李加慧，狄雨晗，王文琪，廖博群，張雅瑋

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)是指由蛋白激酶催化的、將ATP或三磷酸鳥(niǎo)苷上γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等殘基側(cè)鏈上的過(guò)程，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有1/3以上的蛋白質(zhì)可以被磷酸化[1]。蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)可以調(diào)節(jié)如信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、肌肉收縮等一系列新陳代謝活動(dòng)[2]，而在宰后肌肉向可食用肉轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，這些新陳代謝活動(dòng)能夠很大程度影響肉品品質(zhì)，包括嫩度、保水性等[3]。

食鹽是肉制品加工過(guò)程中必不可少的輔料之一，已知食鹽腌制可以改善肉制品的保水性、嫩度等品質(zhì)。很多研究證實(shí)在體內(nèi)食鹽會(huì)影響蛋白質(zhì)的磷酸化，進(jìn)而調(diào)控一些生化生理反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，宰后24 h的羊肉使用3%食鹽腌制16 h后，與1%食鹽腌制相比，肌原纖維蛋白的整體磷酸化水平顯著降低[4]，體外孵育實(shí)驗(yàn)表明，食鹽腌制可通過(guò)抑制堿性磷酸酶和蛋白激酶A活性間接調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白磷酸化水平，從而提高肉嫩度。然而，在當(dāng)前積極響應(yīng)“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要中提出的“全國(guó)人均每日食鹽攝入量降低20%”的背景下，通過(guò)增加食鹽用量來(lái)改善肉品品質(zhì)的方法無(wú)疑與“健康中國(guó)”的倡導(dǎo)背道而馳。因此，找到合適的鈉鹽替代物及替代比例，達(dá)到降低鈉鹽含量的同時(shí)保證肉制品品質(zhì)的目標(biāo)是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

前期研究表明，堿性氨基酸可以改善肉及肉制品的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)及保水性。尹敬等[5]發(fā)現(xiàn)，含KCl、氨基酸的低鈉鹽替代食鹽比例為75%時(shí)制得的風(fēng)干草魚咸味純正，無(wú)異味，接受度較高；Zhang Yawei等[6]發(fā)現(xiàn)，用L-組氨酸（L-histidine，L-His）及L-賴氨酸（L-lysine，L-Lys）替代50%的食鹽可有效增加豬肉的持水力和結(jié)合水含量，保持良好的質(zhì)構(gòu)和色澤。此外，在抑制蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化方面，含L-Lys和L-His的鹽替代物被發(fā)現(xiàn)在加工過(guò)程中能夠加速干腌草魚蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的水解，抑制蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化[7]，添加L-His后還能在一定程度上提高肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)[8]。為了完善低鹽條件下添加L-His/L-Lys能夠保持或提高肉品品質(zhì)的機(jī)制，宰后磷酸化水平的變化規(guī)律及其與雞胸肉加工特性之間的關(guān)聯(lián)性是一個(gè)值得研究的方向。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在宰后120 min低鹽條件下分別添加L-His和L-Lys，探究肌原纖維蛋白磷酸化水平的變化規(guī)律，結(jié)合質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）技術(shù)找出磷酸化差異表達(dá)的蛋白，進(jìn)行磷酸化差異表達(dá)蛋白與雞胸肉加工特性的相關(guān)性分析，為L(zhǎng)-His和L-Lys在雞胸肉及其他肉品中的食鹽替代作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

36 只同一批次的黃羽肉雞（3 月齡，2.0～2.2 kg） 南京市玄武區(qū)孝陵衛(wèi)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑 瑞士Roche公司；非預(yù)染蛋白Marker 美國(guó)Thermo公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）預(yù)制膠、Tris-MOPS-SDS Running Buffer、LDS Sample Buffer（4×） 美國(guó)GenScript公司；Pro-Q Diamond染液、Sypro Ruby染液 美國(guó)Invitrogen公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T25 digtal Ultra Turrax高速勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司； Allegra 64R高速冷凍臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司； TA-XT質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；MCR301流變儀 奧地利安東帕公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、PowerPac Basic基礎(chǔ)型電源 美國(guó)Bio-Rad 公司；Typhoon Trio多功能激光成像系統(tǒng) 美國(guó)GE公司； eStain L1蛋白快速染色系統(tǒng) 美國(guó)GenScript公司；SpeedVac真空濃縮機(jī)、Orbitrap Exploris 480 MS儀 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 肌肉樣品的準(zhǔn)備

