陳 凱，趙 越

[北京大學第三醫(yī)院婦產科生殖醫(yī)學中心,國家婦產疾病臨床醫(yī)學研究中心(北京大學第三醫(yī)院)，輔助生殖教育部重點實驗室(北京大學)，生殖內分泌與輔助生殖技術北京市重點實驗室，中國醫(yī)學科學院卵成熟障礙綜合診治研究創(chuàng)新單元，北京 100191]

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡女性最常見的內分泌代謝性疾病，是無排卵型不孕癥發(fā)生的主要原因。PCOS在全球范圍內的發(fā)病率為5%～10%，其中漢族人群的發(fā)病率為5.61%[1]。隨著對PCOS遺傳方面研究的深入，多個研究團隊報道胎兒在母體子宮內受到不利環(huán)境因素的暴露能導致子一代出現(xiàn)相應表型變化[2-3]，并且多項動物實驗也佐證了這一點，同時還觀察到這種不利環(huán)境因素暴露所致的PCOS樣表型變化能進行跨代傳遞[4-6]，這提示早期不良環(huán)境因素暴露可能通過表觀遺傳調控影響后代PCOS發(fā)病的潛在機制。因此，本文主要從PCOS的臨床特征及遺傳影響因素、結合PCOS樣動物模型的子代表型特征以及可能作用機制對PCOS表型跨代遺傳的研究進展進行系統(tǒng)總結。

1 PCOS的臨床特征及遺傳影響因素

1.1 PCOS的臨床特征 PCOS臨床表現(xiàn)復雜，根據(jù)2003年鹿特丹標準，包括3種主要表現(xiàn)：(1)臨床或生化雄激素過多癥；(2)稀發(fā)排卵或無排卵；(3)多囊卵巢的形態(tài)學改變。此外，PCOS患者血清中黃體生成素(luteinizing hormone,LH)和抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)水平顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者中LH的脈沖頻率明顯增加，且與升高的雄激素共同形成一個持續(xù)升高的惡性循環(huán)[7]，而AMH水平也反映著PCOS的嚴重程度。此外，PCOS患者常伴隨肥胖、血脂紊亂、胰島素抵抗、糖耐量異常等多種代謝合并癥[8]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PCOS女性的肥胖發(fā)病率高達50%，明顯高于正常女性(7.6%)[9-10]，且其腹部肥胖程度也與循環(huán)中雄激素水平正相關;PCOS患者中約60%伴發(fā)胰島素抵抗[11]，且其胰島素水平的升高進一步通過促進卵巢中P450c17表達和抑制肝臟性激素結合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)的釋放來提高循環(huán)中雄激素的水平[12]。

1.2 PCOS發(fā)生相關遺傳因素 近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的母親或姐妹等一級親屬罹患PCOS的風險也相應增加，其發(fā)病率分別為24%和32%，明顯高于普通人群(5.61%)[13]。而進一步基因層面研究發(fā)現(xiàn)，參與類固醇生成的CYP11a基因、CYP19基因，及參與其后續(xù)作用的雄激素受體AR基因和性激素結合球蛋白SHBG基因[14]，同時包括由全基因組關聯(lián)研究(Genome-wide association studies，GWAS)確定的中國漢族人群中的11個PCOS候選位點，其中包括與PCOS患者雄激素水平或胰島素功能相關的INSR、FSHR、LHCGR、DENND1A、C9orf3和RAB5B，以及與PCOS患者代謝綜合征或胰島素抵抗相聯(lián)系的THADA和TOX3，同時也包括與PCOS患者卵巢顆粒細胞增殖相關的HMGA2、YAP1以及與芳香化酶合成相關的ZNF217[15]，都被證實與PCOS發(fā)生具有一定的相關性。但是，由GWAS所確定的這些位點其所占的遺傳力比例不足10%[16]。這提示PCOS的發(fā)病機制中還存在著被研究人員忽視的影響因素，其中表觀遺傳調控機制可能在PCOS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

