繩秀珍， 宋滿滿， 朱 慧， 唐小千， 邢 婧， 遲 恒， 戰(zhàn)文斌

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))， 山東 青島 266003)

魚類生活的水環(huán)境中富含病原微生物，其黏膜免疫系統(tǒng)在免疫防御中起到至關(guān)重要的作用[1-2]。魚類的黏膜相關(guān)淋巴組織主要包括皮膚、鰓、腸及鼻咽等[3-4]，共同特點(diǎn)是在黏膜表面的黏液中含有分泌型免疫球蛋白(SIgs)及其他免疫分子，構(gòu)成抵御病原入侵的第一道屏障。哺乳動物中研究發(fā)現(xiàn)，黏膜固有層中的漿細(xì)胞產(chǎn)生的多聚免疫球蛋白(pIgA或pIgM)通過多聚免疫球蛋白受體(pIgR)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)至黏膜表面形成SIgs，發(fā)揮清除病原體及毒素的黏膜免疫防御作用[5-6]。對魚類研究發(fā)現(xiàn)，pIgR可以結(jié)合牙鲆(Paralichthysolivaceus)、鯉(Cyprinuscarpio)、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)等魚類的四聚體免疫球蛋白M(IgM)[7-9]以及虹鱒 (Oncorhynchusmykiss)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)、大西洋鮭(Salmosalar)等魚類的二聚體IgT[10-11]；牙鲆pIgR可以介導(dǎo)IgM-抗原復(fù)合物跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)至腸黏液中[12]；滅活鰻弧菌(Vibrioanguillarum)免疫牙鲆后，皮膚、鰓、腸黏液及膽汁中pIgR及IgM水平升高，并檢測到pIgR-IgM復(fù)合物[13]，表明魚類pIgR可介導(dǎo)黏膜IgM的分泌及免疫復(fù)合物的清除。

最近，在大西洋鮭(Salmosalar)、斑馬魚(Daniorerio)、鯉和牙鲆等魚類中發(fā)現(xiàn)了pIgR同源分子(pIgR-like，pIgRL)，與魚類pIgR一樣含有兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(ILDs)，推測其可能具有類似pIgR的功能[14-17]。研究發(fā)現(xiàn)，大西洋鮭pIgRL在魚的皮膚和鰓中均有較高水平表達(dá)，但在皮膚中轉(zhuǎn)錄水平低于pIgR[14]。斑馬魚的免疫組織中可檢測到pIgR和pIgRL轉(zhuǎn)錄，但在淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中只檢測到pIgRL轉(zhuǎn)錄，且轉(zhuǎn)錄水平在海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)感染后顯著提高，但在彈狀病毒感染后則降低[15]。牙鲆黏膜組織中pIgRL與IgM的表達(dá)在滅活鰻弧菌免疫后顯著上調(diào)，在黏液中檢測到pIgRL-IgM復(fù)合物[17]。這些資料說明pIgRL也在魚體免疫防御中發(fā)揮著重要作用，但是對于pIgRL介導(dǎo)的黏膜抗體分泌機(jī)制尚不明晰，還有待深入研究。

作者前期克隆表達(dá)了牙鲆pIgRL，制備了其特異性抗體，在基因水平上研究了滅活鰻弧菌誘導(dǎo)pIgRL與IgM的應(yīng)答變化，確認(rèn)鰓、皮膚和腸黏液中存在pIgRL-IgM復(fù)合物[17]。在此基礎(chǔ)上，本文利用滅活鰻弧菌免疫牙鲆，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測定了鰓黏液、皮膚黏液、腸黏液和膽汁中pIgRL與IgM蛋白水平的時序變化，使用多重?zé)晒鈽?biāo)記技術(shù)對不同時間點(diǎn)的腸組織中IgM和pIgRL進(jìn)行共定位染色，利用ImageJ軟件進(jìn)行共定位定量分析，以尋找牙鲆pIgRL跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)IgM的證據(jù)，本研究可為深入理解pIgRL的黏膜免疫功能提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及抗體

