干白葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量及影響因素調(diào)查

阮仕立，王宏安，張杰，劉建勇，李金金，李超，王磊，王根杰，李記明

（1. 煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰炯夹g(shù)中心/山東省葡萄酒微生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái) 264001；2. 陜西丹鳳安森曼酒莊有限公司，陜西丹鳳 726200）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，簡稱EC），是大多數(shù)發(fā)酵食品（如面包、牛奶等）和酒精飲料（啤酒、白酒、葡萄酒等）生產(chǎn)和貯存過程中的一種天然副產(chǎn)物。2007年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將EC的致癌級別由之前的2B類提升認(rèn)定為2A類。一些主要葡萄酒生產(chǎn)國也相繼制定了葡萄酒中EC的限定標(biāo)準(zhǔn)。美國葡萄餐酒中的EC限量為15 μg·L-1，加拿大、韓國和捷克葡萄酒中的EC限量為30 μg·L-1[1]。目前，我國仍未制定葡萄酒中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)。近年來，隨著我國居民消費(fèi)水平的提高，葡萄酒的消費(fèi)量也日益上升，EC作為一種潛在的致癌物質(zhì)已經(jīng)逐漸引起社會(huì)關(guān)注，并成為熱門的研究對象。

葡萄酒中EC的形成途徑主要有兩個(gè)：一是尿素與乙醇結(jié)合生成，二是瓜氨酸與乙醇結(jié)合生成。尿素的主要來源有原料本身所含有的和在酒精發(fā)酵過程中精氨酸被微生物降解產(chǎn)生的；瓜氨酸的主要來源有葡萄汁中本身自有的，另外是在葡萄酒釀造后期精氨酸通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵降解而產(chǎn)生的。因此，葡萄酒中EC的形成與尿素、瓜氨酸、精氨酸三種底物的含量密切相關(guān)[2-3]。原酒在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中的高溫對其中EC的生產(chǎn)有顯著影響，隨著儲(chǔ)存溫度的升高和時(shí)間的延長，酒中EC含量增長率呈明顯上升趨勢[4-5]。也有研究表明，脲酶可以降解尿素，從而降低EC的含量[6-7]。本研究主要通過對葡萄原料、發(fā)酵原酒和成品酒中EC及其底物（尿素、瓜氨酸、精氨酸）的測定，調(diào)查葡萄酒釀造過程中EC生成的影響因素，并提出相應(yīng)的控制措施。

1 酒樣來源及調(diào)查方法

1.1 酒樣

試材由3部分組成：新疆、寧夏、煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)2018年份‘雷司令’‘貴人香’‘霞多麗’原酒19個(gè)；國內(nèi)2014—2018年份成品干白葡萄酒21個(gè)；不同國家（產(chǎn)區(qū)）的成品干白葡萄酒20個(gè)。

1.2 調(diào)查方法

1.2.1 樣品處理

本試驗(yàn)中EC及底物含量的檢測時(shí)間為2019年。

（1）新發(fā)酵干白原酒中EC含量調(diào)查。取2018年新疆（6款‘雷司令’和1款‘霞多麗’）、寧夏（6款‘貴人香’、1款‘霞多麗’）和煙臺(tái)（5款‘貴人香’）3個(gè)產(chǎn)區(qū)按正常干白發(fā)酵工藝釀造的共計(jì)‘雷司令’6款、‘貴人香’11款、‘霞多麗’2款干白原酒樣品。在酒精發(fā)酵結(jié)束進(jìn)行皮渣分離后在不銹鋼罐中靜置2周，用深綠色750 mL玻璃瓶取樣，橡木塞封口，實(shí)驗(yàn)室中常溫、避光、臥放儲(chǔ)藏，在第3、6、9月時(shí)檢測原酒中的EC含量。

（2）不同年份成品干白葡萄酒中EC含量調(diào)查。取2014—2018年的21個(gè)成品干白葡萄酒，常溫下貯存，在第3、6個(gè)月時(shí)取樣用于檢測追蹤其中的EC變化。

（3）不同國家干白葡萄酒中EC含量調(diào)查。從市場上購買20款國內(nèi)外生產(chǎn)的干白葡萄酒，常溫避光貯藏，在第0、3、6個(gè)月時(shí)檢測其中的EC，跟蹤檢測EC含量的變化。

（4）不同產(chǎn)區(qū)干白原酒中EC底物的含量差異。對2018年新疆、寧夏和煙臺(tái)3個(gè)產(chǎn)區(qū)新發(fā)酵的干白原酒進(jìn)行EC底物（尿素、瓜氨酸、精氨酸）的檢測。

