趙江麗,何近剛,岳盈肖,閆子茹,馮云霄,程玉豆,關(guān)軍鋒,*
(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所,河北 石家莊 050051;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北 保定 071001)
‘香水’梨(Maxim)屬秋子梨系統(tǒng),果實呈圓形,直徑4~6 cm,單果質(zhì)量130 g左右,味道甘甜、微酸,深秋成熟,果皮黃綠色,采收時質(zhì)硬,在采后貯藏過程中逐漸變得柔軟多汁,并產(chǎn)生濃郁的香味物質(zhì),品質(zhì)優(yōu)良,深受消費者喜歡。但‘香水’梨果實在常溫下貯藏10 d左右即開始軟化,之后腐爛,貨架期較短。因此,研究貯藏保鮮技術(shù)以延長‘香水’梨的貨架期具有重要意義。
梨是典型的呼吸躍變型水果,其采后的成熟衰老過程與乙烯的誘導(dǎo)作用密切相關(guān)。1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)是乙烯作用的抑制劑,能有效抑制果實乙烯生成,延緩果實衰老,有效延長果實的保鮮時間,在果實采后處理中得到廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn),1-MCP處理可顯著推遲庫爾勒香梨在貯藏過程中硬度、可溶性固形物含量(soluble solids content,SSC)和可滴定酸含量的降低,抑制呼吸強度和乙烯釋放;降低安梨果實的呼吸強度和乙烯釋放量,維持果實內(nèi)在品質(zhì)和果皮顏色亮度,延緩果實衰老,抑制低溫貯藏后貨架期黑皮病發(fā)生;有效延緩‘南果’梨的硬度降低、維持內(nèi)在品質(zhì)、延長貨架期。
香氣是水果品質(zhì)評價的重要指標(biāo)之一,是果實內(nèi)部揮發(fā)性成分(volatile organic components,VOCs)共同作用的結(jié)果,與果實的糖、氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)成分合成密切相關(guān),可以一定程度反映果實的成熟、衰老和腐爛等生理變化。研究認為1-MCP對果實的VOCs生成有重要影響,如減少梨果實的香氣物質(zhì),下調(diào)香氣生成相關(guān)基因的表達。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn),1-MCP可以延緩‘香紅’梨果實的后熟進程,抑制乙烯和部分VOCs的合成,但1-MCP處理對果實的乙烯生成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及VOCs合成相關(guān)基因表達影響的研究較少。
本研究以‘香水’梨為材料,考察了1-MCP處理對其果實品質(zhì)、呼吸和乙烯生成特性、VOCs組成變化的影響,并對其乙烯和香氣物質(zhì)生成相關(guān)基因的表達模式進行分析,以期進一步解析作用機理,為1-MCP在‘香水’梨貯藏保鮮中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。
‘香水’梨于2019年9月18日采自河北省承德縣,果實接近完熟,當(dāng)天運回實驗室,室溫((25±1)℃)過夜,挑選大小均一、無病蟲害和機械損傷的果實(平均單果質(zhì)量20.6 g;硬度6.65 kg/cm;SSC 6.65%),并隨機分為兩組,即處理組(1.0 μL/L 1-MCP熏蒸處理)和對照(CK)組(空氣),1-MCP處理18 h后,將果實置于室溫((25±1)℃)條件下存放。貯藏期間,每3 d進行果實呼吸速率和乙烯釋放速率的測定,每6 d測定果實品質(zhì),同時取果皮和果肉進行液氮速凍后,在-80 ℃下貯藏備用。每次取平行樣品3 份,每份重復(fù)測定3 次。
1-MCP 美國AgroFresh公司;2-辛酮 日本東京化成工業(yè)株式會社;氯化鈉(分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green? Premix ExII聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymease chain reaction,PCR)試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司。所有用水均為高純水。