240尾健康牙鲆購自山東省日照市某養(yǎng)殖場，體長為15～20 cm。牙鲆飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室水族箱中，海水溫度21 ℃左右,溶氧量為6.0 mg/L，每天喂食2次商品化飼料，暫養(yǎng)馴化2周后進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。

鼠抗牙鲆血清IgM單克隆抗體2D8[18]、兔抗牙鲆pIgRL多克隆抗體[17]由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 牙鲆免疫及樣品采集

將實(shí)驗(yàn)室保存的鰻弧菌[19]從-80 ℃冰箱中取出，解凍后接種到1 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)至500 mL的LB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。鰻弧菌于8 000g離心10 min后，使用磷酸緩沖液(PBS，pH=7.2)重懸。采用前期的方法制備鰻弧菌滅活疫苗并進(jìn)行安全性檢測[13]。然后，將滅活疫苗用PBS洗滌3次，調(diào)整濃度至1×1010CFU/mL，保存于4 ℃冰箱備用。

將暫養(yǎng)的健康牙鲆隨機(jī)分為4組，每組60尾。浸泡免疫組在海水中加鰻弧菌滅活疫苗至最終濃度為1×108CFU/mL，將牙鲆浸泡30 min后，移至新鮮海水中；對照組1在海水中加入等量PBS，同樣浸泡處理。注射免疫組牙鲆每尾腹腔注射1×108CFU/mL鰻弧菌疫苗100 μL，對照組2注射等量PBS。分別于免疫前(0 d)以及免疫后1、3、5、7、10、14、21、28、35和42 d從各組中隨機(jī)選取5尾牙鲆，按照上述方法收集皮膚黏液、鰓黏液、腸黏液和膽汁[13]。將黏液和膽汁于12 000g下離心15 min，保存于-80 ℃冰箱備用。

分別于0、3、7、14、21和28 d隨機(jī)取3尾浸泡免疫組牙鲆，解剖取后腸組織，無菌PBS沖洗干凈，OCT包埋，于-80 ℃冰箱速凍4 h以上。

1.3 ELISA法檢測pIgRL與特異性IgM蛋白水平變化

1.3.1 pIgRL蛋白水平測定 將各時間點(diǎn)的皮膚黏液、鰓黏液、腸黏液及膽汁各100 μL加至96孔酶標(biāo)板中，每個樣品3個重復(fù)，4 ℃包被過夜。次日用含0.05%吐溫(Tween-20)的PBS(PBST)洗滌3次，每次5 min。每孔加入5% 牛血清白蛋白(BSA) 100 μL，37 ℃下孵育1 h。洗滌3次后，每孔加入兔抗牙鲆pIgRL多抗100 μL(1∶1 000，PBS稀釋)，以健康兔血清作為陰性對照，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌，每孔加入100 μL堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶5 000)，37 ℃下孵育1 h，再加入100 μL含0.1% 3-(4-硝基苯基)丙炔酸甲酯(pNPP)的發(fā)色液避光反應(yīng)10 min，用2 mol/L NaOH中止發(fā)色，在405 nm條件下測定平均吸光度值(OD)。

1.3.2 特異性IgM蛋白水平測定 將滅活鰻弧菌的蛋白濃度稀釋為0.1 mg/mL，每孔100 μL加于96孔酶標(biāo)板中，4 ℃包被過夜。次日PBST洗滌3次，5% BSA 37 ℃封閉1 h。PBST洗滌3次后，分別加入100 μL皮膚黏液、鰓黏液、腸黏液及膽汁，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌后，加入鼠抗牙鲆血清IgM單抗2D8(1∶1 000)作為第一抗體，健康鼠血清作為對照，37 ℃孵育1 h；然后加入100 μL堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1∶5 000)作為第二抗體，37 ℃孵育1 h。上述同樣方法發(fā)色，測定平均吸光度值(OD)。