（5）貯藏溫度對干白葡萄酒中EC的影響。取不同尿素含量水平下的2017年、2018年發(fā)酵的干白原酒、和成品干白葡萄酒分別置于5、20、30、40 ℃條件下儲(chǔ)存，在第3、6、9個(gè)月進(jìn)行EC檢測。

（6）脲酶處理對EC的影響。選擇兩種脲酶（1#和2#）對2018年新發(fā)酵的干白原酒進(jìn)行處理，添加量均為10 mg·L-1。每種脲酶設(shè)4個(gè)重復(fù)，將酒樣置于20 ℃條件下1個(gè)月，檢測酒樣中的尿素和EC含量，以不加脲酶為對照；再將同一酒樣放置于40 ℃條件下1個(gè)月后，再次檢測酒樣中的尿素和EC含量。另取一組酒樣外加100 mg·L-1尿素，再分別添加10 mg·L-1的上述2個(gè)脲酶，以不加脲酶為對照，以同樣溫度處理后分別在1個(gè)月后檢測尿素和EC含量。

1.2.2 EC及其底物的檢測

尿素的測定按照QB/T 4710—2014（發(fā)酵酒中尿素的測定方法 高效液相色譜法）；精氨酸、瓜氨酸的測定參照QB/T 5197—2017（葡萄酒中12種游離氨基酸的測定 高效液相色譜法）；氨基甲酸乙酯按照GB 5009.223—2014（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)—食品中氨基甲酸乙酯的測定）進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 新發(fā)酵干白原酒中EC含量情況

檢測新發(fā)酵干白原酒中EC含量結(jié)果表明，3個(gè)品種的干白原酒發(fā)酵結(jié)束后EC含量均小于5 μg·L-1，在室內(nèi)常溫存放6個(gè)月后EC未見增加，仍然小于5 μg·L-1。在第9個(gè)月時(shí)，新疆產(chǎn)區(qū)酒樣均未有EC檢出；煙臺(tái)的5款‘貴人香’中的4款有EC被檢出，含量為8.3～10.20 μg·L-1；寧夏產(chǎn)區(qū)6款‘貴人香’中5款有EC檢出，最高為27.60 μg·L-1，最低為9.30 μg·L-1，且該區(qū)的1款‘霞多麗’EC達(dá)到19款酒的最高值，為28.80 μg·L-1。

2.2 不同年份成品干白葡萄酒中EC含量情況

由表1可見，所有干白葡萄酒樣品中EC含量普遍較高，這可能與酒中底物含量偏高以及貯藏溫度有關(guān)。酒齡越長的干白葡萄酒，其EC含量越高。隨著貯藏時(shí)間的延長，在儲(chǔ)藏6個(gè)月內(nèi)，所有的干白葡萄酒中EC含量均呈緩慢增加的趨勢。2014—2018年的干白產(chǎn)品其EC增長率（6個(gè)月）不同，但酒齡較短的酒（2018年份）的EC增長率更高。

表1 成品干白葡萄酒中EC含量情況Table 1 Content of EC in dry white wine

2.3 不同國家干白葡萄酒中EC含量情況

在不同國家的干白葡萄酒中，大部分樣品中可檢出EC存在，但含量有所差異。由表2可知，在3次檢測中，EC平均含量最高的酒樣來自中國，達(dá)到16.5 μg·L-1；最低的是西班牙酒，為5.0 μg·L-1。與初始相比，第6個(gè)月所有的干白葡萄酒中EC含量都有增加，其中美國的增長率最高，達(dá)到74.38%；意大利的增長率最低，為18.97%。

表2 不同國家干白葡萄酒中EC含量Table 2 Contents of EC in dry white wine from different countries

2.4 不同產(chǎn)區(qū)干白原酒中EC底物調(diào)查

由圖1可見，不同產(chǎn)區(qū)干白原酒的尿素、瓜氨酸、精氨酸含量差別明顯。尿素水平在0.3～62.2 mg·L-1，其中寧夏產(chǎn)區(qū)普遍偏高，平均值為31.5 mg·L-1；煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)為7.7 mg·L-1；新疆產(chǎn)區(qū)最少，平均值為2.5 mg·L-1。瓜氨酸水平在0～204.4 mg·L-1，平均含量新疆產(chǎn)區(qū)最高，平均值為67.1 mg·L-1；其次為煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)24.5 mg·L-1，寧夏產(chǎn)區(qū)最少為21.2 mg·L-1。精氨酸水平在55～1012 mg·L-1，平均含量煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)最高，平均值為640.0 mg·L-1；其次為新疆產(chǎn)區(qū)440.0 mg·L-1，寧夏產(chǎn)區(qū)最少為185.0 mg·L-1。

