白 瑜，王 武，王 碧，李 穎，馮自立

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西省資源生物重點實驗室，漢中 723000)

20多種蛋白質(zhì)或多肽可以發(fā)生結(jié)構(gòu)錯誤折疊形成淀粉樣纖維，這些淀粉樣纖維沉積在機體組織或器官內(nèi)可導(dǎo)致相應(yīng)的淀粉樣變性疾病(amyloidosis)，如機體內(nèi)正常存在的朊蛋白(prion protein)發(fā)生錯誤折疊后形成了淀粉樣纖維，這種纖維聚集在中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致了人或動物的傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathy，TSE)，也稱朊病 (prion disease)。p. Leu102Ser突變的人溶菌酶(human lysozyme)蛋白也可形成淀粉樣纖維，導(dǎo)致家族性淀粉樣變性疾病。淀粉樣纖維的形成是導(dǎo)致淀粉樣變性疾病的關(guān)鍵原因。淀粉樣纖維相關(guān)蛋白質(zhì)或多肽也可在體外一定理化條件下形成淀粉樣纖維，如朊蛋白多肽PrP106-126在37 ℃、pH 7.5的磷酸緩沖液中孵育24 h可形成淀粉樣纖維，人溶菌酶蛋白在高溫57 ℃、pH 7.4條件下能夠形成淀粉樣纖維。蛋清溶菌酶(hen egg-white lysozyme，HEWL)與人溶菌酶蛋白在序列上有60.94%的相似性，蛋清溶菌酶蛋白在一定理化條件下也可形成淀粉樣纖維，且形成的淀粉樣纖維超微結(jié)構(gòu)與朊蛋白淀粉樣纖維及導(dǎo)致阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的Aβ(β-amyloid protein，Aβ)淀粉樣纖維有極大相似性。蛋清溶菌酶蛋白有129個氨基酸，二級結(jié)構(gòu)α螺旋含量30%～40%。正常朊蛋白中α螺旋約含42%，在其結(jié)構(gòu)錯誤折疊過程中，一部分α螺旋轉(zhuǎn)化成了β折疊，導(dǎo)致朊蛋白淀粉樣纖維中的α螺旋含量減少、β折疊含量顯著提高。蛋清溶菌酶蛋白在形成淀粉樣纖維過程中β折疊含量也顯著提高。蛋清溶菌酶蛋白已經(jīng)作為模型材料用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)錯誤折疊并組裝成淀粉樣纖維的過程。然而蛋清溶菌酶蛋白形成的淀粉樣纖維對細胞的生物學(xué)活性鮮見報道。因此本研究使用朊蛋白以及Aβ淀粉樣纖維研究中常用的人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y，探討一定理化條件下形成的蛋清溶菌酶淀粉樣纖維對SH-SY5Y神經(jīng)細胞的影響，為探究朊蛋白和其他蛋白質(zhì)淀粉樣纖維的形成機制及其致病性提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SH-SY5Y細胞購自上海酶研生物科技有限公司(編號CC-Y1459)，蛋清溶菌酶(EC 3.2.1.17)購自MCE公司，8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)購自SIGMA公司，甘氨酸購自MP公司，MEM/F-12培養(yǎng)基、Gluta-max添加劑、丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA) 和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco公司，MTT試劑盒、Hoechst 33342染色液購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器

T12透射電子顯微鏡購自FEI公司，Jasco-1500圓二色譜儀購自日本株式會社，Epoch紫外酶標(biāo)儀購自美國Bio Tek，Cary Eclipse熒光分光光度計購自安捷倫科技有限公司，OS60恒溫孵育搖床購自北京萊普特公司，Ti-S倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon。

1.3 蛋清溶菌酶淀粉樣纖維制備

使用pH 2.0的50 mmol·L甘氨酸溶液配制1 mmol·L天然蛋清溶菌酶蛋白作為儲備溶液。然后將100 μmol·L蛋清溶菌酶蛋白置于(57±0.1)℃、250 r·min搖床中孵育，每2 d收集孵育樣品，于-20 ℃保存。

1.4 透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)

取15 μL孵育的HEWL樣品緩慢滴加于200目無碳方華膜上，待樣品表面風(fēng)干，以磷鎢酸(phosphotungstic acid，PTA)負染30 s，吸去多余的染液后，再以超純水清洗20 s，室溫下干燥，使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)在100 kV電壓下觀察淀粉樣纖維的超微結(jié)構(gòu)。

