過雪瑩 朱凱琳 陳 昕 付雪晴 唐東芹*

（1. 上海交通大學設計學院，上海 200240；2. 南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院，南京 210037）

香雪蘭（）又名小蒼蘭、香鳶尾、洋晚香玉等，屬鳶尾科（Iridaceae）香雪蘭屬（）多年生球根花卉，花姿典雅、花色豐富、香氣怡人，深受人們喜愛，是一種重要的切花及盆栽觀賞植物。目前，現(xiàn)代應用的香雪蘭絕大數(shù)為雜交品種，通常以指代該屬內(nèi)園藝雜交品種，由于育種時間長，遺傳背景復雜，在新品種引進和選育工作上具有一定盲目性，因此，開展香雪蘭品種間的親緣關系及進化程度研究具有重要意義。核型是生物遺傳物質(zhì)在細胞水平上的表征，與外部形態(tài)相比，受外界環(huán)境因素影響較小，更能保持相對穩(wěn)定；同時，基于核型參數(shù)的聚類分析可以與已有的系統(tǒng)解剖學和分子標記結(jié)果所建立的分類進行相互印證。因此，核型分析已成為基于細胞學研究遺傳多樣性的重要方法，研究表明它可以為觀賞植物品種間親緣關系的鑒定提供一定的參考價值，并為品種選育和雜交育種等提供理論依據(jù)。

目前利用核型分析方法來鑒定染色體組學信息在許多觀賞花卉中已有運用，如在金盞菊（）、迷迭香（）、芍藥（）、風信子（）、春 蘭（）和惠蘭（）等物種上已有相關核型研究。而關于香雪蘭屬內(nèi)種的核型研究早期也有一些報道。最早的文獻見于1926 年的的染色體組數(shù)。在1971 年，Goldblatt 等學者對屬內(nèi)11 個野生種中的4 種、、和cf.進行了染色體數(shù)目的鑒定。這時期內(nèi)，Lawrence 又報道出關于幾種的染色體組數(shù)。隨后，在1988 年，王麗等才首次報道了的具體核型情況，發(fā)現(xiàn)這個種有6 對亞中著絲粒染色體、4 對中著絲粒染色體和1 對端著絲粒染色體（參考附表1）。

附表1 早期香雪球?qū)僦参锏娜旧w及核型資料Supplementary table 1 Chromosome and karyotype data of early taxa of the genus Freesia

由于觀賞植物種間雜交頻繁、品種更新很快，經(jīng)常導致不同栽培品種間的親緣關系難以鑒定，故運用包括核型分析在內(nèi)的多種方法來分析品種之間的核型差異及親緣關系的方法已較為常見，發(fā)現(xiàn)核型差異與植物品種間親緣關系確實存在一定關聯(lián)。如對秋英屬中波斯菊（）的7 個品種和硫華菊（）的2 個品種進行了核型比較及親緣關系的分析鑒定，還有學者對6 個金銀花（）栽培品種進行了核型分析比較。通過對17個品種繡線菊（）的染色體特征進行相關性和聚類分析，劉慧民等探討了其品種進化及親緣關系。而關于香雪蘭品種間親緣關系的報道前期主要集中在表觀形態(tài)、生理生化和分子3個層面。如從葉、花、花粉、球莖等部位的形態(tài)特征探討了部分香 雪蘭品 種間的 親緣關 系。Wongchao?chant 等和陳詩林等則利用花芽分化、休眠相關的生理指標及球莖中的可溶性蛋白質(zhì)對香雪蘭品種之間的親緣關系進行了探討。此外，還有文獻利用ISSR、EST-SSR和RAPD等分子標記技術(shù)研究了香雪蘭品種間的親緣關系。但是，迄今為止，利用染色體核型分析方法來研究香雪蘭不同品種間的核型差異及親緣關系的研究鮮見報道。

本研究以香雪蘭的6 個栽培品種為試驗材料，通過染色體核型分析方法，明確各品種間的核型特征，進而利用其核型參數(shù)進行聚類分析，以探索品種間的核型差異及進化程度，旨在為今后香雪蘭品種的鑒定、起源、演化、良種培育及進一步的分子生物學研究等提供必要的細胞遺傳學資料，為豐富香雪蘭遺傳多樣性等提供細胞學基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

以6 個香雪蘭栽培品種為研究對象（見表1，圖1）。其中，‘上農(nóng)紅臺閣’（下文圖表中由‘SN Hongtaige’表示）為上海交通大學自主培育品種，其余5 個品種均為國外進口品種，購自荷蘭Van den bos 公 司（https：//www.Vandenbos. com），于2018—2020年取樣測定。

