郭鐵城，曾海濤，徐 皓，唐 琪，趙冠杰，崔卓越，茍玉琴

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/秦巴山區(qū)生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)/陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000)

近年來，隨著食品工業(yè)的發(fā)展，色素類物質(zhì)的運(yùn)用在食品的生產(chǎn)過程中越來越廣泛，但是許多合成類色素在安全性上還存在著諸多隱患，部分合成類色素具有毒害作用，更有甚者還具有致癌作用。因此，越來越多的合成類色素在食品工業(yè)上被禁止使用[1]，而天然色素逐漸受到人們的青睞。

花青苷作為一種天然無毒色素，因其具有溶于水、無毒、廣泛的顏色以及可抗炎、抗菌、抗腫瘤、增強(qiáng)心臟健康、預(yù)防高血壓、預(yù)防神經(jīng)退行性疾病、增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)和恢復(fù)能力等保健功效[2-6]，具有廣闊的市場前景和巨大的開發(fā)價(jià)值，開始受到越來越多科研人員的關(guān)注。但是花青苷又存在一定的缺點(diǎn)，即穩(wěn)定性較差，現(xiàn)在有一些方法可以解決這個(gè)問題：殼聚糖封裝以增加穩(wěn)定性、將其包裹在脂質(zhì)體中或用超臨界CO2作為溶劑[7-8]。目前，對于花青苷的應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛，胡蘿卜中的花青苷已經(jīng)作為一種優(yōu)良穩(wěn)定的著色劑，用于食品、飲料和工業(yè)著色，甜菜中的花青苷也作為一種安全、天然、食用色素來代替舊的合成色素[9-10]。

花青苷是植物中廣泛存在的一類水溶性的天然色素和次生物質(zhì)，其主要存在于植物的花、果實(shí)、葉片、莖、根當(dāng)中，花青苷的含量、種類和分布是植物這些器官的色彩形成的重要原因，花青苷對植物的生長、發(fā)育、繁殖、種子傳播起到至關(guān)重要的作用，可以幫助植物進(jìn)行授粉[11]、傳播種子、保護(hù)植物免收紫外輻射的傷害和抗氧化[12]、活性氧(ROS)誘導(dǎo)的信號級聯(lián)介質(zhì)[13]、金屬和準(zhǔn)金屬螯合劑[14]、葉片衰老的延遲層(特別是在營養(yǎng)缺乏的植物中)[15]。

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)，茄科枸杞屬，多年生雙子葉多棘刺灌木，分布于我國青海東部、新疆北部、內(nèi)蒙古西部、陜西北部、甘肅和西藏等地。黑果枸杞果實(shí)味甜多汁、營養(yǎng)豐富，被譽(yù)為荒漠中的“軟黃金”和“黑珍珠”，花青苷含量豐富、極具研究和開發(fā)價(jià)值[1,16]。已有研究證明，花青苷的合成植物生長的環(huán)境條件比如光照強(qiáng)度、光周期、光質(zhì)、培養(yǎng)基的蔗糖濃度、pH、激素的濃度及溫度有關(guān)。本研究以黑果枸杞和‘寧杞7號’紅枸杞為材料，研究了光照和滲透脅迫處理對枸杞離體葉片花青苷積累的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同蔗糖濃度和單色光處理可顯著影響枸杞離體葉片中花青苷積累，且不同枸杞材料誘導(dǎo)花青苷積累的最適蔗糖濃度及最適單色光差異顯著。本研究結(jié)果為后續(xù)以枸杞葉片愈傷組織或懸浮細(xì)胞作為生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)花青苷提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘寧杞7號’紅枸杞和黑果枸杞無菌苗葉片，(‘寧杞7號’紅枸杞和黑果枸杞種子取自寧夏農(nóng)林科學(xué)院)

