桂附地黃丸（濃縮丸）中熟地黃的薄層色譜鑒別方法的建立

魏艷蕓,王月玲，王 蕙

（蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，甘肅 蘭州 730050）

桂附地黃丸（濃縮丸）由熟地黃、附子、肉桂、澤瀉、山藥、山茱萸、茯苓及牡丹皮等八味藥組成，該處方是由漢代張仲景《金匱要略》加減而來，具有溫補(bǔ)腎陽之功效，全方溫而不燥，補(bǔ)而不膩，故得到極為廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，桂附地黃丸具有改善腎功能、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防腫瘤、抗突變、延緩衰老及對(duì)抗活性自由基的作用，還有降血糖及改善胰島素耐受性、改善高脂血癥，升高高密度脂蛋白、促進(jìn)造血功能恢復(fù)、改善微循環(huán)、降血壓、促進(jìn)性激素分泌，預(yù)防電離輻射損傷等作用[1-6]。其中，該方以熟地黃滋陰補(bǔ)血，填精補(bǔ)髓為主藥。熟地黃是玄參科植物地黃（Rehmannia Glutinosa Libosch）新鮮或者干燥塊根經(jīng)過蒸制或者酒燉而來，味屬甘，性微溫；歸肝；滋陰補(bǔ)血,益精填髓，用于貧血，月經(jīng)不調(diào),崩漏下血，肝腎陰虛，腰膝酸軟，盜汗遺精，暈厥，耳鳴，須發(fā)早白之效，熟地黃被冠為“壯水之主，補(bǔ)血之君”“補(bǔ)精之王”等稱號(hào)[7-10]。

目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)桂附地黃其他劑型的制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究均已比較完善[11-12]，而桂附地黃丸（濃縮丸）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)滯后，其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)自1993年收入衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第八冊(cè)以來，再未進(jìn)行過任何修訂，標(biāo)準(zhǔn)正文項(xiàng)下考察了性狀、鑒別和含量測(cè)定3個(gè)項(xiàng)目，鑒別項(xiàng)下僅對(duì)粉末入藥的牡丹皮、附子（制）、肉桂、山藥進(jìn)行了顯微鑒別，對(duì)浸膏入藥的主藥熟地黃無任何鑒別方法。

為保證藥品質(zhì)量，患者安全用藥，確保藥物療效，本研究以熟地黃對(duì)照藥材為參照標(biāo)準(zhǔn)，通過考察各薄層色譜影響條件，旨在建立一種熟地黃的薄層色譜鑒別方法，為桂附地黃丸（濃縮丸）的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 試劑與儀器

硅膠G板（青島海洋化工廠）規(guī)格：10 cm×10 cm，厚度0.2～0.25 mm；10 cm×20 cm，厚度0.2～0.25 mm；硅膠GF254板（青島海洋化工廠）規(guī)格：10 cm×10 cm，厚度0.2～0.25 mm；層析缸（上海信誼儀器廠）；數(shù)顯干燥箱（DHG-90708）；薄層半自動(dòng)（點(diǎn)樣）成像系統(tǒng)（Visualizer/linomat5）；超聲波清洗機(jī)（SB25-12DT）；數(shù)控恒溫水浴鍋（SCG-2）；試劑均為分析純。

1.2 對(duì)照藥材

熟地黃對(duì)照藥材，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121196-202007，規(guī)格1 g。

1.3 供試品

桂附地黃丸（濃縮丸），各批次樣品信息見表1。

表1 桂附地黃丸（濃縮丸）各批次樣品信息

續(xù)表1

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜條件優(yōu)化

2.1.1 供試品溶液制備方法考察

用以下3種方法制備供試品溶液，在不同色譜條件下進(jìn)行展開。

方法（1）：稱取本品2.5 g，研細(xì)，加100 mL水，溫?zé)崾怪浞秩苌ⅲ偌訜嶂练序v，冷卻，用脫脂棉進(jìn)行濾過，取濾液，濾液用乙酸乙酯提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使之充分溶解，即得。

方法（2）：稱取本品2.5 g，研細(xì)，加20 mL乙醇，冷浸24 h，濾紙濾過，濾液水浴濃縮至1 mL，即得。

方法（3）：稱取本品2.5 g，研細(xì)，加80%甲醇溶液50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)屑尤? mL水使之溶解，再用水飽和正丁醇溶液振蕩提取4次，每次10 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使之充分溶解，即得。