GY-4型果實硬度計 浙江托普儀器有限公司;PAL-1型手持數(shù)字糖度計 日本愛拓公司;GC9790II型氣相色譜儀 浙江福立分析儀器有限公司;HWF-1型紅外線分析儀 江蘇金壇科析儀器有限公司;TQ-8040型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、SH-Rxi-5Sil MS型毛細管柱日本島津公司;65 μm PDMS/DVB固相微萃取柱美國Suplco公司;ABI 7500型定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司。
1.3.1 硬度及SSC測定
于果實赤道部位去果皮后采用硬度計測定硬度(單位為kg/cm);采用手持數(shù)字糖度計測定SSC。
1.3.2 呼吸速率和乙烯釋放速率測定
每20 個果實置容器中密封,于密封30 min時抽取混勻氣體10 mL采用紅外線分析儀測定密閉氣體中CO質(zhì)量,按公式(1)計算呼吸速率;于密封3 h時抽取混勻氣體1 mL注入氣相色譜儀測定乙烯體積,按公式(2)計算乙烯釋放速率。
1.3.3 VOCs測定
樣品制備:參考Chen Jiluan等方法,準(zhǔn)確稱取適量果皮或果肉粉末凍樣于15 mL頂空瓶中,加入一定體積的飽和氯化鈉溶液,加入0.2 mL質(zhì)量濃度1 μg/mL 2-辛酮溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液,于40 ℃水浴中磁力攪拌30 min,經(jīng)固相微萃取柱吸附30 min,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定VOCs。
固相微萃取條件:固相微萃取頭活化時間7 min,孵育溫度40 ℃,孵育時間30 min,吸附時間30 min,解吸時間1 min。
氣相色譜條件:SH-Rxi-5Sil MS毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:40 ℃保持1 min,2 ℃/min升溫至100 ℃(保持2 min),4 ℃/min升溫至250 ℃(保持5 min),進樣口溫度250 ℃,載氣:高純氦氣,柱流量1 mL/min,不分流進樣。
質(zhì)譜條件:電子電離離子源,離子源溫度200 ℃,碰撞能量70 eV,接口溫度250 ℃,溶劑延遲時間3 min,工作模式Scan,掃描范圍/35~500,通過匹配NIST 17.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及保留指數(shù)進行定性,采用內(nèi)標(biāo)法計算各成分的含量。
1.3.4 RNA提取與定量分析
采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)法提取總RNA??俁NA經(jīng)DNase清除DNA后,用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,按照定量PCR反應(yīng)試劑盒TB Green? Premix ExII說明書進行定量分析。設(shè)計基因及其引物序列見表1,所有引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以為內(nèi)參基因,通過2法計算待測基因相對表達量。
表1 定量PCR引物序列[20-24]Table 1 Primer sequences used for real-time PCR[20-24]
續(xù)表1
采用Excel 2019軟件對采集數(shù)據(jù)進行計算,結(jié)果以平均值表示;采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行組間Duncan’s檢驗,比較差異顯著性。采用HemI 1.0(Heatmap Illustrator)軟件繪制熱圖。
貯藏過程中,‘香水’梨硬度逐漸降低、SSC逐漸升高。相對來說,CK組變化明顯,1-MCP處理組的變化較為緩慢,顯著抑制了硬度降低和SSC升高(<0.05)(圖1)。