1.4 多重?zé)晒鈽?biāo)記及激光掃描共聚焦顯微鏡觀察

制作厚度為7 μm的冰凍切片，使用4 ℃預(yù)冷的丙酮固定10 min，通風(fēng)櫥中晾干。PBS洗滌10～15 min，甩片機(jī)甩干。5% BSA封閉切片1 h(37 ℃)，PBST洗滌3次，每次5 min。鼠抗牙鲆IgM單抗2D8與兔抗牙鲆pIgRL多抗的混合液作為一抗，37 ℃孵育1.5 h，鼠陰性血清和兔陰性血清的混合液代替一抗作為陰性對照。PBST洗滌后，Alexa 488標(biāo)記羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 649標(biāo)記羊抗兔IgG的混合液作為二抗，37 ℃下避光孵育1 h。PBST洗去多余抗體，室溫下用DAPI(1∶1 000)染細(xì)胞核10 min。60%甘油封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察拍照，并應(yīng)用ImageJ軟件定量分析IgM與pIgRL在腸黏膜組織中的共定位情況[13]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)使用SPSS 20 軟件通過單因素方差檢驗(yàn)分析差異的顯著性，使用Origin 8.0 作圖，P<0.05時為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 牙鲆黏液和膽汁中特異性IgM免疫應(yīng)答水平變化

腹腔注射和浸泡滅活鰻弧菌后，ELISA法檢測不同時間點(diǎn)牙鲆黏液及膽汁中特異性IgM水平變化，發(fā)現(xiàn)IgM水平在42 d內(nèi)呈先升高后降低的變化趨勢(見圖1)。浸泡免疫后，特異性IgM在皮膚黏液和鰓黏液中分別于第7和10天達(dá)到峰值(見圖1A、1B)，在腸黏液和膽汁中于第21天達(dá)到峰值(見圖1C、1D)。經(jīng)腹腔注射免疫后，IgM在皮膚黏液和鰓黏液中均于第14天達(dá)到峰值(見圖1A、1B)，在腸道黏液和膽汁中于第21天達(dá)到峰值(見圖1C、1D)。兩組牙鲆腸黏液IgM峰值最高。注射組牙鲆皮膚黏液、腸黏液及膽汁中IgM峰值較浸泡組稍高(見圖1A、1C、1D)，而浸泡組牙鲆的鰓黏液IgM較注射組稍高(見圖1B)。

圖1 滅活鰻弧菌注射和浸泡免疫后牙鲆特異性IgM蛋白水平變化

2.2 牙鲆黏液和膽汁中pIgRL蛋白水平的動態(tài)變化

經(jīng)浸泡和注射免疫滅活鰻弧菌后，牙鲆皮膚黏液、鰓黏液、腸黏液及膽汁中pIgRL蛋白水平與IgM呈相似的變化趨勢，但比IgM應(yīng)答要早(見圖2)。經(jīng)浸泡免疫后，pIgRL蛋白水平在皮膚黏液、鰓黏液、腸黏液及膽汁中分別于第5、3、7和10天達(dá)到峰值(見圖2A—D)；其中皮膚黏液中pIgRL水平最高，鰓和腸黏液次之，膽汁最少。注射免疫后，上述分泌液中pIgRL水平分別于第7、5、10和10天達(dá)到峰值(見圖2A—D)。注射組牙鲆鰓黏液、腸黏液及膽汁中pIgRL峰值較浸泡組高(見圖2B、2C、2D)，而皮膚黏液中pIgRL的峰值較浸泡組稍低(見圖2A)。