通過不同展開劑展開，不同條件顯色比較，結(jié)果顯示，以方法（1）制備的供試品溶液，在薄層色譜圖中主成分斑點(diǎn)清晰，與對(duì)照藥材溶液顯現(xiàn)的斑點(diǎn)較為一致，且分離效果好；以方法（2）、（3）制備的供試品溶液顯現(xiàn)斑點(diǎn)較少。故選擇方法（1）進(jìn)行供試品溶液制備，見圖1。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液制備

稱取熟地黃對(duì)照藥材2 g，加乙醇20 mL，冷浸24 h，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶液使之溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液制備

按照桂附地黃丸（濃縮丸）的處方比例，稱取缺熟地黃的各味藥材，模擬處方制得缺少熟地黃的陰性對(duì)照樣品（稱取澤瀉、茯苓各2.22 g研碎成粗粉，過2號(hào)篩，加水20 mL煎煮兩次，每次煎煮時(shí)間2 h，合并煎液，過濾，濾液合并，濃縮；稱取山茱萸2.96 g、牡丹皮2.22 g，用70%乙醇為溶劑浸漬24 h，回收乙醇，再濃縮，稱取剩余藥物肉桂0.74 g、附子0.74 g、山藥2.96 g粉碎成細(xì)粉，與上述各濃縮液混合均勻，即得）。然后再按照供試品溶液制備方法（1）制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 展開系統(tǒng)考察

選擇4種展開系統(tǒng)，分別點(diǎn)樣，進(jìn)行薄層色譜條件考察：①硅膠G板，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑；②硅膠G板，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑；③硅膠G板，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）為展開劑；④硅膠GF254板，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑。

通過在不同條件下顯色，結(jié)果顯示，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）或三氯甲烷-甲醇（12∶1）為展開劑時(shí)，各主斑點(diǎn)比移值較小，不能做到斑點(diǎn)有效分離；以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，在硅膠G板或硅膠GF254板上展開時(shí)，各主斑點(diǎn)顯色清晰，展開距離適中，分離效果好。故選擇以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，見圖1。

2.1.5 顯色方法及檢視條件考察

選擇三種顯色方法，對(duì)不同展開條件的薄層板顯色觀察：①晾干，噴以2,4-二硝基苯肼乙醇試液，日光下檢視；②晾干，噴以二硝基苯肼試液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視；③晾干，噴以2%硫酸香草醛，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光燈下檢視；④在紫外光（254 nm）下檢視。

結(jié)果顯示，以二硝基苯肼試液為顯色劑，各主斑點(diǎn)顯色良好，而在105 ℃加熱后，各斑點(diǎn)顯色更為清晰；以2%硫酸香草醛為顯色劑時(shí)，對(duì)照主斑點(diǎn)不能良好顯色；在254 nm紫外燈下檢視時(shí)，對(duì)照主斑點(diǎn)亦顯色不清晰。故選擇噴以二硝基苯肼試液為顯色劑，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視，見圖1。

圖1 桂附地黃丸（濃縮丸）中熟地黃薄層鑒別色譜條件優(yōu)化圖譜

利用不同展開系統(tǒng)及不同顯色方法，對(duì)各供試品溶液照薄層色譜法試驗(yàn)。取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液，日光下檢視（見圖1 1A）；取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視（見圖1 1B）；取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%硫酸香草醛試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視（見圖1 1C）；取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液，日光下檢視（見圖1 2A）；取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視（見圖1 2B）；取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%硫酸香草醛試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視（見圖1 2C）；取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液，日光下檢視（見圖1 3A）；取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視（見圖1 3B）；取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇（12∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%硫酸香草醛試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視（見圖1 3C）；取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液分別點(diǎn)于同一硅膠GF254板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光（254 nm）下檢視（見圖1 4D）。

通過不同供試品溶液制備方法考察、不同展開系統(tǒng)以及不同顯色方法考察，上述圖譜中，2B圖譜顯示最優(yōu)。確定采用方法（1）制備供試品溶液，在硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑展開，噴以二硝基苯肼試液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)明顯呈現(xiàn)，日光下檢視，所得熟地黃薄層色譜分離效果和顯色效果較佳，斑點(diǎn)清晰，且陰性對(duì)照無干擾，為最優(yōu)薄層色譜條件。