2 結合動物模型明確PCOS表型跨代遺傳特征

研究發(fā)現(xiàn)，內分泌干擾物在生命早期的干預能對受暴露影響個體的后代表型產生影響[17]。由于調查研究患有PCOS女性的子二代是否相應地出現(xiàn)PCOS相關表型的時間跨度較大，現(xiàn)在并沒有與之相關的臨床研究。因此，為了探究PCOS表型跨代遺傳具體的表型變化形式，利用實驗誘導的動物模型便成了較好的選擇。目前研究常用的動物模型包括產前雄激素暴露(prenatal androgen exposure,PNA)模型、產前抗苗勒管激素暴露(prenatal anti-Müllerian hormone exposure,PAMH)模型和青春期大鼠模型三種，表1分別對其PCOS模型組、子一代以及子二代的生殖內分泌及代謝相關表型進行了系統(tǒng)的歸納。

2.1 PNA模型 Risal等[5]在胚胎發(fā)育第16.5～18.5d連續(xù)給予C57BL/6J孕鼠伴或不伴高脂高糖飲食的二氫睪酮暴露，通過血清學和組織學檢測發(fā)現(xiàn),受暴露孕鼠的后代肛門生殖距離(anogenital distance,AGD)增加，睪酮、雄烯二酮水平降低，動情期縮短，卵母細胞DNA修復以及線粒體形態(tài)異常和脂肪量增加，即表現(xiàn)為PCOS樣表型改變，因此將該后代定義為PCOS模型組。隨后將該模型組小鼠與正常雄鼠交配，進而檢測發(fā)現(xiàn)子一代、子二代小鼠AGD增加、卵母細胞DNA修復以及線粒體形態(tài)異常和脂肪量增加。然而，子一代、子二代小鼠并未出現(xiàn)血清睪酮、雄烯二酮水平的降低，并且在子二代小鼠中也并未檢測到動情周期紊亂現(xiàn)象。此外，與PCOS模型組及其子一代小鼠不同的是，子二代小鼠表現(xiàn)出了明顯的體重增加。

2.2 PAMH模型 Mimouni等[4]通過觀察在胚胎發(fā)育第16.5～18.5d連續(xù)受到AMH暴露影響的C57BL/6J孕鼠后代的表型發(fā)現(xiàn)，受到產前暴露影響的孕鼠，其后代出現(xiàn)了雄激素、LH水平升高和AGD增加，動情間、后期的延長和卵巢黃體數(shù)目的減少，同時出現(xiàn)體重和脂肪量的增加以及血糖和胰島素水平的升高，表現(xiàn)為PCOS樣改變。隨后將此PCOS模型組小鼠與正常雄鼠交配得到子一代與子二代。結果發(fā)現(xiàn)，雖然子一代與子二代小鼠均出現(xiàn)了AGD增加，動情間、后期延長，體重和脂肪量增加，但是子一代小鼠并未出現(xiàn)卵巢黃體數(shù)目的減少和血糖、胰島素水平的變化，而在子二代小鼠中雖出現(xiàn)了黃體數(shù)目的降低和血糖增高，但也并未觀察到循環(huán)中雄激素、LH和胰島素水平的變化。

2.3 青春期大鼠模型 Zhang等[6]通過給予27日齡的Sprague-Dawley(SD)大鼠連續(xù)20d的6mg/100g體重劑量的脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)暴露，誘導出具有PCOS樣表現(xiàn)的模型組大鼠，即表現(xiàn)為睪酮和LH升高、動情間期延長、卵巢囊性變和生育力降低。隨后將PCOS模型組大鼠與正常雄鼠雜交獲得子一代，而子二代大鼠是由對照組和PCOS模型組的子一代大鼠組內或組間雜交獲得。經進一步的血清學與組織學檢測發(fā)現(xiàn)，子一代與子二代均出現(xiàn)了動情周期紊亂、LH水平升高和卵巢多囊樣改變表型的傳遞。同時，子一代與子二代還出現(xiàn)了明顯的體重增加、糖耐量降低與胰島素抵抗。此外，在子二代大鼠中，雖未觀察到生育力降低現(xiàn)象，但是其睪酮水平升高，甘油三酯代謝存在異常。