圖1 供試香雪蘭6個品種A‘.Gold River’；B‘.White River’；C‘.Castor’；D‘.上農(nóng)紅臺閣’；E‘.Pink Passion’；F‘.Red River’；下同F(xiàn)ig.1 Materials of 6 cultivarsA‘.Gold River’；B‘.White River’；C‘.Castor’；D‘.SN Hongtaige’；E‘.Pink Passion’；F‘.Red River’；The same as below

表1 香雪蘭6個栽培品種的基本信息Table 1 Basic information of 6 cultivars of F.hybrida

1.2試驗方法

選擇生長健壯的香雪蘭植株進行水培，于08：00—10：00 用鑷子和解剖針取下根尖做材料，將其用蒸餾水沖洗干凈，置于0.05%秋水仙素和0.002 mol·L8-羥基喹啉1∶1 混合液中，在4 ℃環(huán)境下避光處理1～2 h。再轉(zhuǎn)入到卡諾固定液（（無水乙醇）∶（乙酸）=3∶1）中，于室溫下固定12 h。再將固定好的根尖材料用蒸餾水洗凈，放入1 mol·L的HCl（60 ℃水?。┙怆x8～10 min。待解離后的根尖材料充分沖洗后，取約1 mm 的根尖分生組織，放入卡寶品紅溶液中染色6 min。利用常規(guī)方法壓片，鏡檢，觀察到分散良好的中期染色體后，顯微拍照采集圖像。

1.3倍性鑒定與核型分析方法

參考李懋學等提出的標準，選取30 個以上染色體分散較好的中期細胞統(tǒng)計染色體數(shù)目。其中選取5個分散良好，染色體縱向收縮程度均勻一致，縊痕區(qū)顯示清晰的染色體中期照片進行核型分析。參考Levan 等和Kuo 等方法分別計算相對長度、相對長度系數(shù)等相關核型參數(shù)；參考Arano的方法計算核型不對稱系數(shù)；參照Steb?bins的標準進行核型分類；對核型的主要參數(shù)進行綜合分析，得出核型公式。

計算公式如下：

1.4數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計方法

使用Auto CAD 2015 軟件測量染色體長度，運用Excel 2010 和Adobe Photoshop CS4 軟件處理數(shù)據(jù)，進行同源染色體配對并制作核型模式圖。利用SPSS 11 軟件，選用平均臂比為橫坐標，染色體長度比為縱坐標，建立核型不對稱散點圖；同時對香雪蘭品種的各染色體核型參數(shù)進行標準化轉(zhuǎn)化，采用平方歐氏距離，利用組間連接法進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1香雪蘭核型參數(shù)分析

分別觀測香雪蘭6個品種的中期分裂細胞，發(fā)現(xiàn)它們由11對染色體構(gòu)成，屬于四倍體植物，其染色體分裂相和核型模式圖結(jié)果如圖2～3 所示。并對各品種的核型參數(shù)進行統(tǒng)計（見表2～3）。

表2 香雪蘭6個品種的染色體組型Table 2 The karyotype analysis of six cultivars of F.hybrida

圖2 香雪蘭6個品種的中期分裂相Fig.2 Photomicrographs of chromosome at metaphase in six cultivars of F.hybrida

結(jié)果表明，‘Gold River’染色體核型公式為2n=4x=44=33m+11sm，無隨體出現(xiàn)。染色體的相對長度系數(shù)組成為2n=6L+18M1+15M2+5S，相對長度為6.15%～12.98%。臂比值為1.07～1.94，平均臂比值為1.47。其染色體的長度比為2.62；臂比值大于2 的染色體占總?cè)旧w的6.82%。核不對稱系數(shù)為59.07%，核型為2B型（見圖2A）。

‘White River’染色體核型公式為2n=4x=44=1M+34m+9sm，具有1 個中部著絲點類型。染色體的相對長度系數(shù)組成2n=6L+15M1+14M2+9S，相對長度為6.13%～12.09%。臂比值為1.12～1.84，平均臂比值為1.46。其染色體的長度比為2.21；臂比值大于2 的染色體占總?cè)旧w的2.27%，核不對稱系數(shù)為59.30%，核型為2B型（見圖2B）。

‘Castor’染色體核型公式為2n=4x=44=35m+9sm，染色體的相對長度系數(shù)組成為2n=4L+23M1+14M2+3S，相對長度為6.24%～13.42%。臂比值為1.15～2.25，平均臂比值為1.52。染色體的長度比為2.60；臂比值大于2 的染色體占總?cè)旧w的6.82%，核不對稱系數(shù)為60.05%，核型為2B 型見圖2C）。

‘上農(nóng)紅臺閣’染色體核型公式為2n=4x=44=32m+12sm，染色體的相對長度系數(shù)組成為2n=8L+19M1+12M2+5S，相對長度為6.45%～13.16%。臂比值為1.11～2.03，平均臂比值為1.52。該品種染色體的長度比為2.54；臂比值大于2的染色體占總?cè)旧w的9.09%。核不對稱系數(shù)為60.07%，核型為2B型（見圖2D）。