參考方芮等[9]的樣品處理方法并稍作修改，取雞左胸，在宰后120 min時(shí)添加肉質(zhì)量0% NaCl、1% NaCl、3% NaCl、1% NaCl＋0.06%L-His、1% NaCl＋0.06%L-Lys進(jìn)行腌制，腌制條件為4 ℃腌制24 h，腌制完后液氮速凍，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將樣品制成肉糜，取一部分進(jìn)行蒸煮損失、硬度、蛋白溶解度及流變特性測(cè)定。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

取1 g腌制后的肌肉組織加入6 mL預(yù)冷的勻漿緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.3，每50 mL加1 片蛋白酶抑制劑、2 片磷酸酶抑制劑），冰浴勻漿（9 500 r/min、2×30 s，13 500 r/min、2×30 s）。勻漿液在4 ℃、15 000×g下離心20 min，去掉上清液，將沉淀溶解于5 g/100 mL SDS溶液（60 ℃），勻漿 （9 500 r/min、30 s）后80 ℃加熱20 min即為肌原纖維蛋白溶液。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度，并用5 g/100 mL SDS溶液將樣品質(zhì)量濃度調(diào)至4 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 蛋白質(zhì)磷酸化水平測(cè)定

參考張彩霞[4]的方法并稍作修改，進(jìn)行電泳樣品的制備，將制備好的電泳樣品進(jìn)行SDS-PAGE。電泳初始電壓70 V，待溴酚藍(lán)指示帶進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)整為120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示帶距離凝膠底部0.5 cm處停止電泳，取出膠片。

將膠片放置在染色盒中，用固定液輕搖固定過(guò)夜。結(jié)束后用雙蒸水洗脫固定液（3×10 min），首先進(jìn)行磷酸化蛋白染色，膠片加入Pro-Q Diamond染料避光染色2 h， 用Pro-Q Diamond脫色液避光脫色1.5 h，用蒸餾水洗去脫色液（4×5 min）后使用Typhoon Trio多功能激光成像系統(tǒng)進(jìn)行第1次熒光掃描。掃描參數(shù)設(shè)置：采集模式設(shè)為熒光掃描，發(fā)射波長(zhǎng)580 nm，激發(fā)波長(zhǎng)532 nm，靈敏度正常，分辨率100 μm。接著進(jìn)行全蛋白染色，膠片加入Sypro Ruby染色液避光染色過(guò)夜，用Sypro Ruby脫色液避光脫色0.5 h，用蒸餾水洗去脫色液（4×5 min）后用Typhoon掃描儀進(jìn)行第2次熒光掃描。掃描參數(shù)設(shè)置：采集模式設(shè)為熒光掃描，發(fā)射波長(zhǎng)610 nm，激發(fā)波長(zhǎng) 532 nm，靈敏度正常，分辨率100 μm。使用ImageQuant TL軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行定量分析，按式（1）計(jì)算每個(gè)條帶的相對(duì)灰度，即每個(gè)條帶的磷酸化水平。

式中：P為磷酸化蛋白的灰度；T為全蛋白的灰度。

樣品的整體磷酸化水平按式（2）計(jì)算。

式中：P1為該泳道所有條帶的P值之和；T1為所有條帶的T值之和。

1.3.4 蒸煮損失測(cè)定

參考賈娜等[10]的方法，稱取一定質(zhì)量的均勻肉糜，質(zhì)量記為m1（g），放入自封袋中，再將肉樣置于85 ℃水浴鍋中，浸漬蒸煮30 min，蒸煮后冷卻至室溫，用濾紙吸干水分，然后稱肉糜質(zhì)量，記為m2（g），按式（3）計(jì)算蒸煮損失。