綜合以上發(fā)現(xiàn)，雖然PNA模型、PAMH模型和青春期大鼠模型三種動物模型造模方法不同，但是PCOS模型鼠的子二代均出現(xiàn)了體重增加及雄激素相關指標升高。與PNA模型不同，PAMH模型與青春期大鼠模型子二代均出現(xiàn)了明顯的動情周期紊亂表現(xiàn)，并且在此兩種模型中還可觀察到血糖、胰島素、甘油三酯代謝指標變化。此外，PNA模型的子二代出現(xiàn)卵母細胞DNA修復以及線粒體形態(tài)異常，而PAMH模型中的子二代主要表現(xiàn)為卵巢黃體數(shù)目減少，青春期大鼠模型的子二代則呈現(xiàn)卵巢多囊樣改變。因此，雖然此三種模型的子二代均出現(xiàn)了PCOS表型的跨代遺傳現(xiàn)象，但是其具體的表型變化特征仍有明顯差異，提示母體不同暴露因素和方式對其后代表型的影響機制可能有所不同。

表1 動物模型中的PCOS表型跨代遺傳

3 PCOS表型跨代遺傳的潛在機制

上述動物實驗研究表明，產前暴露會導致子宮內環(huán)境的改變，從而引起后代停留在減數(shù)第二次分裂中期的卵母細胞出現(xiàn)基因表達的差異，如在PCOS女性患者血清中表達水平升高的TIAL1基因[4-5]。這些差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)不僅能通過影響相關的信號通路，如參與卵泡早期類固醇激素調節(jié)的FOXO信號通路[22]或在卵泡的發(fā)生和閉鎖中扮演重要角色的TGF-β信號通路[23]，進而影響早期胚胎的發(fā)育，還能作為印記基因參與到表觀基因組的修飾調節(jié)中，最終通過DNA甲基化等修飾水平的改變，影響原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)的重編程過程[5,24]，造成跨代遺傳的現(xiàn)象。由此可知，表觀遺傳機制在PCOS表型跨代遺傳中具有不可忽視的作用。因此，我們將對近年來PCOS表型跨代遺傳中表觀遺傳的潛在機制進行較詳細的總結。見圖1。

圖1 結合動物模型分析PCOS跨代遺傳潛在機制示意圖

3.1 DNA甲基化水平的改變 研究表明，DNA甲基化水平的改變作為基因組印記改變的一種重要形式，參與了表型跨代遺傳效應。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸簇的胞嘧啶上,甲基通過與胞嘧啶堿基的共價結合完成DNA甲基化過程。而在細胞中這一過程主要依賴DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferases 1,DNMT1)來維持，其能復制模板鏈上的甲基化記號，從而在細胞分裂周期中將其準確地傳遞給子鏈[25]，保證了此種表觀遺傳信息的穩(wěn)定遺傳。但是不利的環(huán)境因素暴露能降低DNMT1的活性，進而影響生殖細胞的DNA甲基化過程，導致DNA低甲基化的產生[26]，這與動物實驗中得到的差異性DNA甲基化水平改變相符合。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這種DNA低甲基化改變主要位于啟動子區(qū)域[4,25]，因此其能通過影響基因表達調控過程，引起表型的變化。RNA測序(RNA sequencing，RNA-seq)和甲基化DNA免疫沉淀結合深度測序(methylated DNA immunoprecipitation combined with deep sequencing，MeDIP-seq)發(fā)現(xiàn)，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor 1a，CDKN1A)[27]、組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase，HDC)以及甲基胞嘧啶雙加氧酶1(ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1,TET1)[28]等基因在體外試驗的PCOS模型小鼠中出現(xiàn)了較顯著的甲基化水平降低[4]。CDKN1A在PCOS患者中能調節(jié)顆粒細胞的增殖[29-30]。正常情況下，CDKN1A在排卵時會上調表達從而抑制顆粒細胞的增殖，促進排卵過程[29]。但在動物模型的研究中發(fā)現(xiàn),產前AMH的暴露會導致子二代CDKN1A甲基化水平降低，出現(xiàn)基因表達下調，因此促進了顆粒細胞的增殖[4,30],而這與觀察到的PCOS患者卵巢顆粒細胞增殖增加相符[30]。另外，HDC作為組胺合成通路中的限速酶,催化著組氨酸向組胺的轉變[31]，此過程主要發(fā)生在晚期或慢性炎癥階段[32]。但是，HDC的甲基化水平降低引起了其基因表達的增多[4]，進而導致PCOS患者炎癥水平加重。更進一步研究發(fā)現(xiàn)，參與了5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)向5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5-hmC)的轉化，從而發(fā)揮去甲基化作用的TET1[33-34]在體外實驗和PCOS患者血清中均存在顯著的低甲基化水平和表達增加[4]，這可能是引起PCOS患者DNA甲基化水平降低的一個可能原因。與設想不同的是，雖然參與甲基化維持的環(huán)指結構域蛋白1(RING finger domain-containing protein 1，Uhrf1)[35]在體外實驗中也出現(xiàn)了低甲基化水平的明顯改變，但在PCOS女性患者中并不顯著[4]?？偠灾?，雖然PGCs會發(fā)生包括DNA甲基化標記擦除在內的表觀遺傳重編程事件[36]，但是這種擦除的效果并不相同，即仍保留有部分甲基化標記未被清除[37-38]。此外，也有觀點認為表觀遺傳修飾在甲基化標記的擦除過程中存在抵抗作用[25]，而這些均與動物實驗的觀察結果，即DNA甲基化水平改變經過世代傳遞出現(xiàn)在子二代相符合。因此，可推測DNA甲基化水平的改變似乎是通過逃脫重編程，進而在PCOS表型跨代遺傳中發(fā)揮作用。

