山慈菇提取物調(diào)控circ_0003998/miR-330-5p表達(dá)對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

龐真貞，蔡志宇，王小苗，鄒 怡，王 良

(1.保定市第一中心醫(yī)院a.口腔一科； b.導(dǎo)管室，河北 保定 071000； 2.定州市人民醫(yī)院口腔科，河北 定州 073000； 3.唐山市豐潤(rùn)區(qū)人民醫(yī)院口腔科，河北 唐山064000； 4.河北省易縣醫(yī)院口腔科，河北 易縣 074200)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)是最常見的口腔癌類型，雖然多種現(xiàn)代手術(shù)技術(shù)和策略用于治療口腔鱗癌，但由于局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，口腔鱗癌的病死率、5年生存率仍未改變[1]。近年來，多種中藥化合物已用于癌癥治療并顯示良好療效。山慈菇是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，性寒味甘，具有清熱解毒、化痰散結(jié)功效。目前研究[2-3]證實(shí)山慈菇提取物通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲在乳腺癌中表現(xiàn)出顯著抗腫瘤作用。山慈菇提取物可能通過調(diào)控微小RNA(miR)-329-3p表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。但山慈菇提取物對(duì)口腔鱗癌生物學(xué)行為的影響尚未見報(bào)道。環(huán)狀RNA 0003998(circ_0003998)是近年發(fā)現(xiàn)的癌基因，circ_0003998高表達(dá)與肝癌患者的總生存率較差相關(guān)[5]。非小細(xì)胞肺癌中circ_0003998上調(diào)與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，下調(diào)circ_0003998對(duì)癌細(xì)胞的增殖和侵襲有抑制作用[6]。生物信息學(xué)顯示miR-330-5p是circ_0003998潛在靶點(diǎn)。miR-330-5p已被證實(shí)在皮膚惡性黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中具有抗增殖、抗侵襲作用[7-8]，但circ_0003998是否靶向miR-330-5p參與口腔鱗癌進(jìn)展尚不清楚。本研究以口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27為研究對(duì)象，通過體外實(shí)驗(yàn)分析山慈菇提取物對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及circ_0003998、miR-330-5p表達(dá)的影響，驗(yàn)證circ_0003998靶向miR-330-5p在口腔鱗癌進(jìn)展中的作用，旨在探討山慈菇提取物抗口腔鱗癌的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源

21例口腔鱗癌組織和對(duì)應(yīng)正?？谇火つそM織均取自2018年3月至2019年3月間在保定市第一中心醫(yī)院接受手術(shù)的口腔鱗癌患者，其中男16例，女5例；年齡35～73歲，平均(57.1±7.20)歲。腫瘤組織經(jīng)病理診斷證實(shí)為口腔鱗癌組織，所有患者術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療。

1.1.2 細(xì)胞和試劑

人口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27、人口腔黏膜上皮細(xì)胞(武漢普諾賽生物科技有限公司)；山慈姑(亳州市弘寶堂商貿(mào)有限公司)；Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；羊抗兔IgG二抗、兔源E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(上海艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司)；cDNA合成試劑盒、SYBR Green PCR master mix(北京百奧萊博科技有限公司)；一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；熒光素酶報(bào)告載體、circ_0003998小干擾RNA(si-circ_0003998)及其陰性對(duì)照(si-NC)、miR-330-5p模擬物(mimics)及其陰性對(duì)照、miR-330-5p抑制物(anti-miR-330-5p)、circ_0003998過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-circ_0003998)(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 山慈姑提取物的制備

參照興偉等[3]實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，將山慈菇粉碎，加入去離子水浸泡2 h，水煎法制備山慈菇提取液，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，制備山慈菇提取液濃度為1 g·mL-1，高壓滅菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 山慈姑提取物濃度篩選

