8種殺菌劑對(duì)呼倫貝爾市油菜核盤(pán)菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

趙麗麗 ，孟 昊 ，郭 晨 ，宋培玲 ，楊永青 ，李子欽 ，

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.呼倫貝爾農(nóng)墾特泥河農(nóng)牧場(chǎng)有限公司，內(nèi)蒙古 海拉爾 021008；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

內(nèi)蒙古是我國(guó)春油菜主產(chǎn)區(qū)，年種植面積約30萬(wàn)hm2。呼倫貝爾市位于內(nèi)蒙古自治區(qū)東北部，氣候溫涼、日照充足、晝夜溫差大、雨熱同期，非常有利于油料作物脂肪的積累[1-2]。2021年呼倫貝爾市油菜種植面積13.9萬(wàn)hm2，主栽品種為生育期較短的早熟和中早熟甘藍(lán)型春油菜[3]。呼倫貝爾農(nóng)墾集團(tuán)6個(gè)生產(chǎn)隊(duì)2021年油菜種植面積共4 600.8 hm2，平均產(chǎn)量為1 660.0 kg/hm2，哈達(dá)圖農(nóng)牧場(chǎng)和蘇沁農(nóng)牧場(chǎng)2021年油菜種植面積均超1 300.0 hm2，占6個(gè)生產(chǎn)隊(duì)總種植面積的58.7%，上述2個(gè)農(nóng)牧場(chǎng)的油菜單產(chǎn)也位于前列，分別為1 950.0 kg/hm2和1 740.0 kg/hm2，其余4個(gè)農(nóng)牧場(chǎng)產(chǎn)量由高到低依次為特泥河四隊(duì)、謝爾塔拉八隊(duì)、謝爾塔拉一隊(duì)、謝爾塔拉五隊(duì)，最低產(chǎn)量為1 462.5 kg/hm2。

油菜菌核病在內(nèi)蒙古呼倫貝爾市發(fā)生較為嚴(yán)重，對(duì)油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了較大影響。油菜菌核?。╯clerotinia stem rot）是世界性油菜真菌病害，其病原菌為子囊真菌核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum），病菌主要以菌核混在土壤、種子或肥料中越夏和越冬[4]，易造成油菜植株干枯倒伏、角果減少、千粒重降低，導(dǎo)致油菜減產(chǎn)10%～50%。歷史上的最高發(fā)病率達(dá)80%[5]；2016年，菌核病危害造成的油菜產(chǎn)量損失達(dá)19.57萬(wàn)t[6]。油菜從苗期至收獲期均可發(fā)生菌核病，油菜花期田間子囊盤(pán)大量萌發(fā)，子囊孢子隨氣流、雨水等傳播至油菜花瓣，感病花瓣是油菜菌核病發(fā)生的主要傳染源。研究發(fā)現(xiàn)，油菜菌核病的流行與菌核密度、子囊盤(pán)密度、花朵帶菌率、油菜病葉率、成熟期莖稈發(fā)病株率均呈極顯著正相關(guān)；同時(shí)，降雨量、降雨天數(shù)及日照時(shí)數(shù)等氣候因子也是影響油菜菌核病發(fā)生的關(guān)鍵因素[7]。目前，油菜菌核病的防治主要是農(nóng)業(yè)防治與化學(xué)藥劑相結(jié)合，常用的化學(xué)殺菌劑包括多菌靈、菌核凈、腐霉利、戊唑醇等。一般認(rèn)為，同種藥劑在油菜盛花期噴施比在初花期噴施防效更佳，初花期和盛花期兩次用藥效果優(yōu)于單次用藥，盛花期用藥更為關(guān)鍵[8]。國(guó)內(nèi)已有多個(gè)省份對(duì)油菜菌核病發(fā)生情況及殺菌劑對(duì)病原菌的田間防效進(jìn)行了報(bào)道[9-11]，但內(nèi)蒙古呼倫貝爾市油菜菌核病的發(fā)生規(guī)律、防治方法、常用殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力等鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)開(kāi)展了8種常用殺菌劑對(duì)呼倫貝爾農(nóng)墾集團(tuán)6個(gè)生產(chǎn)隊(duì)油菜核盤(pán)菌的室內(nèi)毒力測(cè)定，以期為田間藥劑的使用提供數(shù)據(jù)支撐，并為制定科學(xué)合理的油菜菌核病防治措施提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料

2021年在內(nèi)蒙古呼倫貝爾農(nóng)墾集團(tuán)謝爾塔拉一隊(duì)、謝爾塔拉五隊(duì)、謝爾塔拉八隊(duì)、哈達(dá)圖農(nóng)牧場(chǎng)、蘇沁農(nóng)牧場(chǎng)、特泥河四隊(duì)6個(gè)農(nóng)牧場(chǎng)采集的發(fā)病植株或油菜核盤(pán)菌菌核以及2019年采集自蘇沁農(nóng)牧場(chǎng)的2份油菜核盤(pán)菌菌核樣品和2020年采集自謝爾塔拉一隊(duì)的1份油菜核盤(pán)菌菌核樣品。