圖1 不同產(chǎn)區(qū)干白原酒的尿素、瓜氨酸、精氨酸含量情況Figure 1 Contents of urea, citrulline and arginine in dry white wine from different areas

2.5 儲(chǔ)存溫度對干白葡萄酒中EC含量的影響

由表3可見，5個(gè)樣品中溫度對EC含量影響的差別非常大，總體表現(xiàn)為隨著儲(chǔ)存溫度的升高和時(shí)間的延長，EC含量增長率呈明顯上升趨勢。如2017年的兩個(gè)酒樣中，5 ℃ 條件下EC增長率較低，為8.73%～11.63%；但40 ℃條件下，EC增長率最高，達(dá)到143.88%～339.88%。同時(shí)EC增加與尿素含量呈正相關(guān)，尿素含量越高，相對應(yīng)EC含量也越高。但在2018年份樣品中，這個(gè)規(guī)律性不顯著，2018年尿素為21.5 mg·L-1的樣品中，40 ℃處理時(shí)EC含量153.29 mg·L-1低于其他低尿素的3個(gè)樣品，且尿素為7.5、11.3 mg·L-1的兩個(gè)酒樣在5、20 ℃處理時(shí)未檢出EC。

表3 不同尿素水平下溫度對干白葡萄酒中EC含量的影響Table 3 Effect of temperature on EC content in dry white wine under different urea level

2.6 脲酶處理對EC的影響

由表4可見，兩種脲酶處理后的干白葡萄酒中均未檢出EC，均能明顯降低尿素含量，但2#效果比1#稍差。在高濃度尿素（加100 mg·L-1尿素）存在的情況下，對照樣品1個(gè)月后EC含量增加至105.8 μg·L-1。而用1#脲酶處理1個(gè)月后，尿素降為1.2 mg·L-1，EC未檢出。2#脲酶處理1個(gè)月后尿素降為10.3 mg·L-1，EC含量為8.5 μg·L-1，約為對照樣105.8 μg·L-1的8%。

表4 脲酶處理對干白葡萄酒中尿素和EC含量的影響Table 4 effect of urease treatment on urea and EC content in dry white wine

3 結(jié)論

隨著貯藏時(shí)間的延長，干白中EC含量均呈緩慢增加的趨勢。本試驗(yàn)明晰了煙臺(tái)、寧夏、新疆3個(gè)產(chǎn)區(qū)干白原酒中尿素、瓜氨酸、精氨酸含量情況，為生產(chǎn)中針對性的控制EC底物含量提供了數(shù)據(jù)支撐。

溫度對EC含量影響很大，隨著儲(chǔ)存溫度的升高和時(shí)間的延長，EC含量增長率呈明顯上升趨勢。調(diào)查的4個(gè)溫度條件下EC含量的增長情況說明，在儲(chǔ)藏溫度為20 ℃ 條件下，個(gè)別樣品在儲(chǔ)存6個(gè)月時(shí)EC增長率達(dá)到了114.75%，因此，儲(chǔ)藏溫度不應(yīng)超過20 ℃。EC含量與尿素底物含量正相關(guān)，尿素含量越高，相對應(yīng)的EC含量越高[8-13]。另外，脲酶處理可以顯著降低葡萄酒中尿素含量。

根據(jù)本試驗(yàn)研究及國內(nèi)外其他相關(guān)研究，要控制葡萄酒中的EC處于較低水平，首先要嚴(yán)格控制葡萄原料中EC底物水平，尤其是在葡萄生長中后期要嚴(yán)格控制葡萄原料的氮肥使用量，最大限度減少葡萄原料中的氮源[14-15]；其次在發(fā)酵過程中，應(yīng)優(yōu)先選擇產(chǎn)EC較少的酵母，嚴(yán)格控制營養(yǎng)鹽的使用，在保證發(fā)酵正常情況下，最大限度減少發(fā)酵醪中的氮素營養(yǎng)；發(fā)酵溫度控制在較低的水平；優(yōu)先選擇產(chǎn)EC較少的乳酸菌；盡量不帶酵母泥陳釀，原酒澄清過濾后進(jìn)行陳釀[16-18]；第三，在原酒儲(chǔ)藏過程中，改善貯藏環(huán)境，盡量低溫儲(chǔ)藏，低溫運(yùn)輸；第四，在出廠環(huán)節(jié)，嚴(yán)格出廠檢驗(yàn)，嚴(yán)控EC及其底物限量，控制在較低水平；最后，在成品酒貯運(yùn)、銷售環(huán)節(jié)，應(yīng)對產(chǎn)品貯運(yùn)環(huán)境、倉庫溫度提出明確要求，盡可能降低運(yùn)輸及儲(chǔ)藏溫度，溫度應(yīng)不超過（含）20 ℃[19-21]。