宋雪梅，馬安娜，劉炫妍，張炎，邱婷，張衛(wèi)兵*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070）

（2.甘肅省功能乳品工程實驗室,甘肅蘭州 730070）

原料乳富含蛋白質(zhì)、脂肪，pH 接近中性，同時也含有源自健康乳房、擠乳以及運(yùn)輸過程中外界環(huán)境所侵入的許多微生物，生產(chǎn)加工前采用的貯藏條件如不恰當(dāng)時，原料乳微生物結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)成分將發(fā)生變化，對干酪、酸奶、乳粉等生產(chǎn)、品質(zhì)、質(zhì)量安全產(chǎn)生影響[1]。牦牛乳年產(chǎn)量達(dá)84.5 萬t，近6 年來，產(chǎn)量復(fù)合增長率為3.07%[2]。然而，我國擁有的1621 萬頭牦牛，主要分布在以青藏高原為中心的青海、西藏、四川、甘肅、新疆和云南等高山、亞高山地帶。牦牛日泌乳量為3.3 kg[3]，只有普通奶牛的14%。牦牛產(chǎn)奶季節(jié)性強(qiáng)，主要集中在溫度較高的暖季[4]。因此，牦牛分布以及產(chǎn)乳等特點易于導(dǎo)致牦牛乳面臨較長時間的貯藏。

低溫貯藏由于能夠抑制嗜溫微生物的生長繁殖而被廣泛地運(yùn)用于乳品工業(yè)。原料乳低溫貯藏效果取決于冷藏條件。一般而言，低溫貯藏溫度為4～6 ℃，冷藏時間的長短與原料乳收集間隔、運(yùn)送距離等相關(guān)。但是研究發(fā)現(xiàn)，隨著冷藏時間的延長，原料乳中嗜冷菌如假單胞菌屬、不動桿菌屬等大量繁殖[5]，產(chǎn)生了耐熱性蛋白酶、脂肪酶等。乳品生產(chǎn)加工前使用的巴氏殺菌雖能殺滅原料乳中絕大多數(shù)微生物，但殘留的蛋白酶、脂肪酶依然具有活性，能夠分解乳蛋白質(zhì)和脂肪，導(dǎo)致乳產(chǎn)生酸味、苦味，甚至乳發(fā)生腐敗變質(zhì)，因此，了解不同冷藏時間原料乳微生物組成變化對于乳品工業(yè)發(fā)展具有重要意義。

不同學(xué)者對冷藏過程中山羊乳、牛乳、綿羊乳等菌群特征以及相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了研究[6-8]。原料乳微生物結(jié)構(gòu)組成不僅受環(huán)境差異影響，還與宿主動物來源直接相關(guān)。牦牛生長于高寒、缺氧、枯草期和冰封期長達(dá)半年左右的環(huán)境中，牦牛乳含有3.7%～6.5%乳蛋白，高于荷斯坦牛乳、駝乳和山羊乳。脂肪含量為5.3%～8.8%，高出荷斯坦牛乳近1 倍[9]，鈣含量達(dá)154～180 mg/g，營養(yǎng)價值高。馬靜等[10]研究了青海省不同海拔地區(qū)牦牛乳的微生物多樣性，但關(guān)于不同冷藏時間牦牛乳微生物群落比較的研究鮮有報道。因此，鑒于原料乳群落的復(fù)雜性、重要性，本研究對不同冷藏時間牦牛乳細(xì)菌群落特性和理化性質(zhì)進(jìn)行了比較，為提高牦牛乳及其制品質(zhì)量安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

2020 年10 月，選取甘南藏族自治州卓尼縣木耳鄉(xiāng)自然放牧狀態(tài)的10 頭牦牛，凌晨開始擠乳。在擠乳之前，拴住牦牛的后腿，清洗雙手，然后用雙手快速、有力地上下擠壓。最后，將乳樣混合后，保存于冰袋箱中（4～6 ℃），6 h 內(nèi)運(yùn)送到實驗室。

1.1.2 試劑

E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒，美國OMEGA 公司；Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒，美國Life公司。

1.2 試驗儀器

BCD-539WF 電冰箱，青島海爾股份有限公司；FOSS MikeScanFT120 乳成分分析儀，丹麥福斯公司；DYY-6C 電泳儀電源、DYCZ-21 電泳槽，北京市六一儀器廠；FR-1000 凝膠成像系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司；ETC 811PCR 儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；Q32866Qubit? 3.0 熒光計，美國Invitrogen 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