圖1 ‘香水’梨果實硬度(A)和SSC(B)變化Fig. 1 Changes in firmness (A) and SSC (B) of ‘Xiangshui’ pear
貯藏過程中,CK組果實的呼吸速率呈先升高后降低趨勢,其峰值出現(xiàn)在第6天,1-MCP組果實的呼吸速率與相同貯藏時間的CK組相比顯著降低(<0.05),且呈先降低后升高趨勢。同樣的,CK組果實的乙烯釋放速率在9 d出現(xiàn)峰值,之后明顯降低,而1-MCP組則緩慢升高,且同期顯著低于CK組(<0.05)(圖2)。
圖2 ‘香水’梨果實呼吸速率(A)和乙烯釋放速率(B)變化Fig. 2 Changes in respiration rate (A) and ethylene production rate (B) of‘Xiangshui’ pear
利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法從香水梨果皮和果肉中共分離鑒定出80 種VOCs,其中酯類48 種、醛類8 種、烷類8 種、醇類7 種、萜烯類6 種、酮類2 種及酚類1 種(表2)。果皮中VOCs數(shù)量和總含量明顯高于果肉,1-MCP組明顯低于CK組(圖3)。
圖3 ‘香水’梨果皮和果肉中不同種類VOCs含量變化Fig. 3 Changes in contents of VOCs in ‘Xiangshui’ pear
果皮中檢出72 種VOCs,主要是酯類、醛類和-法尼烯,醇類和烷類含量次之(表2)。不同貯藏時間果皮中VOCs總量表現(xiàn)為CK組6 d>12 d>0 d、1-MCP組12 d>0 d>6 d(圖3)。由表2可知,酯類以乙酯、己酯為主,其次是甲酯和丁酯,其中己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、己酸己酯、丁酸己酯的含量依次降低,己酸甲酯、辛酸甲酯、乙酸丁酯和()-2-辛烯酸乙酯含量較少。兩組果實果皮中醛類總量均隨貯藏期延長而逐漸降低,其中約80%是()-2-己烯醛、其次為己醛和壬醛,其他醛類成分含量很少。醇類主要是辛醇和己醇。十一烷、十六烷和十四烷是主要的烷類成分,前者在兩組果皮中含量呈遞減趨勢,后兩者均呈遞增趨勢。CK組果皮中萜烯總量及各成分含量均隨貯藏期延長逐漸升高,1-MCP組則先降低后升高,-法尼烯是最主要的萜烯成分,()-金合歡烯和()--香檸檬醇含量較少。酮類含量極少,主要是6-甲基-5-庚烯-2-酮,其在果皮中的含量也隨貯藏期延長先增加后減少。1-MCP明顯降低了果皮中-法尼烯和6-甲基-5-庚烯-2-酮含量。
果肉中共檢出56 種VOCs,主要是酯類、萜烯、醇類、醛類、烷類,其含量相對低于果皮(表2)。與果皮類似,不同貯藏期果肉中VOCs總量表現(xiàn)為CK組6 d>12 d>0 d、1-MCP組12 d>6 d>0 d(圖3)。酯類是果肉中的主要VOCs,其含量變化規(guī)律與VOCs總量一致。由表2可知,己酯類和乙酯類是主要酯類,己酸乙酯和乙酸己酯是主要成分,其后依次是丁酸乙酯、辛酸乙酯、(Z,)-2,4-癸二烯酸甲酯、己酸甲酯、乙酸辛酯、乙酸丁酯等。-法尼烯含量占萜烯總量的90%以上,CK組和1-MCP組果肉中-法尼烯含量均隨貯藏期延長而遞增,1-MCP組明顯低于CK組。果肉中醇類含量較低,主要是辛醇和少量癸醇、己醇。果肉中醛類總量隨貯藏期延長遞減,各成分含量均很低,其中己醛和()-2-己烯醛僅在0 d果肉中檢出,6、12 d未檢出。CK組果肉中烷類含量隨貯藏期延長遞減,而1-MCP組則先增加后減少,其中癸烷僅在0 d檢出,6、12 d未檢出,十一烷在0 d時未檢出而在6、12 d檢出(表2)。
由表2可知,隨貯藏期的延長,CK組果皮中己醛含量逐漸降低,而1-MCP組果皮中己醛含量一直保持較高水平;兩組果皮中()-2-己烯醛含量均逐漸減少。1-MCP組果皮中己醇含量的減少趨勢得到抑制,而辛醇含量明顯下降,()-4-癸烯醇和癸醇未檢出。與對‘南國’梨的研究結(jié)果一致,1-MCP顯著抑制了‘香水’梨中酯類成分的生成。1-MCP組果皮中酯類成分比CK組少12 種,主要成分乙酸己酯、丁酸己酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸甲酯、丁酸乙酯、己酸己酯、乙酸庚酯、乙酸丁酯、2-辛烯酸甲酯、(,)-2,4-癸二烯酸乙酯和3-(甲硫基)丙酸乙酯的含量顯著降低甚至消失。