1.3.5 硬度測(cè)定

參考孟林等[11]的方法并稍作修改，將煮熟的肉糜切成1 cm×1 cm×1 cm的塊狀，質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)設(shè)定為：P50鋁合金探頭，測(cè)試前探頭速率2.00 mm/s，測(cè)試后探頭速率5.00 mm/s，2 次測(cè)試時(shí)間間隔3.00 s，觸發(fā)類型自動(dòng)，測(cè)定壓縮比50%，觸發(fā)力5.0 g，每組重復(fù)3 次。

1.3.6 蛋白溶解度測(cè)定

參考張雅瑋等[12]的方法，取30 g肉糜加入100 mL 1 g/100 mL NaCl溶液，冰浴冷卻下用高速組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理（8 000 r/min、30 s）。勻漿液在4 ℃下靜置24 h后，用紗布過(guò)濾。收集粗濾液經(jīng)離心（8 000×g、20 min）后得到上清液，并用BCA試劑盒測(cè)定離心前后的蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL），按式（4）計(jì)算蛋白溶解度。

1.3.7 流變學(xué)特性測(cè)定

利用流變儀測(cè)定流變學(xué)特性，采用50 mm平行板，頻率0.1 Hz，應(yīng)變2%，上下板間距1 mm。25 ℃預(yù)熱5 min后，18.0 mg/mL肌原纖維蛋白溶液以2 ℃/min的升溫速率從25 ℃升溫至85 ℃。板間縫隙的蛋白表面覆上液體硅油，防止揮發(fā)。記錄加熱過(guò)程中儲(chǔ)能模量（G’）的變化，計(jì)算儲(chǔ)能模量變化率（ΔG’），按式（5）[13]計(jì)算。

式中：G1’為85 ℃時(shí)的G’/Pa；G0’為25 ℃時(shí)的G’/Pa。

1.3.8 MS鑒定

將磷酸化水平差異顯著的條帶切碎后脫色脫水，加入20 μL 10 mmol/L二硫蘇糖醇在56 ℃還原1 h，冷卻至室溫后，吸干，快速避光，加入20 μL 55 mmol/L碘代乙酰胺，置于暗室45 min進(jìn)行烷基化。依次用25 mmol/L NH4HCO3、25 mmol/L NH4HCO3＋體積分?jǐn)?shù)50%乙腈和乙腈洗滌，乙腈脫水到膠粒完全變白為止，向溶液中加入0.2 μg胰蛋白酶進(jìn)行蛋白質(zhì)消化。然后將所得肽產(chǎn)物用Ziptip C18槍頭型脫鹽柱脫鹽，得到可供MS進(jìn)樣分析的溶液。利用MS儀對(duì)膠點(diǎn)內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性測(cè)定。樣品在分析柱（AcclaimPepMap?RSLC C18柱（75 μm×15 cm，3 μm，100 ?），Thermo Scientific）上以體積分?jǐn)?shù)3%～35%的洗脫緩沖液（體積分?jǐn)?shù)80%乙腈，含0.1%甲酸）梯度分離，接著在高效液相色譜級(jí)水中以 300 nL/min的流速分析90 min。從高分辨率MS1掃描中，選取最高強(qiáng)度的母離子在1 s循環(huán)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行高能碰撞碎裂以產(chǎn)生MS/MS圖，歸一化碰撞能量為30.0 eV，MS/MS圖的分辨率為15 000（m/z200）。根據(jù)從NCBI網(wǎng)站下載的Ovis aries蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Proteome Discoverer軟件（2.0版，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。按照Sequest HT算法的置信度大于99.0%鑒定MS/MS圖中的肽。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用ImageQuant TL（GE）軟件處理電泳膠拍照后的圖像，對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度分析后得到相對(duì)灰度，使用UniProtKB確定蛋白質(zhì)種類和功能，所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin pro 9.0軟件作圖，使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s法分析數(shù)據(jù)差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著，并進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 一維SDS-PAGE圖與磷酸化水平分析