新鮮牦牛乳無菌分裝后，4 ℃下貯藏24、72 h，編號為S1、S2，每個時間點取樣3 個，編號為S11、S12、S13、S21、S22、S23，冷藏結(jié)束后，提取細(xì)菌DNA 以及測定乳的理化指標(biāo)。

1.3.2 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和高通量測定

將一定原料乳樣在13000 r/min、4 ℃下離心5 min，除去上清液和脂肪后，取適量沉淀。按照操作說明，使用DNA 試劑盒，提取樣品中DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性，Qubit 定量檢測DNA 樣本濃度。擴(kuò)增16S rRNA 基因V3-V4 高變異區(qū)。通用引物分別為341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。所得PCR 產(chǎn)物純化回收后，構(gòu)建文庫，利用Illumina Miseq 測序平臺開展高通量測序及后續(xù)分析（生工生物工程(上海)股份有限公司協(xié)助完成）。

1.3.3 高通量測序數(shù)據(jù)處理

cutadapt 去除引物接頭序列后，根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，將成對的reads 拼接成一條序列，再按照barcode 標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后使用PRINSEQ 切除reads 尾部質(zhì)量值20以下的堿基，最終過濾掉低復(fù)雜度序列，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。

1.3.4 OTU 聚類和物種注釋

使用Usearch 軟件，按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU 聚類，聚類過程中去除嵌合體，得到OTU 代表序列，然后使用RDP classifier比對 RDP 數(shù)據(jù)庫（http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp），對每個OTU 對應(yīng)的物種分類注釋，最終分別在門、綱、目、科、屬等分類水平上統(tǒng)計樣本群落組成。

1.3.5 牦牛乳理化指標(biāo)測定

取50 mL 原料乳樣品于離心管中，預(yù)熱至40± 1℃，充分振蕩后，測定其蛋白質(zhì)、脂肪、總固性物、非脂乳固體、乳糖、酸度、酪蛋白等。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個處理重復(fù)3 次，平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示結(jié)果，利用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，Mothur軟件計算和分析微生物多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品細(xì)菌序列特征

提取樣品DNA，通過對16S rRNA 基因擴(kuò)增、測序后，產(chǎn)生了473270 個序列數(shù)，經(jīng)質(zhì)量過濾后，最終序列數(shù)為469676。樣品細(xì)菌序列特征如表1 所示，序列平均長度為428.43，樣品中最少有效序列數(shù)達(dá)65200。

表1 樣品序列基本特征Table 1 Sample sequencing information

2.2 牦牛乳中微生物多樣性分析

Alpha 多樣性指數(shù)包含Chao、Ace、Shannon、Simpson、Shannoneven，常被用來表示樣品中微生物群落多樣性和分布豐度，不同冷藏時間牦牛乳細(xì)菌多樣性結(jié)果見表2。

從表2 可知，S1、S2 樣品的Chao 指數(shù)差異不明顯。由于Chao 指數(shù)評價樣品的物種豐度，因此，說明S1、S2 中物種總數(shù)接近。S2 樣品的Shannon 和Shannoneven 指數(shù)略高于S1，說明冷藏72 h 牦牛乳中細(xì)菌多樣性呈現(xiàn)增加趨勢。

表2 牦牛乳樣品中細(xì)菌Alpha 多樣性Table 2 Alpha diversity of bacteria in yak milk samples

2.3 牦牛乳門水平細(xì)菌群落組成分析

相對豐度0.01%以上的門類10 個。現(xiàn)對相對豐度1%以上的細(xì)菌門類進(jìn)行分析，其結(jié)果見圖1。

從圖1 可知，冷藏24、72 h 牦牛乳樣品中優(yōu)勢菌為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria），這3 類微生物占到樣品中細(xì)菌的99%以上。其中，厚壁菌門為第一優(yōu)勢菌門，它在S1、S2 樣品中相對豐度分別為46.23%、46.05%，S1、S2 樣品中擬桿菌門相對豐度為28.91%和29.9%，為第二優(yōu)勢菌門。變形菌門是S1、S2 樣品中的第三優(yōu)勢菌門。