將對(duì)數(shù)期CAL-27細(xì)胞、人口腔黏膜上皮細(xì)胞以5×103個(gè)·孔-1的密度接種96孔板，貼壁后，分別用含0、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg·mL-1山慈姑提取物DMEM培養(yǎng)基孵育細(xì)胞48 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔光密度(OD)值。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)circ_0003998和miR-330-5p表達(dá)

trizol試劑抽提正?？谇火つそM織、口腔鱗癌組織的總RNA。分別用cDNA合成試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成circ_0003998、miR-330-5p的cDNA。利用SYBR Green PCR master mix配置反應(yīng)體系進(jìn)行RT-qPCR。circ_circ_0003998上游5′-AAAGAGGCTCATCACTGTCAGG-3′，下游5′-GGACTGGGGTTTTGACTG GAT-3′；miR-330-5p上游5′-TCCTCTGGGCCTGTGTCTTAG-3′，下游5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；GAPDH上游5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′，下游5′-CCAGGCGCCCAATACG-3′。2-ΔΔCt方法計(jì)算circ_0003998、miR-330-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

分別用含0、2、6.6、20 mg·mL-1山慈姑提取物[3]的DMEM培養(yǎng)液置于5%CO2體積分?jǐn)?shù)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞CAL-27，依次記為對(duì)照組、山慈菇低劑量組、山慈菇中劑量組、山慈菇高劑量組。孵育48 h后，每組取5×102個(gè)CAL-27細(xì)胞接種到6孔板，常規(guī)培養(yǎng)2周。然后用甲醇固定菌落，0.5%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下統(tǒng)計(jì)>50個(gè)細(xì)胞的有效集落以表示細(xì)胞增殖能力。

1.2.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

將山慈姑提取物處理48 h的CAL-27細(xì)胞接種于6孔板上，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合80%時(shí)，用移液槍頭尖端在細(xì)胞表面單層細(xì)胞上劃一條直線。顯微鏡下測(cè)量初始劃痕距離和培養(yǎng)24 h后劃痕距離。以初始劃痕寬度和培養(yǎng)24 h劃痕寬度的差值表示遷移距離。

1.2.6 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲

山慈姑提取物處理48 h后，將1×105個(gè)CAL-27細(xì)胞懸浮于無血清DMEM中接種于Transwell(包被基質(zhì)膠)上室，將含10%胎牛血清的培養(yǎng)基接種于下室。孵育24 h后，除去上室膜殘留細(xì)胞，甲醇固定下室膜貼壁細(xì)胞，0.5%結(jié)晶紫染色。以顯微鏡下隨機(jī)3個(gè)視野細(xì)胞數(shù)均值表示細(xì)胞侵襲能力。

1.2.7 蛋白質(zhì)印記檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

用放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)緩沖液裂解山慈姑提取物處理48 h后CAL-27細(xì)胞，取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜置于塑料盒，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，再用一抗4 ℃孵育過夜。最后用二抗孵育膜1 h?；瘜W(xué)發(fā)光顯色，避光條件顯影、定影。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.8 RT-qPCR檢測(cè)山慈姑提取物對(duì)circ_0003998和miR-330-5p表達(dá)的影響

山慈姑提取液處理CAL-27細(xì)胞48 h后，trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA。按1.2.2步驟進(jìn)行RT-qPCR以檢測(cè)circ_0003998和miR-330-5p表達(dá)水平。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證circ_0003998和miR-330-5p靶向關(guān)系

circRNA RNA interactome預(yù)測(cè)到miR-330-5p是circ_0003998的潛在靶基因?；赾irc_0003998和miR-330-5p結(jié)合位點(diǎn)序列構(gòu)建circ_0003998野生序列，并將其克隆到熒光素酶基本載體構(gòu)建野生型(WT-)熒光素酶報(bào)告載體WT-circ_0003998。同時(shí)突變與miR-330-5p結(jié)合位點(diǎn)的circ_0003998序列，構(gòu)建突變熒光素酶報(bào)告載體MUT-circ_0003998。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將WT-circ_0003998或者M(jìn)UT-circ_0003998分別與miR-330-5p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染CAL-27細(xì)胞，48 h后用熒光素酶活性測(cè)定試劑盒分析細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.2.10 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將2×105個(gè)對(duì)數(shù)期CAL-27細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)過夜，然后使用Lipofectamine 2000試劑盒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si-circ_0003998、si-NC、miR-330-5p mimics、miR-NC、pcDNA-circ_0003998、anti-miR-330-5p至CAL-27細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞。轉(zhuǎn)染si-circ_0003998、si-NC、miR-330-5p mimics、miR-NC的細(xì)胞標(biāo)記為si-circ_0003998組、si-NC組、miR-330-5p組、miR-NC組。用含20 mg·mL-1山慈姑提取物的培養(yǎng)液孵育未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染pcDNA-circ_0003998或轉(zhuǎn)染anti-miR-330-5p細(xì)胞48 h，依次記為山慈菇組、山慈菇+pcDNA-circ_0003998組、山慈菇+anti-miR-330-5p組。