由圖1可知，肌原纖維蛋白條帶平直且清晰，分離效果較好，可以進(jìn)行下一步磷酸化水平分析。選取16 個(gè)較清晰的蛋白條帶，利用IQTL軟件對(duì)其相對(duì)灰度進(jìn)行分析，從而得到不同處理組肌原纖維蛋白的整體磷酸化水平。

圖1 肌原纖維蛋白熒光染色圖Fig. 1 Images of stained myofibrillar protein

由圖2可知，添加L-His和L-Lys處理后，各處理組之間整體磷酸化水平無(wú)顯著差異。表明宰后120 min添加堿性氨基酸對(duì)肌原纖維蛋白的整體磷酸化水平無(wú)顯著影響。

圖2 L-His/L-Lys處理肌原纖維蛋白的整體磷酸化水平比較Fig. 2 Comparison of overall phosphorylation levels of myofibril proteins treated with L-His/L-Lys

為進(jìn)一步明確L-His和L-Lys對(duì)肌原纖維蛋白磷酸化的作用，選取11 條較重要的肌原纖維蛋白條帶，分析不同處理對(duì)其磷酸化水平的影響。

由表1可知，大部分蛋白質(zhì)條帶的磷酸化水平受到L-His及L-Lys的調(diào)控。其中，與1% NaCl處理相比，3% NaCl處理可以顯著提高2 個(gè)條帶（13、14）的磷酸化水平，顯著降低6 個(gè)條帶（6、7、9、10、12、16）的磷酸化水平，而其余3 個(gè)條帶（1、2、11）的磷酸化水平差異不顯著。與添加1% NaCl相比，添加0.06%L-His后，6 個(gè)條帶（2、7、9、10、12、16）的磷酸化水平顯著降低，條帶13的磷酸化水平顯著提高，其余4 個(gè)條帶（1、6、11、14）變化不顯著；添加0.06%L-Lys后，3 個(gè)條帶（6、9、10）的磷酸化水平顯著降低，條帶13的磷酸化水平顯著提高。與添加3% NaCl相比，添加1% NaCl＋0.06%L-His，3 個(gè)條帶（2、13、14）的磷酸化水平顯著降低，3 個(gè)條帶（9、10、12）的磷酸化水平顯著升高；添加1% NaCl＋0.06%L-Lys，條帶6、13、14的磷酸化水平顯著降低，條帶9、12的磷酸化水平顯著提高。

表1 L-His/L-Lys處理對(duì)雞胸肉肌原纖維蛋白單個(gè)條帶磷酸化水平的影響Table 1 Effects of L-His/L-Lys addition on single band phosphorylation levels of chicken breast myofibrillar proteins

綜合以上結(jié)果可知，盡管L-His和L-Lys不影響肌原纖維蛋白的整體磷酸化水平，但是可以改變單個(gè)蛋白質(zhì)的磷酸化水平。

2.2 L-His和L-Lys對(duì)雞胸肉蒸煮損失、硬度和蛋白溶解度的影響

由表2可知，伴隨著NaCl的加入，雞胸肉的蒸煮損失顯著下降，而與1% NaCl（14.14%）處理相比，3% NaCl（15.37%）處理并不能顯著降低蒸煮損失。關(guān)于提高肌肉持水力方面，僵直前鹽腌被認(rèn)為是維持肌肉持水力和減少蒸煮損失的有效方法[13]。研究發(fā)現(xiàn)，與2% NaCl相比[14]，僵直前添加同樣水平的氯化鉀處理的肉糜蒸煮損失無(wú)顯著差異，展示了僵直前低鹽處理的可能。而與3% NaCl相比，1% NaCl＋0.06%L-His/L-Lys處理能夠顯著降低雞胸肉的蒸煮損失，這說(shuō)明L-His和L-Lys可以改善肉糜的持水能力。

表2 L-His/L-Lys處理對(duì)雞胸肉蒸煮損失、硬度和蛋白溶解度的影響Table 2 Effects of L-His/L-Lys on cooking loss, heat-induced gel hardness and protein solubility of chicken breast meat