馬靜等[10]發(fā)現(xiàn)不同海拔牦牛乳中微生物主要屬于變形菌門和厚壁菌門。Liu 等[11]發(fā)現(xiàn)西藏地區(qū)自然發(fā)酵牦牛乳酸奶中99%微生物由厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門組成。本試驗注釋的微生物門類與此相同。其它細(xì)菌門類還包含相對豐度在0.05%～0.1% 的放線菌門（Actibobacteria）和Candidatus_Saccharibacteria，相對豐度0.01%～0.03%的酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）和熱袍菌門（Thermotogae）。

2.4 牦牛乳中屬水平細(xì)菌群落組成分析

不同冷藏時間牦牛乳中相對豐度0.01%以上細(xì)菌屬類27 個。相對豐度1%以上細(xì)菌屬類7 個，分別為乳球菌屬（Lactococcus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、棲水菌屬（Enhydrobacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和明串珠菌屬（Leuconostoc）。

如圖2 顯示，乳球菌屬為冷藏牦牛乳中第一優(yōu)勢菌屬，S1 樣品中乳球菌屬相對豐度為30.75%，S2 樣品中乳球菌屬相對豐度比S1 增加了22.74%。金黃桿菌屬是S1、S2 樣品中第二優(yōu)勢菌屬，S1 樣品中金黃桿菌屬相對豐度為28.73%，冷藏72 h 后，上升到29.72%。乳球菌屬和金黃桿菌屬分別占到S1、S2 樣品中細(xì)菌的59.48%和67.51%。鏈球菌屬是S1 的第三優(yōu)勢菌屬，而棲水菌屬是S2 的第三優(yōu)勢菌屬。S1、S2 樣品中第四優(yōu)勢菌屬為不動桿菌屬。

S2 樣品中金黃桿菌屬、棲水菌屬相對豐度比S1增加了3.56%、12.19%。說明延長冷藏時間，牦牛乳中金黃桿菌屬、棲水菌屬呈現(xiàn)增長趨勢。S1 樣品中鏈球菌屬、不動桿菌屬相對豐度分別比S2 高出52.64%、59.41%，說明隨著冷藏時間的延長，其鏈球菌、不動桿菌屬呈現(xiàn)較快減少趨勢。S1 和S2 樣品中假單胞菌屬相對豐度較低，分別為1.69%和1.78%，呈現(xiàn)較小增加趨勢。

馬靜等[10]發(fā)現(xiàn)不同海拔牦牛乳中棲水菌屬、金黃桿菌屬、乳桿菌屬等相對豐度較高。乳球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬和明串珠菌屬也是普通牛乳中的主要菌屬[12]。本試驗也注釋到了其它原料乳中存在的乳球菌屬、棲水菌屬、金黃桿菌屬等，但是不同原料乳中微生物優(yōu)勢菌屬存在差異。郭小杰等[13]從冬春季原料乳中分離的嗜冷菌包含25.5%假單胞菌屬、10.5%乳球菌屬、9.8%不動桿菌屬、8.8%金黃桿菌屬以及6.7%葡萄球菌屬。王媛媛等[14]發(fā)現(xiàn)在72 h 冷藏過程中，原料乳中優(yōu)勢菌屬為不動桿菌屬，其相對豐度達(dá)50%以上。原料乳中微生物優(yōu)勢菌屬受原料乳種類、地理環(huán)境、采樣季節(jié)等因素影響。

原料乳中優(yōu)勢菌屬的差異也決定了原料乳貯藏過程中菌落結(jié)構(gòu)的變化。假單胞菌屬被普遍認(rèn)為是原料乳冷藏過程中的優(yōu)勢嗜冷菌[9]，它們產(chǎn)生的耐熱胞外蛋白酶、脂肪酶對乳品質(zhì)影響較大。然而冷藏24、72 h 牦牛乳中假單胞菌屬的相對豐度較低，這主要因為假單胞菌屬一般來源于飼料、飲水、擠奶設(shè)備以及與牧場環(huán)境有關(guān)[15]，而牦牛主要以自然放牧為主。不動桿菌屬也是與乳相關(guān)的腐敗菌，普遍存在于自然界，但是冷藏24、72 h 牦牛乳中相對豐度較低，因此，假單胞菌屬、不動桿菌屬對牦牛乳品質(zhì)影響較小。