2.3 牙鲆腸黏膜組織中IgM與pIgRL的動態(tài)分布及共定位分析

牙鲆腸道由黏膜層、黏膜下層、肌肉層和漿膜組成；黏膜層呈現(xiàn)高低不等的褶皺，由上皮層和固有層組成；褶皺固有層與黏膜下層之間缺乏黏膜肌層。腸黏膜組織中IgM和pIgRL雙重?zé)晒馊旧Y(jié)果如圖3所示。免疫前，IgM陽性綠色熒光主要位于腸黏膜固有層，少量位于上皮細(xì)胞基底部；而pIgRL陽性紅色熒光少量位于固有層，較多存在于黏膜下層，但在腸上皮細(xì)胞層未觀察到陽性信號(見圖3A、3A’)。浸泡免疫滅活鰻弧菌后，3和7 d時，腸黏膜固有層及上皮細(xì)胞基底側(cè)的IgM綠色陽性信號逐漸增強(qiáng)；固有層中pIgRL紅色信號也明顯增強(qiáng)，3 d時在上皮細(xì)胞層開始出現(xiàn)少量陽性信號，7 d時明顯增強(qiáng)(見圖3B、3B’和3C、3C’)。14和21 d時，腸上皮細(xì)胞層IgM陽性信號大量累積，固有層中pIgRL信號增強(qiáng)，觀察到代表IgM和pIgRL共定位的橙黃色熒光信號(見圖3D、3D’和3E、3E’)。28 d時腸上皮細(xì)胞內(nèi)IgM陽性信號開始減少，但固有層中仍有較強(qiáng)的pIgRL紅色信號及二者共定位的橙黃色信號，且比上皮層更明顯(見圖3F、3F’)。

采用ImageJ軟件定量分析圖3A—F中IgM與pIgRL的共域化程度，分別使用綠色和紅色代表pIgRL和IgM陽性信號生成新的合并圖像(見圖4，a1—f1)。在黏膜層任選相同大小的矩形區(qū)域，構(gòu)建其3D模型圖，兩種陽性信號重合的像素點(diǎn)表示為藍(lán)色，代表IgM和pIgRL 共定位(見圖4，a2—f2)。通過ImageJ軟件對圖像進(jìn)行熒光校正以去除背景色可能產(chǎn)生的誤差，通過為每個通道自動設(shè)置閾值來消除背景顏色和噪音，繪制光密度圖，橫坐標(biāo)上的重疊像素為IgM與pIgRL的共定位區(qū)域(見圖4，a3—f3)，具體的百分比值以餅狀圖來表示(見圖4，a4—f4)。結(jié)果表明，所選矩形區(qū)域共包含150個像素點(diǎn)，免疫前(0 d)，IgM與pIgRL重疊像素占比19%，而 IgM和pIgRL單陽性信號占比分別為17%和24%，沒有熒光信號的區(qū)域占比40%；免疫后3 d時，二者共定位的百分比為25%，7 d時為41%，14 d時為 35%，21和28 d時為28%(見圖4，a4—f4)，表明腸黏膜層存在二者共定位，即存在IgM-pIgRL復(fù)合物的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)。

(圖A—F分別為免疫前(0 d)及免疫后3、5、7、14、21和28 d的圖像定量分析。圖a1—f1是圖3 A—F新生成的合并圖像，綠色和紅色分別表示 pIgRL和IgM陽性信號;圖a2—f2分別為圖a1—f1中所選矩形區(qū)域的3D模型圖；圖a3—f3為選定區(qū)域內(nèi)兩種熒光的光密度圖，分析IgM和pIgRL的共定位；圖a4—f4為IgM和pIgRL共定位百分比的餅狀圖。Fig.A—F: Quantitative image analysis at 0, 3, 5, 7, 14, 21 and 28 d respectively. Fig.a1—f1： A new merged image of Figures 3A—F using green and red to represent pIgRL and IgM positive signals, respectively; Fig.a2—f2: The interactive 3D surface plot of the selected rectangular area in Fig.a1—f1. Fig.a3—f3: Analysis of co-localization of IgM and pIgRL according to the optical density of the positive fluorescence in the selected area. Fig.a4—f4: A pie chart to show the percentage of IgM and pIgRL co-localization.)