‘Pink Passion’染色體核型公式為為2n=4x=44=38m+6sm，染色體的相對長度系數(shù)組成為2n=5L+23M1+13M2+3S，相對長度為6.81%～13.64%。臂比值為1.09～1.58，平均臂比值為1.35。其染色體的長度比為2.71；臂比值大于2的染色體占總?cè)旧w的2.27%。核不對稱系數(shù)為57.00%，核型為2B型（見圖2E）。

‘Red River’染色體核型公式為：2n=4x=44=37m+7sm，無隨體出現(xiàn)。染色體的相對長度系數(shù)組成為2n=6L+16M1+16M2+6S ，相對長度為6.65%～12.81%。臂比值為1.10～1.79，平均臂比值為1.42。該品種染色體的長度比為2.84；臂比值大于2 的染色體占總?cè)旧w的4.55%。核不對稱系數(shù)為58.22%，核型為2B型（見圖2F）。

圖3 香雪蘭6個品種的核型模式圖Fig.3 Photomicrographs of karyotype pattern in 6 cultivars of F.hybrida

可見，6 個香雪蘭品種均為四倍體，染色體數(shù)目都為44。只有‘White River’中具有M、m、sm 3種著絲點類型，而其他品種均只有m、sm 2 種著絲點類型，且6 個品種中均未觀測到隨體出現(xiàn)，核型類型均為“2B”型。其中，‘Castor’在相對長度范圍和臂比范圍上均為最廣，‘上農(nóng)紅臺閣’核不對稱系數(shù)最大。

2.2香雪蘭品種核型參數(shù)散點圖分析

核型不對稱散點圖中，坐標點接近右上方表示核型不對稱性強，進化程度高。反之，坐標點越靠近左下角代表其不對稱性越低，種的進化程度相對也越低。從圖4 整體結(jié)果來看，6 個香雪蘭品種的不對稱性程度均較大?！瓹astor’、‘上農(nóng)紅臺閣’均最靠近圖右方，故兩者相對其他品種而言，不對稱性最大且進化程度相當?！甊ed River’和‘Pink Passion’最靠近圖左方，故相對而言，兩者進化程度較低，但‘Red River’相比‘Pink Passion’而言，進化程度較大。在這6個品種中，‘Red River’和‘Pink Passion’在染色體長度比方面進化較快，而‘White River’在平均臂比方面進化較快，‘Gold Riv?er’在兩方面進化方向相對均衡。結(jié)合表3中的核不對稱系數(shù)，可得：6種香雪蘭植物的進化程度由低到高為：‘Pink Passion’→‘Red River’→‘Gold River’→‘White River’→‘Castor’→‘上農(nóng)紅臺閣’。

表3 香雪蘭6個品種的核型公式及核型參數(shù)Table 3 Karyotype formulas and parameters of 6 cultivars of F.hybrida

圖4 6個香雪蘭品種的核型不對稱性散布圖Fig.4 Scatter diagram of 6 cultivars of F. hybrida based on the degree of karyotypic asymmetry

2.3香雪蘭植物品種核型參數(shù)聚類分析

Inceer 等提出以核型數(shù)據(jù)為基礎的聚類分析能更好地考察物種間的親緣關系?；谏鲜龊诵蛥?shù)，本研究進行聚類分析（見圖5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，香雪蘭品種間的遺傳距離變化范圍大，為1.2～25.0，具有較為豐富的遺傳多樣性。其中，‘Pink Passion’和‘Red River’、‘Gold River’和‘上農(nóng)紅臺閣’兩兩之間的遺傳距離最小，都為1.2，說明‘Pink Passion’和‘Red River’、‘Castor’和‘上農(nóng)紅臺閣’之間核型相似程度較高，親緣關系最近。在遺傳距離為15.0 時，可將6 個品種明顯分為2 類，第一類包括‘Gold River’、‘上農(nóng)紅臺閣’和‘Cas?tor’，這3 個品種的染色體長度比較為接近，其核型不對稱系數(shù)、臂比均值均較大且近似；第二類包括‘Pink Passion’、‘Red River’和‘White River’，這3個品種的核不對稱系數(shù)均較小且近似，各染色體著絲點類型的數(shù)量差別不大，相對長度范圍及臂比范圍也均相對較小。

圖5 6個香雪蘭品種的核型聚類圖Fig.5 Karyotype clustering figure of 6 cultivars of F.hybrida

3 討論

核型是了解植物系統(tǒng)發(fā)育和進化的一個重要參數(shù)，可以為植物分類與鑒定提供可靠的細胞學依據(jù)。據(jù)Goldblatt 報道，1945 年Lawrence 發(fā)現(xiàn)香雪蘭屬內(nèi)染色體數(shù)目為2n=2x=22、2n=3x=33、2n=4x=44。香雪蘭染色體基數(shù)均為11 這一結(jié)果獲得了后面研究者的證實。本研究發(fā)現(xiàn)，香雪蘭6 個品種染色體數(shù)目均為2n=4x=44，基數(shù)為11，故均為四倍體，與上述研究結(jié)果相一致。