1.2 方法

1.2.1 枸杞種子消毒 分別取適量的‘寧杞7號’紅枸杞和黑果枸杞種子于50 mL離心管中，于超凈臺(tái)中加入無菌水15 mL，反復(fù)震蕩搖晃3 min，倒掉無菌水；加入75%乙醇15 mL震蕩30 s，倒掉酒精；用無菌水洗2遍后加入20 mL 10%的NaClO，震蕩10～15 min；最后再用無菌水洗3次。

1.2.2 枸杞幼苗的獲取 配置1 L MS培養(yǎng)基(MS粉末4.74 g、蔗糖20 g、瓊脂粉7 g)于20個(gè)培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶50 mL培養(yǎng)基，并用封口膜封住，高壓蒸汽滅菌121 ℃、15 min；在超凈臺(tái)中將適量消毒后的枸杞種子均勻分布于MS固體培養(yǎng)基上；光照/黑暗為16 h/8 h、15 000 lx、溫度 25 ℃，培養(yǎng)25 d。

1.2.3 枸杞葉片離體培養(yǎng) 配制含不同濃度蔗糖溶液：0、50、100、150、200、300、400、500、600 mmol/L的MS培養(yǎng)基(含MS粉末 4.74 g、NaCl 10 g、瓊脂7 g，去離子水1 000 mL)各500 mL，加入NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，高壓蒸汽滅菌121 ℃、15 min。待其溫度冷卻到60 ℃左右時(shí)，倒入直徑9 cm玻璃培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入20 mL。在培養(yǎng)皿中無菌水浸濕的3層濾紙上，將萌發(fā)25 d的枸杞無菌苗葉片切割成1 cm長度的葉段，放至上述固體培養(yǎng)基上。單波長光照(藍(lán)光:450 nm、5 000 lx；紅光:650 nm、5 000 lx；遠(yuǎn)紅光:730 nm、50 W)，16 h光照/8 h黑暗、25 ℃培養(yǎng)7 d。

1.2.4 花青苷含量的測定 將誘導(dǎo)處理后的枸杞葉片取出，在液氮充分研磨成粉末，裝入2 mL離心管中，并稱量質(zhì)量；在每個(gè)離心管中加入300 μL 1%鹽酸(甲醇稀釋)，3 000 r/min離心3 min將粉末甩到管底溶液中，然后放入搖床中100 r/min、4 ℃黑暗條件下震蕩過夜；將離心管于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取0.25 mL上清至新管中，加入250 μL無菌水，混勻；加入500 μL氯仿，混勻，然后于4 ℃、12 000 r/min離心5 min；吸取350 μL上清至新管中，加入650 μL的1%鹽酸(甲醇稀釋)，用分光光度計(jì)測定A530和A657(A530和A657均代表吸光度)，測量3次，取平均值，計(jì)算每克鮮重葉片中花青苷含量。

每克鮮質(zhì)量葉片中花青苷含量(units·g-1)=(A530-0.25×A657)/葉片重量

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 測量得到的結(jié)果通過公式計(jì)算得到不同蔗糖濃度和光照處理下‘寧杞7號’紅枸杞和黑果枸杞離體葉片花青苷的含量，采用獨(dú)立樣方T檢驗(yàn)方法分析比較蔗糖濃度和光照對‘寧杞7號’紅枸杞和黑果枸杞離體葉片花青苷的含量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞無菌苗培養(yǎng)

將消毒后的2種枸杞種子，點(diǎn)種到MS固體培養(yǎng)基上，萌發(fā)25 d后的幼苗形態(tài)差異顯著：黑果枸杞葉片條狀披針形、微彎曲，而‘寧杞7號’紅枸杞葉片較寬、長橢圓狀披針形、頂端漸尖(圖1)。