2.1.6 點(diǎn)樣量考察

吸取供試品溶液各1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL點(diǎn)于同一張硅膠G薄層板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑展開，噴以二硝基苯肼試液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)明顯呈現(xiàn)，日光下檢視。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)樣量為5 μL時(shí)，斑點(diǎn)清晰，分離效果好，1 μL、2 μL的斑點(diǎn)含量過低成像不清晰，10 μL、20 μL的斑點(diǎn)有明顯拖尾現(xiàn)象。故選擇點(diǎn)樣量為5 μL，見圖2。

圖2 點(diǎn)樣量考察薄層色譜圖

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 專屬性及精密度考察

分別吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性對(duì)照溶液各5 μL點(diǎn)于硅膠G薄層板上，供試品溶液重復(fù)點(diǎn)樣6次，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑展開，噴以二硝基苯肼試液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)明顯呈現(xiàn)，日光下檢視。結(jié)果表明，供試品中比移值（Rf）為0.41的棕黃色條帶和Rf為0.59的黃色條帶所呈現(xiàn)的顏色和位置與熟地黃對(duì)照藥材條帶一致，且陰性對(duì)照在主斑點(diǎn)位置處無干擾，表明該方法專屬性良好。同一供試品溶液重復(fù)點(diǎn)樣后，各斑點(diǎn)清晰，條帶顏色和位置一致，精密度良好，見圖3。

圖3 精密度考察薄層色譜圖

2.2.2 樣品驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)11批不同廠家、批號(hào)的桂附地黃丸（濃縮丸）采用方法（1）分別制備供試品溶液，各吸取5 μL點(diǎn)于同一硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑展開，噴以二硝基苯肼試液，在105℃下加熱至斑點(diǎn)明顯呈現(xiàn)，日光下檢視。結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾，且分離效果和顯色效果均良好，見圖4。

圖4 不同批號(hào)樣品薄層色譜圖

3 結(jié)語

隨著人們生活方式的變化，腎陽疾病已經(jīng)開始年輕化，而桂附地黃丸也是治療該類疾病的首選藥物之一，因此有必要加大對(duì)此品種的質(zhì)量控制，以保證產(chǎn)品安全有效，為臨床安全用藥提供保障，為藥品監(jiān)管提供技術(shù)支撐。而桂附地黃丸（濃縮丸）因劑型服用方便，使用廣泛，其質(zhì)量評(píng)價(jià)尤為重要，本研究選擇藥方中君藥熟地黃，作為其質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，對(duì)其真?zhèn)芜M(jìn)行薄層鑒別。

對(duì)于桂附地黃丸（濃縮丸）中的熟地黃的鑒別，本研究對(duì)其薄層鑒別條件進(jìn)行了詳細(xì)的考察，以熟地黃對(duì)照藥材為對(duì)照，在色譜系統(tǒng)中考察不同提取溶劑（乙酸乙酯，乙醇，水飽和正丁醇溶液），不同展開劑（二甲苯-乙酸乙酯，石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯，三氯甲烷-甲醇），不同顯色劑（2,4-二硝基苯肼乙醇試液，二硝基苯肼試液，2%硫酸香草醛試液），各點(diǎn)樣量（1 μL，2 μL，5 μL，10 μL，20 μL），及不同的檢視條件（日光下，105 ℃條件下加熱后日光下，紫外光（254 nm）下）對(duì)薄層色譜分析的影響，從而確定供試品溶液制備方法和最佳薄層色譜檢測(cè)條件，并在薄層色譜鑒別的方法學(xué)驗(yàn)證中對(duì)其專屬性及精密度進(jìn)行了考察及樣品驗(yàn)證，最終確定薄層鑒別分析方法為采用乙酸乙酯提取樣品，在薄層色譜硅膠G板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑展開，噴以二硝基苯肼試液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)明顯呈現(xiàn)，日光下檢視，所得熟地黃薄層色譜分離效果和顯色效果較佳，斑點(diǎn)清晰、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，且陰性對(duì)照無干擾。

綜上所述，本研究所建立的薄層色譜鑒別方法操作簡(jiǎn)便易行，定性特征明顯、結(jié)果直觀，可有效鑒別桂附地黃丸（濃縮丸）中的熟地黃，可為桂附地黃丸（濃縮丸）的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定參考。