肉制品的硬度影響消費(fèi)者對(duì)其的偏好程度[15]，與1% NaCl處理相比，提高NaCl添加量（3% NaCl）可以顯著增加肉糜硬度，這與Kim等[16]的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)镹aCl的加入增大了蛋白溶解度，溶解的蛋白質(zhì)在小肉塊之間形成連接，提高了肉糜硬度[17]。Youssef等[18]研究表明，肉的質(zhì)地直接受到凝膠形成過(guò)程中肌球蛋白的影響，相互作用的肌球蛋白數(shù)量越多，蒸煮后產(chǎn)生的肉糜質(zhì)地越堅(jiān)硬。此外，L-His在1 mmol/L NaCl條件下可促進(jìn)肌原纖維凝膠小孔結(jié)構(gòu)的形成，從而使其獲得良好的結(jié)構(gòu)特 性[19]。在本實(shí)驗(yàn)中，這可能是1% NaCl＋0.06%L-His/L-Lys處理與3% NaCl處理組相比硬度無(wú)顯著差異的原因。

鹽溶性肌原纖維蛋白溶解度是影響肉制品保水能力和質(zhì)地最重要的功能特性之一[20]。在低鹽條件（＜0.3 mol/L NaCl/KCl）及水溶液條件下，肌原纖維蛋白易聚集成纖維絲，將功能基團(tuán)掩埋于內(nèi)部，表現(xiàn)出低溶解度[21]。本實(shí)驗(yàn)中，同樣的鹽濃度下，所有添加氨基酸處理組的雞胸肉蛋白質(zhì)溶解度均高于未添加氨基酸處理組雞胸肉，且與3% NaCl處理組無(wú)顯著差異。Guo Xiuyun等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在低鹽條件下（1 mmol/L、0.15 mol/L NaCl）添加5 mmol/LL-Lys能夠使肌球蛋白分子發(fā)生解折疊，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，顯著提高肌球蛋白溶解性。這也與蒸煮損失的結(jié)果一致，鹽溶性蛋白的溶解度提高使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)充分展開(kāi)，水分子運(yùn)動(dòng)受到束縛，形成致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，減少了肉糜的蒸煮損失[23]。

2.3 L-His和L-Lys對(duì)肌原纖維蛋白流變特性的影響

肌原纖維蛋白受熱后發(fā)生變性展開(kāi)，通過(guò)蛋白分子間的聚合作用形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這是一個(gè)不穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)流變過(guò)程。G’表示凝膠的彈性特征。由圖3可知，隨著溫度的升高，所有處理組的流變特性曲線變化趨勢(shì)基本一致。肌原纖維蛋白的流變曲線主要呈現(xiàn)出3 個(gè)階段的變化：溫度為25～50 ℃時(shí)，G’增加緩慢，曲線平坦，45 ℃左右沒(méi)有出現(xiàn)峰值，較低的G’說(shuō)明蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性較差；50～70 ℃時(shí)，G’迅速上升；70～85 ℃時(shí)，1% NaCl＋0.06% Lys、1% NaCl處理組在溫度未升到85 ℃時(shí)已達(dá)到最大G’，而其余處理組的G’在溫度達(dá)到85 ℃時(shí)達(dá)到最大值。

圖3 L-His/L-Lys處理對(duì)熱誘導(dǎo)肌原纖維蛋白凝膠動(dòng)態(tài)流變特性的影響Fig. 3 Effect of L-His/L-Lys on dynamic rheological properties of heat-induced myofibrillar protein gel

由表3可知，初始溫度下，1% NaCl處理組G0’為1.020 Pa，3% NaCl處理組為0.984 Pa，L-His、L-Lys處理組使得肌原纖維蛋白體系初始G0’分別降至0.457、0.671 Pa。L-His、L-Lys增加了肌原纖維蛋白溶解度，增加了蛋白質(zhì)體系的流動(dòng)性，從而引起初始G0’的降低[24]。 經(jīng)計(jì)算，0% NaCl、1% NaCl、3% NaCl、1% NaCl＋0.06%L-His、1% NaCl＋0.06%L-Lys組的?G’分別為596%、678%、1 841%、2 504%、1 480%，與1% NaCl相比，L-His和L-Lys的加入將?G’分別升高至2 504%、1 480%。特別是L-His，呈現(xiàn)出比3% NaCl處理組更高的?G’。這也說(shuō)明，宰后120 minL-His及L-Lys的加入有助于改善低鹽條件下鹽溶性肌原纖維蛋白的凝膠特性。

