高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定大米中維生素B1含量※

●董 欣 趙佳寧 王 博 畢 玉 袁海濤 郭丹丹

（興安盟疾病預(yù)防控制中心 內(nèi)蒙古 烏蘭浩特 137400）

維生素B1（Vitamin B1，VB1）又稱硫胺素，具有維持人體正常糖代謝、參與神經(jīng)傳導(dǎo)的作 用[1-2]。稻谷中含有豐富的B族維生素，VB3和VB1最為豐富[3]。目前，谷物中VB1的測定方法主要為高效液相色譜紫外檢測法和光檢測法[4-5]， 其樣品前處理復(fù)雜，檢測時間長，而近些年關(guān)于大米中VB1測定的研究多集中在高效液相法[6]， 對于液質(zhì)法測定多集中在嬰幼兒食品、功能性飲料等或飼料領(lǐng)域中[7-9]，但缺乏液質(zhì)法測定大米中VB1的相關(guān)報道。本研究建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定大米中VB1的方法，在快速檢測、提升效率、降低成本等方面具有重要 意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 大米樣品001號：泰勒銀珠大米；002號：綠色草原長粒香大米；003號：蒙佳有機大米；004號：蒙佳稻花香；005：蒙望農(nóng)業(yè)私人訂制；006號：魏佳興安盟大米；007號：魏佳留胚米；008號：綽爾蒙珠哈斯香米；009號：草原三合大米。

1.1.2 試劑VB1標(biāo)準(zhǔn)品：壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司，純度≥99.0%；乙酸銨：優(yōu)級純，西亞試劑有限公司；甲醇：色譜純，飛世爾試劑；甲酸：優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限 公司。

1.2 儀器設(shè)備

XPE105十萬分之一電子天平：梅特勒-托利多公司；H-CLASS+TQD高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理準(zhǔn)確稱取40目篩下大米粉末0.5～2 g（精確至0.01 g），置于250 mL錐形瓶中，加入60 mL 0.02 moL/L乙酸銨溶液，超聲提取 20 min，冷卻至室溫，溶液及殘渣定容至100 mL容量瓶中，離心，上清液過0.22 μm濾膜。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制VB1標(biāo)準(zhǔn)儲備液 （500 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取干燥后的維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品56.1 mg（精確至0.1 mg），相當(dāng)于50 mg硫胺素，用0.01 moL/L鹽酸溶解并定容至100 mL，搖勻。VB1標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液2 mL，用水定容至100 mL容量瓶中，搖勻。VB1標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取一定量VB1標(biāo)準(zhǔn)中間液，配成濃度為0，2.0，5.0，10，20，50，100 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.3.3 色譜條件色譜柱：HSS T3色譜柱（粒 徑1.8 μm，100 mm×2.1 mm）；流 動 相： 0.02 mol/L乙酸銨溶液-0.1%甲酸甲醇；流速： 0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：40℃。洗脫梯度，見表1。

表1 液相洗脫條件

1.3.4 質(zhì)譜條件離子化模式：ESI+，多選擇反應(yīng)監(jiān)測（MRM），毛細(xì)管電壓：1500 V，離子源溫度：150℃，脫溶劑溫度：350℃，錐孔氣流量：50L/Hr，脫溶劑氣流量：650 L/Hr。MRM條件，見表2。

表2 MRM多選擇監(jiān)測模式下維生素B1的儀器優(yōu)化條件

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取溶劑的選擇

分別用水、0.02 moL/L乙酸銨、20%甲醇提取大米樣品中VB1，按本文“1.3.1”樣品處理方法提取。結(jié)果表明：用水和20%甲醇提取同一樣品中的VB1時的峰面積比用0.02 moL/L乙酸銨提取VB1時小，0.02 moL/L乙酸銨可以充分提取大米中的VB1，故選用0.02 moL/L乙酸銨作為樣品提取溶液（圖1）。

圖1 提取溶劑單因素試驗

2.2 樣品提取溶劑體積及時間的選擇

稱取1 g樣品5份，分別做提取體積（20，40，60，80，100 mL）和提取時間（5，10，15，25，30 min）的單因素試驗，結(jié)果表明：提取體積在60 mL、提取時間為20 min時響應(yīng)值最高，樣品提取率最優(yōu)（圖2和圖3）。

圖2 提取時間單因素試驗

圖3 提取體積單因素試驗

2.3 色譜柱的選擇

試驗對比了Waters ACOUTUTY UPLC HSS T3 （2.1×100 mm，1.8 μm） 和Waters BEH C18 （2.1×100 mm，1.7 μm）2種色譜柱，在相同條件下T3色譜柱峰型尖銳、對稱，C18色譜柱峰型較 寬、存在拖尾、分叉現(xiàn)象（圖4和圖5）。

圖4 Waters ACOUTUTY UPLC HSS T3色譜柱VB1離子流圖

圖5 Waters BEH C18 色譜柱VB1離子流圖

2.4 流動相及比例的選擇

對比0.02 mol/L乙酸銨溶液-0.1%甲酸甲醇與0.02 mol/L乙酸銨溶液-甲醇2種流動相發(fā)現(xiàn)，添加0.1%甲酸的流動相分離效果較好，峰型對稱尖銳（圖6和圖7）。

圖6 未加甲酸時的離子流圖

圖7 加入甲酸時的離子流圖

在添加0.1%甲酸作為流動相的條件下，等度（99+1）洗脫時峰型拖尾，而采用表1中的梯度洗脫，VB1的峰形尖銳且對稱，故選擇梯度洗脫（圖8和圖9）。

圖8 梯度洗脫離子流圖

圖9 等度洗脫離子流圖

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在正離子檢測模式下，進(jìn)行手動調(diào)諧，以5μL/min流量注入離子源進(jìn)行母離子質(zhì)譜掃描，確定母離子響應(yīng)較高、穩(wěn)定且豐度大時的毛細(xì)管電壓、錐孔電壓，再將母離子打碎進(jìn)行子離子掃描，調(diào)節(jié)碰撞能，確定兩對子離子響應(yīng)較大時的碰撞能。

2.6 線性范圍和檢出限

按照本試驗研究方法，對VB1標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行測定，3倍信噪比（S/N）作為檢出限，10倍信噪比（S/N）作定量下限，結(jié)果見表3。

表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限

2.7 回收率和精密度

按照試驗方法對興安盟地區(qū)9種大米樣品做加標(biāo)回收試驗，6次平行試驗，計算其加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果表明：本試驗方法加標(biāo)回收率在90%～97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.87%～1.37%。

表4 加標(biāo)回收率和精密度試驗結(jié)果（n=6）

2.8 實際樣品的測定

應(yīng)用上述方法及國標(biāo)方法[10]對興安盟地區(qū)9種品牌大米進(jìn)行VB1檢測，結(jié)果見表5。

從表5可以看出，本方法與國標(biāo)檢測方法結(jié)果相差不大，但國標(biāo)方法樣品預(yù)處理操作復(fù)雜，耗時較長，而本方法檢測結(jié)果與國標(biāo)方法一致，而樣品提取步驟簡單，減少了損耗，縮短了檢測時間，檢驗結(jié)果準(zhǔn)確。

表5 興安盟地區(qū)9種大米VB1測定結(jié)果 單位：mg/kg

3 結(jié)論

建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定大米中維生素B1含量的方法，分析速度快、操作方法簡單、出峰時間穩(wěn)定、精密度和準(zhǔn)確度均可滿足分析要求，適宜在大米及谷物類食品中應(yīng)用。