1.5 疏水性檢測

使用ANS熒光試劑檢測淀粉樣纖維表面的疏水性，ANS熒光強度增加表示纖維的疏水性增強。以超純水稀釋HEWL樣品至終濃度為1 μmol·L，ANS使用濃度為10 μmol·L，HEWL樣品和ANS混勻后于室溫下避光孵育3 min，最后使用熒光分光光度計進行ANS熒光掃描，激發(fā)波長為380 nm， 波長范圍為420～600 nm，激發(fā)狹縫為5 nm， 發(fā)射狹縫為5 nm。

1.6 二級結(jié)構(gòu)檢測

使用圓二色譜法(Circular dichroism，CD)檢測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，檢測方法參考李穎等方法。然后使用儀器自帶的CD multivariate SSE軟件計算預(yù)測二級結(jié)構(gòu)中α螺旋和β折疊的含量。

1.7 神經(jīng)細胞培養(yǎng)及纖維處理

SH-SY5Y細胞在37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基：MEM/F12 培養(yǎng)基、1% Gluta-max、1% sodium pyruvate、1% NEAA、10%胎牛血清和1%雙抗。正常培養(yǎng)24 h 之后進行各組試驗處理。

將4～10 d不同聚集程度的蛋清溶菌酶淀粉樣纖維混合均勻，然后使用冷凍干燥機將纖維凍干處理，再將凍干的纖維溶解于完全培養(yǎng)基。纖維使用濃度分別為1、2和3 μmol·L，處理時間分別為12、24和48 h。pH 2.0甘氨酸溶液經(jīng)相同凍干處理后作用于SH-SY5Y細胞作為陰性對照。正常培養(yǎng)細胞作為空白對照組，每組6個重復(fù)。

1.8 細胞毒性檢測

SH-SY5Y細胞在96孔板中的接種密度為5×10·孔。按照MTT試劑盒操作說明，含90 μL培養(yǎng)基的細胞孔中加入10 μL MTT(5 mg·mL)至終濃度為0.5 mg·mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄含有MTT的舊培養(yǎng)基，然后加入100 μL甲瓚溶解劑(formazan solubilization solution)，輕輕振蕩10 min 以溶解沉淀物，最后使用酶標(biāo)儀測定570 nm的吸光度。細胞活力計算公式：細胞活力(%)=(OD/OD) ×100。

1.9 Hoechst 33342核染色

分別使用2 和3 μmol·L的淀粉樣纖維處理細胞48 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，無菌D-PBS洗滌細胞1次，加入Hoechst 33342染色液后在室溫條件下避光孵育30 min，最后置于倒置熒光顯微鏡下觀察染色后的細胞核。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 HEWL纖維的超微結(jié)構(gòu)

HEWL蛋白在57 ℃、pH 2.0甘氨酸溶液中孵育，4 d后，在TEM下觀察到少量淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)(圖1 A)，8～10 d后觀察到大量纖維(圖1 B和C)，且4、8和10 d形成的纖維超微結(jié)構(gòu)相同，均呈短桿狀，直徑約20 nm，纖維中心有長軸。經(jīng)凍干處理后，淀粉樣纖維的超微結(jié)構(gòu)保持不變(圖1 D)。

A. 4 d；B. 8 d；C. 10 d；D. 凍干后的HEWL淀粉樣纖維A. 4 d；B. 8 d；C. 10 d；D. HEWL fibrils after lyophilization圖1 HEWL淀粉樣纖維的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructures of HEWL fibrils

2.2 HEWL纖維的疏水性

天然HEWL蛋白與ANS熒光試劑結(jié)合后產(chǎn)生的熒光強度較低，而HEWL淀粉樣纖維與ANS結(jié)合后產(chǎn)生的熒光強度顯著增加，且8 d時纖維產(chǎn)生的ANS熒光強度明顯高于4 d時(圖2)，表明HEWL蛋白在形成淀粉樣纖維之后的疏水性明顯提高，且隨著纖維數(shù)量增多，疏水性增強。

圖2 ANS熒光法檢測HEWL淀粉樣纖維的疏水性Fig.2 Hydrophobicity of HEWL fibrils by ANS fluorescence method