3 討論

魚類的皮膚、鰓、消化道等黏膜組織是病原感染魚體時最先接觸的部位，其黏膜上皮屏障相比于陸生動物面臨更大的威脅，黏膜組織及其表面的黏液是魚類抵御外界病原入侵的第一道防線，而其局部的特異性免疫應(yīng)答對抵御病原體至關(guān)重要[3-4, 20]。pIgR介導(dǎo)SIgs的跨上皮分泌、抗原清除及中和病原體等功能在魚類的免疫防御及免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[21-22]。pIgRL作為pIgR的同源分子，已在大西洋鮭、斑馬魚、鯉、牙鲆等魚類中克隆表達(dá)[14-17]，但目前對其在黏膜免疫防御中的功能還知之甚少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)使用鰻弧菌滅活疫苗浸泡免疫牙鲆可誘導(dǎo)pIgRL基因在鰓、皮膚、脾和后腸中高表達(dá)，而注射免疫誘導(dǎo)pIgRL基因在脾、頭腎、皮膚和鰓中高表達(dá)，并在腸黏液、皮膚黏液和鰓黏液中檢測到pIgRL-IgM復(fù)合物[17]，表現(xiàn)出與牙鲆pIgR相似的響應(yīng)特征[13]，但其是否具有介導(dǎo)黏膜IgM分泌的功能尚未可知。本文在此基礎(chǔ)上，利用實(shí)驗(yàn)室前期制備的牙鲆pIgRL[17]及IgM特異性抗體[18]，研究滅活鰻弧菌免疫牙鲆后pIgRL和IgM在皮膚黏液、鰓黏液和腸黏液以及膽汁中的應(yīng)答變化，檢測了二者在腸黏膜上皮層的共定位情況，并利用ImageJ軟件進(jìn)行了定量分析確定存在二者共定位，證明牙鲆pIgRL可能具有類似pIgR介導(dǎo)IgM跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，pIgRL參與牙鲆的黏膜免疫防御。

疫苗接種是預(yù)防魚類疾病的有效措施，注射和浸泡免疫是常用的接種方式[23]。本文利用滅活鰻弧菌經(jīng)腹腔注射和浸泡兩種方式免疫牙鲆后，發(fā)現(xiàn)黏液(皮膚、鰓和腸)和膽汁中pIgRL和IgM蛋白水平均呈先升高后降低的趨勢；在皮膚、鰓和腸的黏液中pIgRL表達(dá)水平在浸泡免疫后的峰值時間(5、3和7 d)早于注射免疫后的峰值時間(7、5和10 d)，浸泡免疫誘導(dǎo)pIgRL蛋白水平變化與基因水平變化的結(jié)果一致[17]，表明浸泡免疫途徑能夠更早地刺激黏膜免疫應(yīng)答。對于黏膜IgM的響應(yīng)，浸泡組在牙鲆皮膚黏液、鰓黏液和腸黏液及膽汁中IgM分別于7、10、21和21 d達(dá)到峰值，與我們前期研究的結(jié)果一致[13]；注射組IgM在皮膚黏液和鰓黏液中于14 d達(dá)到峰值，在腸黏液和膽汁中于21 d達(dá)到峰值；皮膚黏液和鰓黏液中浸泡組IgM水平比注射組達(dá)到峰值點(diǎn)的時間早，說明浸泡免疫使得滅活疫苗直接接觸牙鲆皮膚和鰓，誘發(fā)了魚體的局部免疫應(yīng)答。但是注射組皮膚黏液和鰓黏液中IgM的峰值時間(14 d)與前期結(jié)果(21 d)有差異[13]，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)魚不是同一批次或黏液取樣操作差異所致。本文及前期結(jié)果[13]皆顯示，無論是浸泡還是注射免疫方式，pIgRL及pIgR的應(yīng)答皆早于IgM，這一結(jié)果與基因水平的變化具有相似特征[13, 17]，這表明牙鲆pIgRL和pIgR在免疫初期比IgM更早起作用，黏膜上皮更早表達(dá)pIgRL及pIgR可以為IgM的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)做準(zhǔn)備。