乳球菌屬、金黃桿菌屬是牦牛乳冷藏過程中的優(yōu)勢菌屬。Ribeiro 等[16]發(fā)現(xiàn)巴西地區(qū)原料乳中具有潛在致腐能力的嗜冷菌中革蘭氏陽性菌占58.2%，其中大多數(shù)為乳酸乳球菌。金黃桿菌屬具有一定蛋白質(zhì)、脂肪分解能力，對原料乳具有致腐能力。不同學(xué)者已從原料乳中分離出金黃桿菌屬菌種如Chryseobacterium mulctraesp[17]、Chryseobacterium vaccaesp[18]等。Charimba 等[19]認(rèn)為乳品中由酶分解導(dǎo)致的缺陷不僅是假單胞菌屬，還與金黃桿菌屬有關(guān)。本試驗發(fā)現(xiàn)冷藏72 h 牦牛乳中乳球菌屬、金黃桿菌屬相對豐度雖高于冷藏24 h 牦牛乳，但其相對豐度變化不太明顯，因此，低溫貯藏延緩了乳球菌屬和金黃桿菌屬快速繁殖，確保了原料乳質(zhì)量。然而，這也提醒當(dāng)牦牛乳冷藏時間進(jìn)一步延長時，乳球菌屬和金黃桿菌屬可能對牦牛乳品質(zhì)產(chǎn)生影響。

其余細(xì)菌主要包含相對豐度1%以下的20 個菌屬，分別為相對豐度為0.01%～0.38%的沙雷氏菌屬（Serratia），相對豐度 0.06%～0.17% 的Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、羅河桿菌屬（Rhodanobacter）和腸球菌屬（Enterococcus）。相對豐度0.01%～0.06%的水球菌屬（Aquisphaera）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、脫氟維托加菌屬（Defluviitoga）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、獨(dú)鳥菌屬（Dokdonella）、生絲微菌屬（Hyphomicrobium）、考古氏菌屬（Kocuria）、韓國生工菌屬（Kribbella）、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、根微菌屬（Rhizomicrobium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、鞘氨醇盒菌屬（Sphingopyxis）、發(fā)球菌屬（Trichococcus）、巨型球菌屬（Macrococcus）、中生根瘤菌（Mesorhizobium）。羅河桿菌屬曾發(fā)現(xiàn)于牧場草地和土壤中[20],鞘氨醇單胞菌屬、慢生根瘤菌屬也是土壤根際菌。因此，不同冷藏牦牛乳樣品中羅河桿菌屬，慢生根瘤菌屬、考古氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、巨型球菌屬以及金黃桿菌屬、鏈球菌屬、不動桿菌屬等可能源自環(huán)境、乳頭表面等[21]。冷藏牦牛乳中未發(fā)現(xiàn)與乳制品緊密相關(guān)的耐熱性致病菌梭菌[22]和芽孢桿菌屬等[23]。

2.5 牦牛乳理化性質(zhì)分析

乳的理化性質(zhì)對乳制品加工和品質(zhì)具有重要影響，其理化性質(zhì)結(jié)果見表3。

表3 不同冷藏時間牦牛乳的理化性質(zhì)Table 3 The physicochemical property of yak milk under different refrigerated storage period

從表3 可知，牦牛乳S2 樣品中酪蛋白含量比S1顯著低4.43%（p＜0.05），S2 樣品中脂肪含量比S1 顯著低了67.51%（p＜0.05）。申倩等[24]也發(fā)現(xiàn)生鮮牛乳4℃貯藏3 d 后乳脂率顯著降低。牦牛乳S2 樣品中酸度高于S1。Mankai 等[25]發(fā)現(xiàn)牛乳在4 ℃下貯藏時間從24 h 延長到96 h 時，乳的酸度呈現(xiàn)增加趨勢。

原料乳理化性質(zhì)的改變與其微生物活動、內(nèi)源性酶活性等有關(guān)。嗜冷菌所分泌的蛋白酶對酪蛋白具有降解作用[26]，金黃桿菌屬、假單胞菌屬和不動桿菌屬等具有脂肪分解能力[27]。本試驗發(fā)現(xiàn)，與冷藏24 h 牦牛乳相比，冷藏72 h 牦牛乳中乳球菌屬、棲水菌屬、金黃桿菌屬和明串珠菌屬相對豐度呈現(xiàn)增長趨勢。另外，降解β-酪蛋白的內(nèi)源性纖維溶酶在低溫下具有較強(qiáng)活性[28]，因此，冷藏時間延長72 h 后，牦牛乳中酪蛋白和脂肪含量降低。但是，冷藏72 h 牦牛乳的理化指標(biāo)仍然高于國家標(biāo)準(zhǔn)中對生乳的要求，酸度也未超過18 °T[29]，因此，冷藏72 h 牦牛乳品質(zhì)有保障。