2.3 HEWL纖維的二級結(jié)構(gòu)含量變化

圓二色譜檢測結(jié)果顯示，天然HEWL蛋白(0 d) 在約208 nm處出現(xiàn)最低橢圓率，表示二級結(jié)構(gòu)中主要是α螺旋(圖3)，使用圓二色譜儀(Jasco-1500)自帶CD multivariate SSE軟件計算的α螺旋和β折疊含量分別為30.6%和20.8%(表1)。4和8 d形成的HEWL纖維在約218 nm處出現(xiàn)最低橢圓率，表示二級結(jié)構(gòu)中主要是β折疊，且4 d時HEWL纖維的α螺旋和β折疊含量分別為22.5%和29.6%，8 d時分別為12.8%和37.1%，表明隨著HEWL纖維的形成和生長，α螺旋含量逐漸降低，而β折疊含量逐漸升高。

圖3 HEWL淀粉樣纖維的二級結(jié)構(gòu)測定Fig.3 Secondary structure detection of HEWL fibrils by CD method

2.4 HEWL纖維對SH-SY5Y細胞的毒性

將4～10 d產(chǎn)生的HEWL淀粉樣纖維混合后以不同濃度處理培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞。1、2和3 μmol·LHEWL淀粉樣纖維分別處理細胞12、24和48 h后均極顯著降低了細胞活力(<0.01)，處理12 h的細胞活力分別為75.16%±15.51%、67.54%±12.13%和67.89%±10.26%(圖4 A)；處理24 h的細胞活力分別為75.78%±13.01%、58.41%±5.55%和61.90%±8.94%(圖4 B)，處理48 h的細胞活力分別為71.59%±14.75%、55.65%±5.78%和46.45%±6.23%(圖4 C)。pH 2.0甘氨酸溶液作為陰性對照，處理細胞48 h未影響SH-SY5Y細胞的細胞活力(>0.05)。結(jié)果表明：HEWL淀粉樣纖維對SH-SY5Y神經(jīng)細胞具有較強的毒性，且毒性呈時間依賴性和纖維濃度依賴性。

表1 二級結(jié)構(gòu)含量變化

A. 12 h；B. 24 h；C. 48 h；pH 2.0甘氨酸溶液作為陰性對照；數(shù)據(jù)以表示(n=6)，與空白對照組相比，**.P<0.01A. 12 h；B. 24 h；C. 48 h；Glycine solution of pH 2.0 as the negative control；Data were expressed as (n=6), compared with control, **.P<0.01圖4 HEWL淀粉樣纖維對細胞活力的影響Fig.4 Effects of HEWL amyloid fibrils on cell viability

同時，HEWL纖維處理SH-SY5Y神經(jīng)細胞48 h之后，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)：空白對照組和陰性對照組的SH-SY5Y神經(jīng)細胞生長正常，細胞呈梭形，神經(jīng)突起細長并相互交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)狀(圖5 A和5 B)，而2～3 μmol·LHEWL纖維處理組的細胞胞體變圓且體積收縮，神經(jīng)突起斷裂導(dǎo)致細胞間交聯(lián)消失，甚至細胞數(shù)量減少(圖5 C和5 D)。Hoechst 33342核染色結(jié)果顯示：HEWL纖維在處理SH-SY5Y神經(jīng)細胞48 h之后，空白對照組(圖5A)和陰性對照組(圖5 B)細胞的細胞核均發(fā)出微弱、彌散、均勻的藍光，且染色質(zhì)分布均勻，細胞核正常；2 μmol·L(圖5 C)和3 μmol·L(圖5 D)的HEWL纖維導(dǎo)致細胞核出現(xiàn)核濃縮、核碎裂、染色質(zhì)邊移等典型的細胞凋亡特征，且與空白對照組相比，視野下細胞數(shù)量明顯減少。該結(jié)果進一步表明HEWL纖維可造成SH-SY5Y神經(jīng)細胞的明顯凋亡。

A. 空白對照組；B. 陰性對照組；C. 2 μmol·L-1 HEWL纖維處理組；D. 3 μmol·L-1 HEWL纖維處理組。第一行為Hoechst 33342核染色結(jié)果；第二行是白光視野圖；箭頭所示為凋亡細胞A. Control；B. Negative control；C. 2 μmol·L-1 HEWL fibrils；D. 3 μmol·L-1 HEWL fibrils. The pictures in the first row are the results of Hoechst 33342 nuclear staining; The pictures in the second row are the results of white light field; White arrows indicated the apoptotic cells圖5 HEWL淀粉樣纖維引起的細胞形態(tài)學(xué)變化Fig.5 Morphological changes of cells induced by HEWL amyloid fibrils