目前肝臟和膽汁在魚類免疫防御中起到的作用還不是很明確。Abelli[24]發(fā)現(xiàn)在北極硬骨魚(Trematomusbernacchii)的膽汁中存在Ig，肝門管區(qū)含有漿細(xì)胞，Abelli認(rèn)為Ig可能通過肝細(xì)胞運(yùn)輸進(jìn)入膽汁，然后釋放進(jìn)入腸道保護(hù)腸黏膜上皮，因此，可能與哺乳動物一樣,魚類的肝臟是黏膜Ig的分泌位置[23]，但尚缺乏肝膽運(yùn)輸?shù)闹苯幼C據(jù)。我們前期曾在牙鲆膽汁中檢測到滅活鰻弧菌誘導(dǎo)的IgM和pIgR上調(diào)表達(dá)以及IgM-pIgR復(fù)合物，表明肝臟也參與黏膜免疫[13]。本文在牙鲆膽汁中檢測到特異性IgM和pIgRL的存在，表明pIgRL可能也參與了膽汁IgM的分泌，但是，關(guān)于魚類pIgRL及pIgR如何參與膽汁IgM的分泌還有待進(jìn)一步研究。

關(guān)于魚類pIgRL組織分布的研究較少。斑馬魚免疫組織、淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中可檢測到pIgRL轉(zhuǎn)錄[15]。鯉魚pIgRL表達(dá)于巨噬細(xì)胞[16]。本研究中，免疫前pIgRL陽性信號主要出現(xiàn)在牙鲆腸黏膜固有層中，這與我們前期發(fā)現(xiàn)牙鲆pIgR主要表達(dá)于皮膚、鰓、腸及肝小管的上皮細(xì)胞有較大差異[12]，這暗示牙鲆pIgRL在黏膜免疫中的作用可能與pIgR存在差異。浸泡免疫后，IgM陽性信號在牙鲆腸黏膜固有層中逐漸增多，隨后在腸上皮細(xì)胞層中增強(qiáng)，腸腔中也逐漸出現(xiàn)陽性信號，顯示出從固有層向腸上皮細(xì)胞層、繼而向腸腔內(nèi)移動的趨勢。而免疫后pIgRL陽性信號在腸上皮層少量出現(xiàn)，固有層中觀察到較多代表IgM和pIgRL共定位的橙黃色熒光信號，ImageJ軟件定量分析發(fā)現(xiàn)，免疫前(0 d)二者共定位的百分比為19%，免疫后3、7、14和21 d時分別為25%、41%、 35%和28%，前期研究發(fā)現(xiàn)牙鲆皮膚黏液、鰓黏液和腸黏液中存在pIgRL-IgM復(fù)合物[16]，以上結(jié)果表明pIgRL和IgM以復(fù)合物的形式跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)，最后分泌至腸黏液中，這與腸黏液中IgM 及pIgRL水平隨時間延長而增高的結(jié)果相匹配。因此，牙鲆可能存在pIgRL介導(dǎo)的IgM跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，但pIgRL是否參與IgM的轉(zhuǎn)胞吞作用及pIgRL與pIgR功能的差異還有待進(jìn)一步研究。

目前在魚類中僅發(fā)現(xiàn)IgM、IgD和IgT三種免疫球蛋白。對虹鱒的研究發(fā)現(xiàn)，pIgR可與鰓和皮膚黏液中IgT、IgM和IgD結(jié)合，鰓和皮膚的上皮細(xì)胞呈現(xiàn)pIgR和IgT陽性，表明虹鱒pIgR可能在IgM、IgT和IgD轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用[25-26]，但對黏膜抗體的轉(zhuǎn)胞吞作用過程還有待深入研究。由于本實(shí)驗(yàn)室缺乏牙鲆IgT的特異性抗體，本文僅研究了牙鲆pIgRL及IgM對疫苗免疫的響應(yīng)特征，對于牙鲆pIgRL與IgT、IgD之間的關(guān)系還有待后續(xù)研究。