表3 L-His/L-Lys處理對(duì)熱誘導(dǎo)肌原纖維蛋白凝膠形成過(guò)程中?G’的影響Table 3 Effect of L-His/L-Lys on ?G’ during heat-induced gelation of myofibrillar protein

2.4 蛋白質(zhì)磷酸化水平與蒸煮損失、硬度、蛋白溶解度的相關(guān)性分析

由圖4可知，條帶1、6的磷酸化水平與蒸煮損失呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），條帶7、9、10、12的磷酸化水平與蒸煮損失呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。肉糜的硬度與蛋白質(zhì)磷酸化水平?jīng)]有顯著相關(guān)性；條帶7、9、10、12、16的磷酸化水平與蛋白溶解度呈顯著負(fù)相關(guān)，條帶13的磷酸化水平與蛋白溶解度呈顯著正相關(guān)。單個(gè)蛋白條帶的磷酸化水平之間同樣也存在一定的相關(guān)性，如條帶2、6、13、14的磷酸化水平與條帶1的磷酸化水平呈顯著正相關(guān)，條帶7、9、10、11、12的磷酸化水平與條帶1的磷酸化水平呈顯著負(fù)相關(guān)。一些條帶的磷酸化水平不受其他蛋白質(zhì)磷酸化的影響，如條帶16；一些條帶的磷酸化水平受到多個(gè)條帶的影響，如條帶14與條帶1、2、6、7、9、10、11、12、13呈顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。這說(shuō)明宰后蛋白質(zhì)磷酸化水平不僅可以調(diào)控肉的蒸煮損失及蛋白溶解度等加工特性，且單個(gè)蛋白質(zhì)的磷酸化水平還會(huì)受到其他蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響，最終決定肉品品質(zhì)的優(yōu)劣。為進(jìn)一步明確這些蛋白對(duì)肉加工特性的影響，將這11 條磷酸化差異顯著的條帶進(jìn)行MS鑒定。

2.5 磷酸化差異蛋白條帶MS鑒定

由表4可知，MS鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，條帶1中檢測(cè)到的是肌球蛋白重鏈，它是一種肌肉收縮相關(guān)蛋白[25]，NaCl的加入可以顯著提高其磷酸化水平，而NaCl處理組與加氨基酸處理組之間并無(wú)顯著差異。由于其磷酸化水平與蒸煮損失呈顯著負(fù)相關(guān)，表明NaCl的加入通過(guò)提高其磷酸化水平促進(jìn)了肌動(dòng)球蛋白的解離，進(jìn)而促進(jìn)宰后肉的嫩化[26]。條帶12中檢測(cè)到的是原肌球蛋白α1鏈， 條帶13中檢測(cè)到的是肌鈣蛋白T，條帶16中檢測(cè)到的是肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2。條帶12、13、16中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)均與肌肉收縮有關(guān)，說(shuō)明這些蛋白質(zhì)的磷酸化水平會(huì)對(duì)宰后肉的僵直產(chǎn)生影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，原肌球蛋白α1鏈磷酸化后不容易被鈣蛋白酶降解，不利于肉品嫩度[27]； 肌鈣蛋白T本身是肌鈣蛋白的抑制亞基，能高度抑制肌球蛋白中ATP酶的活性，有阻止肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白結(jié)合的功能，心肌肌鈣蛋白T的磷酸化可以影響肌肉收 縮[28]；肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2磷酸化修飾后會(huì)破壞肌肉粗絲和細(xì)絲的相互作用，使肌球蛋白重鏈頭部遠(yuǎn)離粗絲[29]。動(dòng)物宰后，由于ATP的缺失，肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白之間交聯(lián)結(jié)合形成肌動(dòng)球蛋白，肌動(dòng)球蛋白復(fù)合體的解離是影響肉品嫩度的重要因素之一，肌動(dòng)球蛋白的解離程度越大，相互作用力越小，肉嫩度越好。研究發(fā)現(xiàn)，肌鈣蛋白T磷酸化能夠降低肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白之間的相互作用力（肌動(dòng)球蛋白ATPase活力較低），促進(jìn)肌動(dòng)球蛋白的解離，從而改善肉品嫩度[26]。同時(shí)，與1% NaCl處理相比，加氨基酸組的條帶12、16的磷酸化水平明顯下降，條帶13的磷酸化水平則顯著提高?？赡苁且?yàn)闂l帶12、16的磷酸化水平與蛋白溶解度呈顯著的負(fù)相關(guān)，條帶13的磷酸化水平與蛋白溶解度呈顯著的正相關(guān)。