研究表明，染色體能很好地反映物種在遺傳上的差異和親緣關系。核型分析結(jié)果顯示，香雪蘭6 個品種都是中部著絲粒染色體數(shù)量多于亞中部著絲粒染色體數(shù)量，且均無隨體，說明品種之間具有一定相似性，在親緣關系上存在一致性。且‘Pink Passion’和‘Red River’之間、‘Gold River’和‘上農(nóng)紅臺閣’之間的核型只存在一條染色體區(qū)別，相似程度高，初步證明了其兩兩之間的親緣性最近，推測其品種形成過程中可能有相同的親本參與。但不同品種間的核型也出現(xiàn)了一些差異，如‘White River’核型中出現(xiàn)一條正中部著絲粒染色體，而這是其他5 個品種所不具備的，體現(xiàn)出了一定的進化現(xiàn)象，可能與它的親本及人為選育目標有關。

核型不對稱性可較為科學地反映核型或植物的進化程度。Stebbins 研究中提出，高等植物核型進化基本是由對稱向不對稱方向發(fā)展。核型相似程度越高，物種間親緣關系越近，因此核型不對性指標是衡量植物進化及親緣關系的重要參數(shù)之一。所觀察的6 個香雪蘭品種的染色體核型不對稱系數(shù)范圍較大，表明香雪蘭存在較為復雜的遺傳關系，這與其長期自然選擇和人工培養(yǎng)馴化的進程有關，不同育種目標、不同環(huán)境需求導致不同的育種親本滲入，形成了適應當?shù)丨h(huán)境的品種群體，致使地方品種進化程度參差不齊。其中，‘上農(nóng)紅臺閣’核不對稱系數(shù)最大，‘Castor’也較大，與‘上農(nóng)紅臺閣’極為接近，意味著這2 個品種可能存在共同的親本。根據(jù)核型不對稱系數(shù)，推測這6 個香雪蘭品種核型進化的基本趨勢為：‘Pink Passion’→‘Red River’→‘Gold River’→‘White River’→‘Castor’→‘上農(nóng)紅臺閣’，該結(jié)果可被核型散點圖反映的結(jié)果所佐證。此外，根據(jù)Stebbins的分類，6 個香雪蘭品種均為2B 型，說明它們都處于由對稱向不對稱過渡的階段，進化程度中等且親緣關系較近，核型類型結(jié)果與核型不對稱系數(shù)所反映的結(jié)果相一致，可互相映證結(jié)果的可靠性。

核型進化遺傳距離是利用物種的核型數(shù)據(jù)對物種間的相似性進行多向、立體、多維的考察，從而判斷物種間的親緣關系，故是傳統(tǒng)分類學中一種非常好的補充方法，這在許多觀賞植物中已有相關研究報道。從上述結(jié)果來看，在遺傳距離為15 時，可將6 個香雪蘭品種分為2 類，其中‘Gold River’與‘上農(nóng)紅臺閣’、‘Pink Passion’和‘Red River’分別在很短的距離上先聚在一起，說明兩兩之間進化程度相當，親緣關系最近；在遺傳距離為4 和11 時，‘Castor’和‘White River’分別與上述2個組合聚在一起，說明這2個品種與前面品種存在一定的遺傳差距，親緣關系遠近差異較大，尤其是‘White River’相較于其他品種親緣關系最遠，這可能與其獨特的核型變化有著較大關系。上述結(jié)果與前期基于ISSR分子標記分析香雪蘭品種親緣關系的結(jié)果相似：發(fā)現(xiàn)‘Pink Passion’和‘Red Riv?er’聚為一類，‘Castor’則與該兩者親緣關系較遠?；诨ǚ厶卣鞯木垲愐餐瑯语@示，‘Pink Passion’和‘Red River’親緣很近，而與‘White Riv?er’較遠。但是，聚類結(jié)果與上述根據(jù)核型不對稱系數(shù)推測的進化程度并不完全吻合，這在其他植物中也有類似結(jié)果報道?？梢?，單一憑借核型特征不足以完全反映其親緣關系，需要結(jié)合其他多方面的研究結(jié)果綜合進行。

因為長期的雜交育種導致現(xiàn)代香雪蘭栽培品種的遺傳背景相當復雜，引起其核型差異變化的具體原因有待更多的研究驗證。本文分析了6 個香雪蘭品種的核型特征并籍此探討了親緣關系，可以為今后豐富香雪蘭品種遺傳多樣性、種質(zhì)資源鑒定等提供理論參考。