1.2 主要試劑

室內(nèi)毒力試驗(yàn)采用以下8種試劑：99%戊唑醇（tebuconazole）、98%咪鮮胺（prochloraz）、98%多菌靈（carbendazim）、98%啶酰菌胺（boscalid）、98%嘧菌酯（azoxystrobin）、90%菌核凈（dimethachlon）、98%惡醚唑（difenoconazole）、98%腐霉利（procymidon），均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

普通化學(xué)試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、無(wú)水乙醇、次氯酸鈉為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離純化

收獲期分別采集6個(gè)生產(chǎn)隊(duì)的油菜核盤(pán)菌菌核，帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行分離純化。菌核樣品經(jīng)10%次氯酸鈉、75%乙醇表面消毒，接種于含有500 μg/mL硫酸鏈霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，待菌核萌發(fā)白色菌絲后繼續(xù)純化培養(yǎng)2～3代，用于室內(nèi)藥劑敏感性試驗(yàn)。

1.3.2 分離物的致病性測(cè)定

將油菜種子（三豐66）播種在裝有無(wú)菌土的營(yíng)養(yǎng)缽（13 cm×13 cm），每個(gè)品種播種3缽，每缽播10 粒，置于 25℃、16 h/8 h（光照/黑暗）條件下，待幼苗生長(zhǎng)到3～4片真葉時(shí)，用于接種。選取苗齡相同、部位相同、大小一致的健康葉片，用1%NaClO溶液表面消毒后無(wú)菌水沖洗干凈，吸干表面水分，在葉片的葉脈一側(cè)接種5 mm的菌碟，置于鋪有濾紙（無(wú)菌水浸濕）的玻璃培養(yǎng)皿，每個(gè)處理3次重復(fù)，取相同葉片同上處理，只接種5 mm的空白PDA培養(yǎng)基塊或在葉脈另一側(cè)接種5 mm的空白PDA培養(yǎng)基塊作為陰性對(duì)照，于室溫培養(yǎng)72 h后，觀察葉片染病情況。

1.3.3 殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定

供試農(nóng)藥用二甲基亞砜配制成濃度為10000μg/mL的母液，使用時(shí)再稀釋成一定濃度的使用液，加入預(yù)先滅菌并冷卻至45～50℃的PDA培養(yǎng)基，充分搖勻后傾倒平板。培養(yǎng)基殺菌劑的終濃度見(jiàn)表1。在接種后4 d的菌落邊緣取直徑5 mm相同菌齡的菌碟，菌面向下接種在含藥PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)至對(duì)照菌絲長(zhǎng)滿平板時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（mm），每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，以殺菌劑濃度的對(duì)數(shù)為x、抑制率（%）為y，根據(jù)x與 y的線性關(guān)系得出其毒力回歸方程y=ax+b，計(jì)算y=50%時(shí)對(duì)應(yīng)的x值，即為有效抑制中濃度EC50值（μg/mL）。

表1 8種防治藥劑的室內(nèi)敏感性測(cè)定的終濃度值

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007、SPSS 26.0和OriginPro軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離結(jié)果

通過(guò)室內(nèi)組織分離法分別從呼倫貝爾市6個(gè)生產(chǎn)隊(duì)分離純化獲得16株油菜核盤(pán)菌，按照“年份-生產(chǎn)隊(duì)名稱首字母縮寫(xiě)-序號(hào)”編號(hào)，小寫(xiě)字母分別代表來(lái)自同一地區(qū)、不同地塊的病原菌；此外純化培養(yǎng)了2020年和2019年采集的3份核盤(pán)菌樣品20XR-1a、19SQb、19SQc；共純化得到 19 株油菜核盤(pán)菌（表 2）。

表2 核盤(pán)菌樣品信息

2.2 分離物的致病性測(cè)定

19株病原物接種油菜離體葉片72 h后均能在油菜葉片上產(chǎn)生明顯的褐色、水漬狀病斑（圖1），說(shuō)明從田間采集的菌核經(jīng)分離純化獲得的核盤(pán)菌菌株均具有致病性。