表2 ‘香水’梨果皮和果肉中VOCs含量Table 2 Contents of VOCs in peel and flesh of ‘Xiangshui’ pears μg/kg
續(xù)表2 μg/kg
貯藏過程中,乙烯合成基因和的表達量在兩組果皮中呈上調(diào)趨勢,在1-MCP組果肉中也呈上調(diào)趨勢,在CK組果肉中先升后降,且1-MCP組明顯低于CK組(圖4),其變化規(guī)律與乙烯釋放速率基本一致,說明1-MCP可以顯著抑制乙烯合成基因的表達,進而抑制乙烯生成。存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的乙烯受體基因/、/對乙烯的響應(yīng)最快,其中,在1-MCP組果皮和果肉中的表達量遠低于CK組果皮和果肉;貯藏0 d時,/在1-MCP組果皮和果肉中的表達量遠低于CK組,隨貯藏期延長兩組間差異縮小甚至消失;在1-MCP組果皮中的表達量明顯低于CK組,在果肉中的表達整體來看1-MCP組和CK組相當(dāng);綜合分析,1-MCP對乙烯受體相關(guān)基因/、/的表達具有抑制作用。乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的表達,在CK組果皮和果肉中均呈先升后降趨勢,在1-MCP組果皮和果肉中均逐漸升高,1-MCP組果肉明顯低于CK組,貯藏6 d時1-MCP組果皮低于CK組;乙烯響應(yīng)因子基因的表達量,在CK組果皮和果肉中均呈逐漸降低趨勢,在1-MCP組果皮和果肉中卻逐漸升高,貯藏0 d和6 d時1-MCP組果皮明顯低于CK組,貯藏12 d時1-MCP組果皮反而高于CK組;這表明1-MCP對乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有抑制和延遲變化的作用。
貯藏過程中,CK組果皮和果肉中、、表達量均呈先升后降趨勢,1-MCP組果皮和果肉中、、表達量均呈上升趨勢(圖4),且1-MCP組明顯低于CK組,此規(guī)律與VOCs總量變化規(guī)律一致,說明1-MCP可以抑制//基因表達,從而抑制脂肪酸轉(zhuǎn)化為VOCs。1-MCP組和CK組果皮、果肉中和基因的表達量均呈下調(diào)趨勢,且1-MCP組表達量整體上明顯高于CK組,說明1-MCP明顯抑制這種下調(diào)趨勢;相對來說,果皮、的表達量高于果肉(圖4)。CK組果皮和果肉中表達量在貯藏6 d時達到高峰,1-MCP整體上明顯下調(diào)了表達,1-MCP組果皮表達量明顯低于CK組,1-MCP組果肉表達量在貯藏0 d和6 d時低于CK組,貯藏至12 d時則高于CK組,果皮中表達量明顯高于果肉(圖4)。
圖4 1-MCP對‘香水’梨乙烯生成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、VOCs生成相關(guān)基因表達的影響Fig. 4 Effect of 1-MCP on the expression of genes associated with ethylene biosynthesis and signal transduction, VOCs synthesis in‘Xiangshui’ pears
經(jīng)相關(guān)性分析,香氣合成相關(guān)基因與乙烯合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達量之間存在一定的相關(guān)性(表3)。脂氧合酶相關(guān)基因、表達量均與乙烯合成相關(guān)基因、表達量及乙烯受體基因表達量呈極顯著正相關(guān)(<0.01),表達量與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達量呈極顯著正相關(guān)(<0.01),酯類合成直接相關(guān)基因與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達量顯著正相關(guān)(<0.05)、與表達量呈極顯著正相關(guān)(<0.01)。醇合成相關(guān)基因、表達量則與、表達量呈極顯著負相關(guān)(<0.01),表達量還與和表達量顯著負相關(guān)(<0.05)。香氣合成各基因之間,表達量與和表達量均呈顯著正相關(guān)(<0.05、<0.01),表達量與、表達量呈顯著負相關(guān)(<0.05),表達量與表達量呈顯著負相關(guān)(<0.05)。這說明上述基因表達的變化影響了‘香水’梨貯藏期內(nèi)的香氣合成。