3 討 論

淀粉樣纖維在體內(nèi)主要沉積于細胞間質(zhì)，導(dǎo)致細胞淀粉樣變(amyloid change)。朊蛋白淀粉樣纖維和Aβ淀粉樣纖維不僅在形態(tài)學(xué)上相同，而且在理化屬性上具相似性，包括疏水性增強和β折疊含量提高。與淀粉樣變性疾病不相關(guān)的蛋清溶菌酶蛋白在一定理化條件下也能夠發(fā)生去折疊過程形成淀粉樣纖維，已經(jīng)作為蛋白模型材料來研究淀粉樣纖維的形成機制。

本研究使用蛋清溶菌酶蛋白在57 ℃、pH 2.0甘氨酸溶液孵育4 d后形成了淀粉樣纖維，孵育8～10 d后纖維大量形成，纖維的超微結(jié)構(gòu)呈短桿狀且中心有軸, 直徑約20 nm，與朊蛋白纖維和Aβ淀粉樣纖維的超微結(jié)構(gòu)相似，證明了由不同結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)形成的淀粉樣纖維在形態(tài)學(xué)上極相似。分子動力學(xué)模擬和試驗研究都證實了朊蛋白易在高溫、酸性條件下形成淀粉樣纖維，如朊蛋白多肽H2(helix 2，H2)在pH 2.9條件下形成了淀粉樣纖維。與朊蛋白相似，蛋清溶菌酶蛋白在高溫及酸性條件下能夠形成淀粉樣纖維，如57 ℃、 pH 2.2，65 ℃、pH 2.0和45～55 ℃、pH 3.8等條件；Feng等研究表明，pH 2.2甘氨酸溶液中57 ℃比45 ℃較易形成淀粉樣纖維。高溫和酸性環(huán)境可以通過改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)間相互作用以促進蛋白質(zhì)的部分變性和去折疊過程，進一步誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集和形成淀粉樣纖維。因此，高溫和酸性環(huán)境是影響淀粉樣纖維形成的兩個重要因素。此外，與天然HEWL蛋白相比，HEWL淀粉樣纖維表面的疏水性增強，且8 d時的疏水性高于4 d，表明高溫和酸性環(huán)境使蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域暴露程度增加，進一步驅(qū)動了纖維的形成和生長，證實了疏水區(qū)域暴露程度的增加能夠促進蛋白質(zhì)的去折疊和錯誤折疊過程；經(jīng)圓二色譜法測定并使用自帶CD multivariate SSE軟件計算預(yù)測顯示，與天然HEWL蛋白二級結(jié)構(gòu)含量相比，孵育4和8 d的二級結(jié)構(gòu)α螺旋含量分別降低了8.1%和17.8%，而β折疊含量分別提高了8.8%和16.3%，表明隨著HEWL淀粉樣纖維的形成和生長，一部分α螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成了β折疊結(jié)構(gòu)，這與朊蛋白形成淀粉樣纖維時發(fā)生了二級結(jié)構(gòu)從α螺旋轉(zhuǎn)化成β折疊的過程相似。分子動力學(xué)模擬證實β折疊結(jié)構(gòu)的形成驅(qū)動了蛋白組裝成淀粉樣纖維，因此，α螺旋轉(zhuǎn)變成β折疊也是HEWL淀粉樣纖維形成的重要驅(qū)動力。

該HEWL淀粉樣纖維對培養(yǎng)的SH-SY5Y神經(jīng)細胞產(chǎn)生了明顯的毒性作用。HEWL纖維在較低濃度1 μmol·L處理細胞12 h已引起了極顯著的細胞毒性，當(dāng)處理時間延長至24和48 h時，或者使纖維濃度增加至2和3 μmol·L時，細胞毒性效果均逐漸增強，表明HEWL淀粉樣纖維對SH-SY5Y神經(jīng)細胞的毒性作用呈現(xiàn)時間依賴性和濃度依賴性；細胞形態(tài)學(xué)變化結(jié)果進一步證明，HEWL淀粉樣纖維引起了SH-SY5Y神經(jīng)細胞的凋亡。而使用pH 2.0甘氨酸溶液作為陰性對照，處理SH-SY5Y細胞48 h后未產(chǎn)生明顯的影響，表明神經(jīng)細胞毒性是由HEWL淀粉樣纖維引起的。

4 結(jié) 論

蛋清溶菌酶蛋白在一定理化條件下可形成具有神經(jīng)細胞毒性的淀粉樣纖維。作者推測淀粉樣纖維的神經(jīng)細胞毒性取決于纖維結(jié)構(gòu)本身，而不依賴于蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能。然而HEWL淀粉樣纖維對SH-SY5Y神經(jīng)細胞的毒性機制有待進一步研究。