表4 雞胸肉肌原纖維蛋白11 條磷酸化差異顯著條帶的MS鑒定結(jié)果Table 4 MS identification of 11 differentially phosphorylated bands of chicken breast myofibrillar protein

糖酵解和肌肉收縮都是影響宰后肉品質(zhì)變化的關(guān)鍵因素，條帶7、9、10中檢測(cè)到了與糖酵解有關(guān)的磷酸化酶。條帶7中檢測(cè)到了ATP依賴性-6-磷酸果糖激酶，條帶9中檢測(cè)到了磷酸葡萄糖變位酶1，條帶10中檢測(cè)到了β-烯醇化酶。已有研究發(fā)現(xiàn)，糖酵解酶磷酸化后活性更高[30]，如ATP依賴性-6-磷酸果糖激酶磷酸化后可以穩(wěn)定其四聚體構(gòu)象，從而使其活性增大[31]。而磷酸化介導(dǎo)的酶活性增大有利于促進(jìn)糖酵解反應(yīng)，從而進(jìn)一步影響肉的色澤、保水性等。與1% NaCl相比，L-His及L-Lys的加入能夠顯著降低條帶7、9、10的磷酸化水平。而條帶7、9、10的磷酸化水平均與蒸煮損失呈正相關(guān)，與蛋白溶解度呈負(fù)相關(guān)，這表明L-His及L-Lys的添加可以有效改善產(chǎn)品的蒸煮損失，與本實(shí)驗(yàn)蒸煮損失的結(jié)果一致。在糖酵解代謝中，磷酸葡萄糖變位酶1發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，嫩牛肉中的磷酸葡萄糖變位酶1磷酸化水平低于硬牛肉[32]，表明磷酸葡萄糖變位酶1的低磷酸化水平有助于改善肉的嫩度。本實(shí)驗(yàn)中，L-His和L-Lys的引入導(dǎo)致磷酸葡萄糖變位酶1的磷酸化水平降低，可能是1% NaCl＋0.06%L-His/L-Lys處理相比于1% NaCl處理具有良好質(zhì)構(gòu)特性的原因之一。

3 結(jié) 論

宰后120 min添加L-His、L-Lys對(duì)肌原纖維蛋白的整體磷酸化水平無(wú)顯著影響，但是可以改變單個(gè)肌原纖維蛋白條帶的磷酸化水平。與1% NaCl相比，L-His可以顯著降低ATP依賴性-6-磷酸果糖激酶、磷酸葡萄糖變位酶1、β-烯醇化酶、原肌球蛋白α-1鏈、肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2 的磷酸化水平，顯著提高肌鈣蛋白T的磷酸化水平；L-Lys顯著降低了α-1,4-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶1和β-烯醇化酶的磷酸化水平，顯著提高了肌鈣蛋白T的磷酸化水平。相關(guān)性分析表明，單個(gè)蛋白質(zhì)磷酸化水平與肉品品質(zhì)顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。這說(shuō)明L-His、L-Lys的添加可能通過(guò)對(duì)肌原纖維蛋白磷酸化水平產(chǎn)生正面效應(yīng)，影響肌肉收縮和宰后僵直成熟過(guò)程，并在降低肉品中NaCl用量的同時(shí)調(diào)控肉品品質(zhì)。