圖1 枸杞無菌苗Fig.1 Sterile seedlings of wolfberry

2.2 不同光照和滲透脅迫對枸杞離體葉片中花青苷積累的影響

2.2.1 白光下不同蔗糖濃度對枸杞離體葉片中花青苷積累的影響 白光(15 000 lx)處理下，‘寧杞7號’紅枸杞和黑果枸杞葉片中花青苷積累均隨著蔗糖濃度的升高而逐漸增加，但在600 mmol/L時(shí)下降(圖2)。其中，蔗糖濃度為0 mmol/L時(shí)，紅枸杞葉片中花青苷的積累顯著低于黑果枸杞，且差異極顯著(P<0.01)，但花青苷含量均相對較低；蔗糖濃度500 mmol/L時(shí)，誘導(dǎo)花青苷積累達(dá)到最高，‘寧杞7號’紅枸杞和黑果枸杞葉片花青苷含量分別為2.33 units/g和3.10 units/g，二者差異顯著(P<0.05)；蔗糖濃度600 mmol/L時(shí)，2種葉片均失水嚴(yán)重、且逐漸萎蔫，‘寧杞7號’紅枸杞和黑果枸杞葉片花青苷含量分別下降到0.96 units/g和0.85 units/g。

圖2 白光下不同蔗糖濃度誘導(dǎo)的花青苷積累Fig.2 Anthocyanin accumulation induced by different sucrose concentrations under white light

上述結(jié)果表明，‘寧杞7號’紅枸杞葉片中本底花青苷含量顯著低于黑果枸杞葉片；隨著蔗糖濃度的升高，逐漸提高的滲透脅迫可顯著促進(jìn)枸杞離體葉片中的花青苷積累；過高濃度的蔗糖會(huì)導(dǎo)致葉片嚴(yán)重失水，逐漸萎蔫甚至死亡，此時(shí)花青苷含量下降。

2.2.2 藍(lán)光下不同蔗糖濃度對枸杞離體葉片中花青苷積累的影響 藍(lán)光(450 nm)處理下，‘寧杞7號’紅枸杞和黑果枸杞葉片中花青苷積累均隨著蔗糖濃度升高而逐漸增加，但在600 mmol/L時(shí)下降(圖3)。其中，蔗糖濃度為0 mmol/L時(shí)，紅枸杞葉片中花青苷的積累顯著低于黑果枸杞，且差異極顯著(P<0.01)，但花青苷含量均相對較低；蔗糖濃度500 mmol/L時(shí)，黑果枸杞葉片花青苷積累量達(dá)到最高：9.49 units/g；‘寧杞7號’紅枸杞葉片中，當(dāng)蔗糖濃度400 mm時(shí)花青苷誘導(dǎo)量達(dá)到最高3.28 units/g，但僅為黑果枸杞葉片中花青苷積累最高值的34.9%，差異極顯著(P<0.01)。

圖3 藍(lán)光下不同蔗糖濃度誘導(dǎo)的花青苷積累Fig.3 Anthocyanin accumulation induced by different sucrose concentrations under blue light

2.2.3 紅光下不同蔗糖濃度對枸杞離體葉片中花青苷積累的影響 紅光(650 nm)處理下，‘寧杞7號’紅枸杞和黑果枸杞葉片中花青苷積累均隨著蔗糖濃度的升高而逐漸增加，但在600 mmol/L時(shí)下降(圖4)。其中，蔗糖濃度為0 mmol/L時(shí)，紅枸杞葉片中花青苷的積累顯著低于黑果枸杞，且差異極顯著(P<0.01)，但花青苷含量均相對較低；‘寧杞7號’紅枸杞葉片中，蔗糖濃度500 mmol/L時(shí)葉片花青苷誘導(dǎo)積累最高，達(dá)到9.77 units/g；黑果枸杞葉片中，當(dāng)蔗糖濃度400 mm時(shí)花青苷誘導(dǎo)量達(dá)到最高3.56 units/g，為 ‘寧杞7號’紅枸杞葉片中花青苷積累最高值的36.4%，差異極顯著(P<0.01)。

圖4 紅光下不同蔗糖濃度誘導(dǎo)的花青苷積累Fig.4 Anthocyanin accumulation induced by different sucrose concentrations under red light

