會(huì)[37]。已有研究表明，犬乳腺CSC表達(dá)與人乳腺CSC相似的表面標(biāo)志，并且對(duì)化療和放療具有抗藥性[38]。CD44+/CD24-表型CSCs與組織學(xué)分級(jí)高的犬乳腺癌相關(guān)[39]。在另一項(xiàng)研究中，在從不同CMC細(xì)胞系分離的犬CSCs中發(fā)現(xiàn)33個(gè)miRNAs顯著減少[37]。由于犬乳腺CSCs與人乳腺CSCs具有相似的生物學(xué)行為，因此對(duì)犬乳腺CSCs模型的研究可能有助于乳腺癌的研究。然而，由于缺乏一種通用的CSC檢測(cè)方法，加之CSCs表型的多樣性及其異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)性，使得其作為一種診斷工具的開發(fā)難以預(yù)測(cè)和評(píng)估。

9 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)

CTCs是外周血中發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞，起源于原發(fā)腫瘤或其轉(zhuǎn)移瘤，故具有特定腫瘤類型的抗原性或遺傳學(xué)特征[40]。CTCs對(duì)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的發(fā)展是必要的，因此它們可能作為腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的標(biāo)志物發(fā)揮著重要作用。盡管已發(fā)現(xiàn)了一組潛在CTC，但到目前為止只進(jìn)行了幾項(xiàng)研究，利用DNA微陣列[41]，通過表達(dá)6個(gè)特異性基因來鑒定CTC，發(fā)現(xiàn)CRYAB基因?qū)TC檢測(cè)具有最高的特異性和中等的敏感性[42]。要了解這些有前景的標(biāo)志物的用處，還需要進(jìn)一步的研究。然而，CRYAB是檢測(cè)CMT轉(zhuǎn)移犬中CTCs的一種良好的標(biāo)志物。

10 總結(jié)

在過去的幾十年里，已經(jīng)有許多關(guān)于犬乳腺腫瘤標(biāo)志物的研究。然而，目前還沒有找到理想的標(biāo)志物，一個(gè)理想的生物標(biāo)志物應(yīng)該易在血液中檢測(cè)，且濃度只在惡性腫瘤病例中升高；其次，應(yīng)具有腫瘤特異性，其評(píng)估能夠給予明確的預(yù)后。血清標(biāo)志物比組織標(biāo)志物更具優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠湓u(píng)估過程是非侵入性的，并且在臨床癥狀出現(xiàn)之前就能顯示出生理和病理狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化，故可用于癌癥的早期檢測(cè)。綜上所述，應(yīng)結(jié)合臨床病理特征及組織學(xué)分級(jí)對(duì)犬乳腺腫瘤進(jìn)行診斷和預(yù)后。因此，生物標(biāo)志物的檢測(cè)是目前及未來的發(fā)展趨勢(shì)。