1.2.11 circ_0003998和miR-330-5p表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響分析

收集si-circ_0003998組、si-NC組、miR-330-5p組、miR-NC組、山慈菇組、山慈菇+pcDNA-circ_0003998組、山慈菇+anti-miR-330-5p組CAL-27細(xì)胞，按照1.2.3、1.2.4、1.2.5、1.2.6、1.2.7方法分析circ_0003998和miR-330-5p表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 山慈菇提取物對(duì)口腔黏膜上皮細(xì)胞及口腔鱗癌細(xì)胞的影響及circ_0003998和miR-330-5p在口腔鱗癌組織中的表達(dá)

CCK-8檢測(cè)山慈菇提取物對(duì)CAL-27細(xì)胞和口腔黏膜上皮細(xì)胞活力的影響結(jié)果見圖1A：0～25 mg·mL-1山慈菇提取物對(duì)口腔黏膜上皮細(xì)胞活力無顯著影響，當(dāng)其濃度>25 mg·mL-1時(shí)口腔黏膜上皮細(xì)胞活力呈下將趨勢(shì)；而0～25 mg·mL-1山慈菇提取物對(duì)CAL-27細(xì)胞活力的抑制作用具有濃度依賴性，當(dāng)其濃度>25 mg·mL-1時(shí)CAL-27細(xì)胞活力趨于平穩(wěn)。與正?？谇火つそM織比較，口腔鱗癌組織中circ_0003998表達(dá)量升高(P<0.05)，miR-330-5p表達(dá)量降低(P<0.05)，見圖1B—C。

A：CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力；B：circ_0003998在口腔鱗癌組織中的表達(dá)；C：miR-330-5p在口腔鱗癌組織中的表達(dá)。*P<0.05。

2.2 山慈菇提取物對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

低、中、高劑量的山慈菇提取物處理CAL-27細(xì)胞48 h后，E-cadherin蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，細(xì)胞集落形成數(shù)、遷移距離、侵襲數(shù)量、N-cadherin蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。隨著山慈菇提取物濃度的增加，其對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響逐漸增強(qiáng)。見表1和圖2。

A：E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)量,*P<0.05與對(duì)照組相比,#P<0.05與山慈菇低劑量組相比,△P<0.05與山慈菇中劑量組相比；B：細(xì)胞集落形成；C：細(xì)胞遷移；D：細(xì)胞侵襲。

表1 山慈菇提取物對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.3 山慈菇提取物對(duì)CAL-27細(xì)胞中circ_0003998、miR-330-5p的影響

低、中、高劑量的山慈菇提取物處理CAL-27細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中circ_0003998表達(dá)量降低(P<0.05)，而miR-330-5p表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖3。

*P<0.05與對(duì)照組相比，#P<0.05與山慈菇低劑量組相比，△P<0.05與山慈菇中劑量組相比。

2.4 circ_0003998靶向miR-330-5p

circRNA RNA interactome預(yù)測(cè)到circ_0003998與miR-330-5p序列間存在特異性互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖4A。相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果見圖4B，與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-330-5p mimics的CAL-27細(xì)胞中WT-circ_0003998的相對(duì)熒光素酶活性降低(P<0.05)，但轉(zhuǎn)染miR-330-5p mimics的CAL-27細(xì)胞中MUT-circ_0003998的相對(duì)熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。