2.2.4 遠(yuǎn)紅光下不同蔗糖濃度對枸杞離體葉片中花青苷積累的影響 730 nm遠(yuǎn)紅光處理下，‘寧杞7號’紅枸杞和黑果枸杞葉片中花青苷積累均隨著蔗糖濃度的升高而逐漸增加，但在600 mmol/L時(shí)下降(圖5)。其中，蔗糖濃度為0 mmol/L時(shí)，紅枸杞葉片中花青苷的積累顯著低于黑果枸杞，且差異極顯著(P<0.01)，但花青苷含量均相對較低；‘寧杞7號’紅枸杞葉片中，蔗糖濃度400 mmol/L時(shí)葉片花青苷誘導(dǎo)積累達(dá)到最高2.36 units/g；黑果枸杞葉片中，當(dāng)蔗糖濃度500 mmol/L時(shí)花青苷誘導(dǎo)量達(dá)到最高0.79 units/g，為 ‘寧杞7號’紅枸杞葉片花青苷積累量的33.5%，差異極顯著(P<0.01)。

圖5 遠(yuǎn)紅光下不同蔗糖濃度誘導(dǎo)的花青苷積累Fig.5 Anthocyanin accumulation induced by different sucrose concentrations under far-red light

2.2.5 不同單色光對枸杞離體葉片中花青苷積累的影響 如上所述，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到400～500 mmol/L時(shí)，黑果枸杞和‘寧杞7號’紅枸杞葉片花青苷積累會(huì)達(dá)到最大值，此時(shí)的蔗糖濃度是誘導(dǎo)枸杞離體葉片花青苷積累的最適蔗糖濃度。但是，不同的光照條件對花青苷積累的影響差異顯著(圖6)，其中，較長波長的紅光和遠(yuǎn)紅光處理下，當(dāng)蔗糖濃度500 mmol/L時(shí)，‘寧杞7號’紅枸杞葉片中花青苷積累顯著高于黑果枸杞葉片中的積累(P<0.01)；而較短波長的藍(lán)光處理下則與之相反，當(dāng)蔗糖濃度500 mmol/L時(shí)，黑果枸杞離體葉片中的花青苷含量顯著高于‘寧杞7號’紅枸杞葉片中的積累(P<0.01)。

圖6 不同單色光下紅枸杞和黑果枸杞葉片花青苷積累Fig.6 Anthocyanin accumulation of L.barbarum and L.ruthenicum under different monochromatic light

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同滲透脅迫條件及單色光處理可顯著影響枸杞離體葉片中花青苷積累。結(jié)果顯示：1)蔗糖濃度為0 mmol/L時(shí)，不同光照處理下，紅枸杞葉片中花青苷的積累顯著低于黑果枸杞，且差異極顯著(P<0.01)，但花青苷含量均相對較低；2)隨著蔗糖濃度提高，‘寧杞7號’紅枸杞與黑果枸杞離體葉片中花青苷積累均顯著提高，蔗糖濃度達(dá)400～500mmol/L時(shí)2種枸杞離體葉片中花青苷的積累均達(dá)到最大值；3)蔗糖濃度相同時(shí)，不同波長光照(白光、遠(yuǎn)紅光、紅光、藍(lán)光)處理下，枸杞離體葉片中花青苷積累差異顯著；4)450 nm藍(lán)光下，黑果枸杞離體葉片中花青苷積累量顯著高于‘寧杞7號’紅枸杞離體葉片中花青苷積累；5)650 nm紅光處理，與藍(lán)光下趨勢相反，‘寧杞7號’紅枸杞離體葉片中花青苷積累量顯著高于黑果枸杞離體葉片中花青苷積累；6)730 nm遠(yuǎn)紅光處理，與紅光下趨勢一致，但‘寧杞7號’紅枸杞與黑果枸杞離體葉片中花青苷積累均顯著低于其他光質(zhì)條件下的花青苷積累。