表3 ‘香水’梨乙烯生成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、VOCs合成相關(guān)基因表達量間相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of expression levels of genes related to ethylene biosynthesis and signal transduction, and VOCs synthesis in ‘Xiangshui’ pears
秋子梨在采后貯藏過程中會發(fā)生一系列的生理變化而后熟,果實逐漸變得柔軟多汁、香味濃郁,食用性變好。果實的后熟與乙烯密切相關(guān),一方面果實在后熟過程中會釋放大量乙烯,另一方面乙烯可以促進果實成熟。1-MCP可以與乙烯受體不可逆結(jié)合,阻止乙烯受體與乙烯的結(jié)合,進而抑制乙烯信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和乙烯的產(chǎn)生達到保鮮目的,但新生成的乙烯受體不與1-MCP結(jié)合,會逐漸弱化1-MCP的保鮮作用。本實驗的研究結(jié)果與此一致,與CK組相比,1-MCP處理組‘香水’梨果實的乙烯生成速率顯著降低(圖2),果實硬度和SSC變化得到顯著抑制(<0.05)(圖1),乙烯合成酶相關(guān)基因和的表達量明顯下調(diào)(圖4),乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因/、/、和的表達量均被下調(diào)(圖4);各項生理指標(biāo)、品質(zhì)指標(biāo)及相關(guān)基因的變化被抑制和延緩。
香氣是果實的重要表觀品質(zhì),采后貯藏中,秋子梨的香氣品質(zhì)隨后熟逐漸濃郁、芳香,隨水果衰老、腐敗又逐漸變淡。果實VOCs合成路徑中某些關(guān)鍵酶及其基因表達受乙烯調(diào)控,外源乙烯量的增加可以促進果實VOCs生成,采用1-MCP進行保鮮處理會減少果實中芳香類成分的生成量。本研究結(jié)果顯示,CK組‘香水’梨果皮、果肉中的VOCs種類和總含量均為貯藏6 d時最高,1-MCP組果肉中的VOCs種類和含量在貯藏過程中逐漸增加,果皮中VOCs種類和總含量貯藏6 d時最少,組間同期比較1-MCP組少于CK組(圖3、表2);這與兩組果皮、果肉中的脂氧合酶//相關(guān)基因表達量的變化情況(圖4)一致。此外,酯類合成直接相關(guān)基因表達量與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達量顯著正相關(guān)(<0.05)、與乙烯受體基因表達量呈極顯著正相關(guān)(<0.01),醇合成相關(guān)基因表達量與乙烯合成相關(guān)基因、表達量極顯著負相關(guān)(<0.01),與乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、表達量顯著負相關(guān)(<0.05),表達量與乙烯合成相關(guān)基因、表達量極顯著負相關(guān)(<0.01),說明乙烯信號系統(tǒng)通過調(diào)控果實VOCs合成相關(guān)基因表達,影響果實VOCs的合成。
‘香水’梨采后貯藏過程中果實逐漸軟化、SSC增加,VOCs的種類和含量逐漸增加,1-MCP處理有利于維持‘香水’梨果實貯藏中的硬度和SSC,抑制果皮和果肉中VOCs合成。1-MCP可通過下調(diào)‘香水’梨果皮、果肉中的乙烯生成限速酶相關(guān)基因和、乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、/和的表達,降低脂氧合酶//及醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因的表達量,抑制‘香水’梨采后品質(zhì)變化和VOCs生成。