模式圖顯示了在青春期或胚胎發(fā)育16.5～18.5d受到DHEA、AMH或DHT暴露的動物模型，其發(fā)生PCOS跨代遺傳的潛在調控分子CDKN1A、HDC、TET1及Nap1甲基化或乙?；揎椝降母淖儯@些改變影響了基因表達，其中表達水平上升被標記為“綠正三角”，表達水平降低被標記為“紅倒三角”

3.2 組蛋白修飾水平的改變 組蛋白是真核染色質的組成成分之一，其能與DNA相互結合形成核小體。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白能調節(jié)DNA序列中的控制元件[39],通過其修飾水平，如乙?；?、甲基化等水平的改變，影響基因表達。一項關于PCOS患者卵丘細胞(cumulus cells，CCs)中CYP19A1基因表達水平的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3賴氨酸9(histone H3 lysine 9，H3K9)的乙?；ㄟ^作用于啟動子PⅡ促進其mRNA的轉錄，導致芳香化酶合成增加[40]。但從PAMH模型可知，作為組蛋白伴侶參與核小體組裝和拆卸的核小體組裝蛋白(Nucleosome assembly proteins 1，Nap1)[41]在子二代小鼠卵巢中表達水平降低[4]。Nap1已被證明可抑制組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)對組蛋白H1的去乙酰化[42-43]，從而保持組蛋白H1的乙?；?，進而通過破壞DNA與核小體之間的靜電作用，導致染色質松弛，促進轉錄[42,44]。因此，可推測子二代PCOS小鼠相關表型的異常可能與Nap1表達降低之后，組蛋白H1乙?；浇档停D錄受抑制有關。但是子二代小鼠并未受到暴露影響，所以此種包含組蛋白乙?；礁淖兊谋碛^遺傳信息可能是經世代傳遞所致，但其具體機制仍有待于研究。

目前研究發(fā)現(xiàn)，不利環(huán)境因素暴露引起的PCOS表型跨代遺傳涉及DNA甲基化水平以及組蛋白修飾水平的改變兩方面(圖1)。但需注意的是，只有在胚胎發(fā)育的特定時期，如胎兒性別決定時期的暴露才能永久性地改變生殖細胞的表觀遺傳標記，并通過受精卵穩(wěn)定傳遞給子代[45]。但是，這種永久性改變的表觀遺傳標記如何逃脫生殖細胞的重編程仍需進一步進行探究。

4 總結與展望

綜上所述，動物模型的研究證實了不利環(huán)境因素的暴露會導致PCOS相關表型變化出現(xiàn)跨代遺傳，而這可能由DNA甲基化水平改變以及組蛋白修飾水平改變來介導。雖然目前對于DNA甲基化的研究較為深入，但仍有許多方面尚未闡明，如組蛋白修飾水平的變化和非編碼RNA含量的變化如何具體參與表觀遺傳，以及這些改變了的表觀遺傳標記如何逃脫了生殖細胞早期的重編程事件。此外，動物模型的研究也提示生命早期環(huán)境暴露的重要性，因此如何降低不利環(huán)境因素的暴露需要深入探索。PCOS患者中DNA甲基化水平的改變提示甲基供體可能作為一種改善PCOS表型的潛在策略。然而由于嚙齒類動物與人類之間始終存在著差異，因此仍需進一步探索表觀遺傳機制在人類PCOS表型跨代遺傳發(fā)生發(fā)展中的重要作用。