2.6 牦牛乳中微生物菌屬之間以及與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

不同冷藏時間牦牛乳中相對豐度為1%的微生物菌屬之間以及與理化指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析，其結(jié)果見表4、5。

表4 牦牛乳中細(xì)菌菌屬之間的Pearson 相關(guān)性分析Table 4 Pearson correlation coefficients of relative abundance of bacteria in yak milk

從表4 可知，金黃桿菌屬除與棲水菌屬具有較強(qiáng)正相關(guān)性之外，與其它菌屬之間存在負(fù)相關(guān)性。乳球菌屬與明串珠菌屬存在較弱正相關(guān)性，與不動桿菌屬、鏈球菌屬、棲水菌屬存在負(fù)相關(guān)性。鏈球菌屬與棲水菌屬、金黃桿菌屬和乳球菌屬之間也存在負(fù)相關(guān)性，而與不動桿菌屬存在較強(qiáng)正相關(guān)性（p＜0.05）。

從表5 可知，乳球菌屬與原料酸度、乳糖含量呈現(xiàn)正相關(guān)性，與脂肪含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。原料乳中酸度與鏈球菌屬呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)性（p＜0.01），與不動桿菌屬也存在負(fù)相關(guān)性，與金黃桿菌屬呈現(xiàn)較弱正相關(guān)性，與明串珠菌屬呈現(xiàn)較強(qiáng)正相關(guān)性。以上相關(guān)性分析表明由于代謝產(chǎn)物或者環(huán)境的改變導(dǎo)致不同微生物生長繁殖之間可能存在協(xié)同或者拮抗作用。

表5 牦牛乳中細(xì)菌相對豐度與其理化指標(biāo)的Pearson 相關(guān)性分析Table 5 Pearson correlation coefficients of relative abundance of bacterial and physicochemical indices in yak milk

原料乳中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)有利于微生物的生長繁殖，但是由于微生物自身代謝產(chǎn)物以及原料乳理化性質(zhì)的改變，使得對微生物的生長繁殖產(chǎn)生不同影響。乳酸菌具有產(chǎn)細(xì)菌素的能力，它產(chǎn)生的細(xì)菌素對其它微生物具有抑制作用，已有不同學(xué)者從原料奶[30]、新疆巴音布魯克牧區(qū)鮮乳和酸奶疙瘩[31]中篩選出具有抗乳房炎致病菌、金黃色葡萄球菌等的乳酸乳球菌。Hanu 等[32]發(fā)現(xiàn)由嗜冷菌作用所產(chǎn)生的脂肪酸具有較強(qiáng)抑菌作用，而游離脂肪酸的增加對乳酸菌生長具有抑制作用[33,34]。乳酸菌耐酸能力較強(qiáng)，能夠忍耐酸度較強(qiáng)的環(huán)境。因此，原料乳在冷藏過程中，微生物相互之間，微生物與原料乳理化性質(zhì)之間相互影響，最終導(dǎo)致原料乳品質(zhì)的改變。

3 結(jié)論

冷藏24、72 h 牦牛乳中厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門占到微生物相對豐度的99%以上。冷藏24、72 h 牦牛乳中第一、二優(yōu)勢菌屬為乳球菌屬、金黃桿菌屬，分別占到冷藏24、72 h 牦牛乳中細(xì)菌相對豐度的59.48%和67.51%。冷藏72 h 牦牛乳中乳球菌屬、金黃桿菌屬相對豐度比冷藏24 h 牦牛乳高出22.74%、3.56%，但是冷藏72 h 牦牛乳中鏈球菌、不動桿菌屬呈現(xiàn)降低趨勢。冷藏24、72 h 牦牛乳中假單胞菌屬相對豐度較低，分別為1.69%和1.78%。冷藏72 h 牦牛乳中酪蛋白、脂肪含量低于冷藏24 h 牦牛乳，酸度增加到14.66 °T。72 h 的低溫冷藏有助于控制牦牛乳細(xì)菌繁殖，維持乳品質(zhì)。該研究為牦牛乳貯藏，干酪等乳制品加工，確保其品質(zhì)和質(zhì)量安全提供了理論依據(jù)。