*P<0.05與miR-NC組相比。

2.5 過表達(dá)circ_0003998或抑制miR-330-5p逆轉(zhuǎn)山慈菇提取物對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖遷移侵襲的作用

與山慈菇組比較，山慈菇+pcDNA-circ_0003998組、山慈菇+anti-miR-330-5p組CAL-27細(xì)胞集落形成數(shù)、遷移距離、侵襲數(shù)量、N-cadherin蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。見圖5和表2。

A:circ_0003998表達(dá)量；*P<0.05與山慈菇組相比；B：miR-330-5p表達(dá)量；C：E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)量；D：細(xì)胞集落形成。

E：細(xì)胞遷移；F：細(xì)胞侵襲。

表2 circ_0003998和miR-330-5p對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

3 討論

山慈菇為蘭科植物杜鵑蘭、獨(dú)蒜蘭的假鱗莖，《本草新編》《本草拾遺》等中藥典籍對(duì)其藥理作用均有記載。現(xiàn)代藥理研究[9]表明，山慈菇除具有降壓、抗菌、治療痛風(fēng)等作用外，還具有開發(fā)成抗癌藥物的潛力。吳俊林等[10]研究發(fā)現(xiàn)山慈菇可上調(diào)促凋亡基因B細(xì)胞淋巴瘤(BCL)-2表達(dá)，抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖。林曉燕等[11]指出，山慈菇水煎劑能夠降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞U118的增殖、侵襲和遷移能力。此外，山慈菇提取物對(duì)乳腺癌大鼠腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)和腫瘤生長(zhǎng)具有抑制作用[12]。本研究結(jié)果表明，山慈菇提取物可顯著降低CAL-27細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，且濃度增加，其抑制作用增強(qiáng)，與上述抗腫瘤作用一致。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是口腔鱗癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)表型、失去細(xì)胞極性獲得遷移能力[13]。山慈菇提取物可能通過抑制EMT進(jìn)程發(fā)揮抗遷移、侵襲作用。李雪蓮等[14]發(fā)現(xiàn)山慈菇提取物可影響EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白表達(dá)從而抑制乳腺癌EMT，抑制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明山慈菇提取物可抑制口腔鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為。

circ_0003998是一種已知的致癌circRNA，circ_0003998表達(dá)增加與非小細(xì)胞肺癌患者較短的總生存期有關(guān)，并促進(jìn)肺腺癌多西他賽耐藥，下調(diào)circ_0003998可降低肺腺癌細(xì)胞多西他賽耐藥性，抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡[6,15]。肝癌中circ_0003998高表達(dá)與肝癌患者的侵襲性特征相關(guān)，并促進(jìn)肝癌EMT[16]。miR-330-5p是一種癌癥相關(guān)基因，有研究[17-18]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子6(PCAT6)、circ_0001727均通過調(diào)節(jié)miR-330-5p表達(dá)來抑制非小細(xì)胞肺癌增殖和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌組織中circ_0003998表達(dá)上調(diào)，miR-330-5p表達(dá)下調(diào)，而山慈菇提取物可誘導(dǎo)miR-330-5p表達(dá)，抑制circ_0003998表達(dá)，且由于miR-330-5p受到circ_0003998的靶向負(fù)性調(diào)控，過表達(dá)circ_0003998或抑制miR-330-5p表達(dá)還可逆轉(zhuǎn)山慈菇提取物對(duì)CAL-27增殖、遷移和侵襲，并恢復(fù)其惡性生物學(xué)行為，這表明在口腔鱗癌中circ_0003998/miR-330-5p分子軸介導(dǎo)山慈菇提取物的抗癌作用。

綜上所述，山慈菇提取物通過下調(diào)circ_0003998/miR-330-5p分子軸對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲發(fā)揮抑制作用，這揭示了山慈菇提取物的抗癌機(jī)制，為開發(fā)山慈菇提取物成為口腔鱗癌化療藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。