3.2 討論

花青苷類化合物種類繁多，具有良好的抗氧化活性和保健功效，具有廣闊的應(yīng)用前景，因其容易分解，在市場上的價(jià)格較高，從而制約了花青苷作為藥物和保健品的研究與應(yīng)用。本研究結(jié)果將為確定誘導(dǎo)枸杞葉片中花青苷積累的最佳條件，通過愈傷組織或懸浮細(xì)胞作為生物反應(yīng)器大規(guī)模低成本生產(chǎn)高品質(zhì)花青苷奠定良好基礎(chǔ)。

糖在植物新陳代謝和能量產(chǎn)生中起著非常重要的作用，此外糖也作為一種廣泛的信號分子，來調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)、影響植物生命周期中許多重要過程。已有研究發(fā)現(xiàn)，植物中花青苷積累受到糖的誘導(dǎo)，但不同糖類物質(zhì)對不同物種花青苷積累的影響不同。蔗糖是可誘導(dǎo)植物體內(nèi)花青苷積累的主要糖類物質(zhì)，能快速強(qiáng)烈地誘導(dǎo)花青苷積累，且具有濃度依賴性[17]。模式植物擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖可以作為信號分子，通過調(diào)節(jié)DFR、F3’H、CHS、MYB75、PAP1等基因的表達(dá)誘導(dǎo)花青苷積累[18-19]。此外，高濃度蔗糖還可以作為一種滲透脅迫，誘導(dǎo)花青苷的合成[20]。本研究結(jié)果顯示，蔗糖可以誘導(dǎo)枸杞離體葉片中花青苷積累且具有濃度依賴性，高濃度蔗糖可對枸杞離體葉片產(chǎn)生滲透脅迫，從而誘導(dǎo)花青苷積累。這與Pasqua等[21]在喜樹懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)高濃度蔗糖可通過形成滲透脅迫誘導(dǎo)花青苷積累的結(jié)論一致。

光照也是影響花青苷積累的重要因子，光質(zhì)、光強(qiáng)和光周期均能在一定程度上影響花青苷的積累[22]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與枸杞同屬茄科植物的番茄中，光敏色素PHYA、PHYB及藍(lán)光受體CRY1A都可調(diào)節(jié)花青苷積累[23-25]。Lopez等[26]研究發(fā)現(xiàn)不同波長光照下西洋梨中花青苷積累差異顯著的趨勢相一致。據(jù)研究，生長在不同光照環(huán)境中植物的花色、葉色和果色通常不同，如藍(lán)色花大多分布于高山地區(qū)，而平原地帶藍(lán)紫色花卻相對較少，可能與高山地區(qū)光照中短波長的紫外線比例較高有關(guān)[27]。本研究結(jié)果表明，不同波長單色光對枸杞離體葉片花青苷積累的影響存在顯著差異，其中波長較短的藍(lán)色光照下黑果枸杞離體葉片中花青苷積累較高，而波長較長的紅色光處理下‘寧杞7號’紅枸杞離體葉片中花青苷積累較高?？赡苁且?yàn)楹诠坭椒植加诤０蜗鄬^高地區(qū)，對短波長光照反應(yīng)敏感，而紅枸杞經(jīng)過在海拔相對較低地區(qū)的長期馴化和人工選擇，更適宜相對較長波長的光照，這與上述文獻(xiàn)結(jié)論相一致。

枸杞基因組測序的完成[28]，將對枸杞重要性狀的分子機(jī)理研究及通過現(xiàn)代分子生物學(xué)等手段培育枸杞新品種起到非常重要的推動(dòng)作用。目前，本研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)通過基因組中同源序列分析，比對到枸杞基因組中相應(yīng)的光受體以及花青苷代謝途徑關(guān)鍵基因序列，本研究的研究結(jié)果為下一步通過qPCR檢測花青苷積累關(guān)鍵基因及相應(yīng)光受體基因表達(dá)，研究不同光照和滲透脅迫條件下紅枸杞和黑果枸杞中花青苷積累差異的分子機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)。