圖1 分離物對(duì)油菜葉片的致病性

2.3 殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力

以分離自6個(gè)生產(chǎn)隊(duì)的19株核盤(pán)菌為供試菌株（表2），對(duì)常用的8種殺菌劑進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果顯示，供試8種殺菌劑對(duì)油菜核盤(pán)菌的EC50值由小到大分別為：98%咪鮮胺＜98%多菌靈＜98%腐霉利＜99%戊唑醇＜98%啶酰菌胺＜90%菌核凈＜98%惡醚唑＜98%嘧菌酯（圖2），試驗(yàn)所選的19株核盤(pán)菌對(duì)上述殺菌劑的平均 EC50值分別為 0.031、0.078、0.261、0.286、0.362、0.536、0.673、1.380 μg/mL（表 3）；由室內(nèi)毒力試驗(yàn)結(jié)果可以得出，內(nèi)蒙古呼倫貝爾市油菜核盤(pán)菌在室內(nèi)培養(yǎng)條件下對(duì)咪鮮胺最為敏感，其次是多菌靈、腐霉利、戊唑醇，這一結(jié)果與該地區(qū)生產(chǎn)中常用的防治藥劑吻合，說(shuō)明當(dāng)前采用的防治措施較為有效；同時(shí)受試菌株對(duì)甾醇脫甲基酶抑制劑類（DMI）殺菌劑中咪鮮胺和戊唑醇的敏感性較高。此外，受試菌株對(duì)嘧菌酯的EC50值分布較為分散（圖 2），且最大 EC50值為4.177 μg/mL，在生產(chǎn)中交替使用不同類型殺菌劑時(shí)，應(yīng)避免選擇嘧菌酯。

表 3（續(xù)）

表 3（續(xù)）

表3 病原菌室內(nèi)毒力方程及抑制中濃度（EC50）

圖2 呼倫貝爾市油菜核盤(pán)菌對(duì)8種殺菌劑的室內(nèi)敏感性

3 討論與結(jié)論

油菜菌核病的危害程度與當(dāng)?shù)氐臍庀笠蛩孛芮邢嚓P(guān)，根據(jù)農(nóng)墾集團(tuán)每個(gè)農(nóng)牧場(chǎng)觀測(cè)的降雨情況分析，2021年6—7月呼倫貝爾市降雨量較2020年同期明顯偏多，以特泥河實(shí)驗(yàn)站氣象監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)為例，2021年6月總降水量為87.9 mm，較上一年增加6.6 mm，但是7月總降水量增加至168.1 mm，而2020年同期降雨量?jī)H為28.1 mm。油菜花期與雨季同期，增加了油菜菌核病的發(fā)生率。

目前，使用化學(xué)殺菌劑仍是防治油菜菌核病的重要措施，呼倫貝爾農(nóng)墾集團(tuán)的6個(gè)生產(chǎn)隊(duì)使用的田間防治藥劑主要為腐霉利、多菌靈和菌核凈，DMI殺菌劑如戊唑醇、咪鮮胺也在交替使用。除哈達(dá)圖農(nóng)牧場(chǎng)于7月上、下旬各噴藥1次外，其余生產(chǎn)隊(duì)的噴藥時(shí)間集中在6月上旬至7月中旬，此時(shí)正值油菜初花期和盛花期，噴藥2～3次；6個(gè)農(nóng)牧場(chǎng)中謝爾塔拉一隊(duì)、五隊(duì)、八隊(duì)的菌核病發(fā)生率均小于5%，發(fā)病率相對(duì)較輕；哈達(dá)圖農(nóng)牧場(chǎng)的發(fā)病率較高，為30%，調(diào)查顯示該農(nóng)牧場(chǎng)的噴藥時(shí)間較晚，推測(cè)發(fā)病率較高可能與此有關(guān)。通過(guò)室內(nèi)毒力測(cè)定，本試驗(yàn)結(jié)果得出，內(nèi)蒙古呼倫貝爾市油菜核盤(pán)菌對(duì)8種常用殺菌劑均處于敏感水平，說(shuō)明當(dāng)前生產(chǎn)中多菌靈和菌核凈仍可作為該地區(qū)防治油菜菌核病的主要?dú)⒕鷦４送?，室?nèi)毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示，咪鮮胺、戊唑醇、啶酰菌胺對(duì)呼倫貝爾市油菜核盤(pán)菌的室內(nèi)抑制效果較為理想，有研究測(cè)定了安徽省菌核病菌對(duì)12種常用殺菌劑的室內(nèi)毒力，同樣得出戊唑醇和咪鮮胺的抑制效果較好[12]。鑒于我國(guó)冬油菜產(chǎn)區(qū)已多次報(bào)道核盤(pán)菌對(duì)多菌靈和菌核凈產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的抗藥性，而對(duì)DMI類殺菌劑的田間抗藥性尚未見(jiàn)報(bào)道[13-16]，在今后研究中應(yīng)擴(kuò)大油菜核盤(pán)菌采樣范圍和供試菌株數(shù)量，監(jiān)測(cè)病原菌群體對(duì)常用殺菌劑的敏感性變化，同時(shí)在生產(chǎn)中可將多菌靈、菌核凈與不同作用類型殺菌劑交替使用，以延緩病原菌田間抗藥性的產(chǎn)生。

致謝：感謝呼倫貝爾農(nóng)墾集團(tuán)對(duì)本次論文田間調(diào)查及樣品采集過(guò)程中給予的大力支持和幫助。