■陳秀梅 鄒記興 孔祎頔 李若銘 田佳鑫 李金長(zhǎng)生 王桂芹*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣東廣州 510642）

烏鱧（Channa argus），名優(yōu)淡水養(yǎng)殖品種，深受消費(fèi)者青睞，也是我國(guó)“十四五”特色淡水養(yǎng)殖品種之一[1-2]。在池塘集約化養(yǎng)殖模式下，由于養(yǎng)殖密度過(guò)大，以及過(guò)多投喂高蛋白飼料時(shí)，極易造成烏鱧養(yǎng)殖環(huán)境惡化，腸道壓力過(guò)大，出現(xiàn)腸道炎性損傷，并發(fā)各種疾病，進(jìn)而影響烏鱧養(yǎng)殖效益[1,3]。為了解決這一問(wèn)題，一些水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)人員大量使用、甚至濫用抗生素和化學(xué)藥物，這些藥物在污染環(huán)境、破壞生態(tài)的同時(shí)，對(duì)食品安全問(wèn)題也產(chǎn)生了不良影響[4]。因此在“禁抗”“替抗”大趨勢(shì)下，通過(guò)飼料途徑開(kāi)發(fā)新型綠色添加劑改善烏鱧腸道健康是當(dāng)前亟需考慮的。中藥作為飼料添加劑的重要成員，具有純天然、無(wú)毒害、無(wú)藥殘、安全方便、功能全面等優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[5]。作為中藥炮制的一種重要方法，中藥發(fā)酵將兩者有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，通過(guò)益生菌的酶解作用，不僅增加了中藥活性成分的釋放量，同時(shí)益生菌的一些代謝產(chǎn)物也可改變中藥活性成分，達(dá)到增強(qiáng)藥效的目的，具有廣闊的應(yīng)用前景[6-7]。但發(fā)酵中藥作為近幾年新興的產(chǎn)業(yè)，在魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖中應(yīng)用較少。因此，本試驗(yàn)以烏鱧為研究對(duì)象，探究了乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）發(fā)酵復(fù)方中草藥對(duì)烏鱧生長(zhǎng)和腸道炎性損傷指標(biāo)的影響，旨在為開(kāi)發(fā)新型的烏鱧功能飼料添加劑，為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖探索一條替抗新道路，推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖向綠色安全的現(xiàn)代漁業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)

烏鱧幼魚(yú)，同一批次，體表無(wú)傷、游動(dòng)活潑，在試驗(yàn)前先暫養(yǎng)15 d使其適應(yīng)試驗(yàn)養(yǎng)殖環(huán)境。

1.2 試驗(yàn)菌、中藥及飼料

試驗(yàn)用烏鱧源乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）L19（MT102746.1）、烏鱧源嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）W12由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)用黃芩、黃柏、大黃、大青葉、甘草購(gòu)自長(zhǎng)春福百草大藥房，65 ℃的烘箱中烘干，粉碎后過(guò)80 目篩，按比例混合為復(fù)方中藥，保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確稱(chēng)取復(fù)方中藥10 g，置于含100 mL 純化水的250 mL 三角瓶中，121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫，將乳酸乳球菌（2%接種量，活菌數(shù)為1×108CFU/mL）接種至中藥復(fù)方中，37 ℃振蕩發(fā)酵24 h（前期試驗(yàn)優(yōu)化后條件）。按0.5%的藥量均勻噴灑于基礎(chǔ)飼料中，在25 ℃空調(diào)房晾干，制成乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥添加組飼料，每3 d 制備一批，保存在自封袋中4 ℃冷藏。基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日常管理

暫養(yǎng)15 d 后，挑選身體健康、體型及規(guī)格一致的烏鱧360 尾，隨機(jī)分成4 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾，1組為對(duì)照組，先用0.1 mL PBS緩沖液肛灌處理后投喂基礎(chǔ)飼料；2組先用0.1 mL PBS肛灌處理后投喂基礎(chǔ)飼料+0.5%乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥；3 組先用0.1 mL 1.0×106CFU/mL 嗜水氣單胞菌肛灌處理后再投喂基礎(chǔ)飼料；4組先用0.1 mL 1.0×106CFU/mL嗜水氣單胞菌肛灌處理后再投喂基礎(chǔ)飼料+0.5%乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥。養(yǎng)殖8周。養(yǎng)殖期間日常管理及水質(zhì)條件同暫養(yǎng)期間保持一致，水溫23～25 ℃，溶解氧大于5 mg/L，pH（7.1±0.1）。每日飽食投喂兩次（9：00，16：00），1 h后檢查水族箱內(nèi)殘餌情況，用虹吸法吸出沉積殘餌，并根據(jù)殘餌量調(diào)整投喂量。

1.4 樣品收集和指標(biāo)測(cè)定

飼養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行8 周后，準(zhǔn)備進(jìn)行取樣，取樣前停食24 h，記錄魚(yú)的尾數(shù)，逐一測(cè)量體重，尾靜脈抽血取血清，冰上解剖取腸道，-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

根據(jù)記錄的烏鱧初重、末重，按照常規(guī)計(jì)算公式計(jì)算平均增重率、飼料效率。

烏鱧血清D-乳酸、補(bǔ)體C3（C3）、溶菌酶（LZM）以及腸道Na+K+-ATP 酶、髓過(guò)氧化酶（MPO）、堿性磷酸酶（AKP）活性均采用南京建成生物技術(shù)研究所有限公司試劑盒檢測(cè)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

烏鱧腸道促炎細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）]mRNA表達(dá)水平采用熒光定量PCR法檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)記錄在Excel 表格中，利用SPSS（20.0）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析各個(gè)試驗(yàn)組間的差異顯著性（顯著水平設(shè)定P＜0.05），根據(jù)分析結(jié)果，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥對(duì)烏鱧生長(zhǎng)的影響（見(jiàn)表3）

由表3 可知，與對(duì)照組相比，乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥添加顯著提高烏鱧的末重、平均增重率和飼料效率（P＜0.05），嗜水氣單胞菌肛灌處理組烏鱧的末重、平均增重率和飼料效率顯著下調(diào)（P＜0.05），乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥添加則能回調(diào)烏鱧的末重和飼料效率，與對(duì)照組差異不顯著。

2.2 乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥對(duì)烏鱧腸道炎性損傷指標(biāo)的影響（見(jiàn)表4、圖1）

表4 乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥對(duì)烏鱧炎性損傷指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥添加顯著降低烏鱧腸道Na+K+-ATP酶和MPO的活性（P＜0.05），顯著提高血清C3 水平和LZM 水平（P＜0.05），血清D-乳酸水平和腸道堿AKP活性有下降的趨勢(shì)，但差異不顯著。嗜水氣單胞菌肛灌處理組烏鱧血清D-乳酸水平、C3水平和LZM水平及腸道Na+K+-ATP酶和MPO的活性顯著上調(diào)（P＜0.05），腸道AKP活性有上升的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。嗜水氣單胞菌肛灌處理+乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥添加組烏鱧血清D-乳酸水平及腸道Na+K+-ATP酶、AKP和MPO活性與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），但血清C3水平和LZM水平上升，與乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥添加組差異不顯著。

由圖1 可知，與對(duì)照組相比，乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥添加顯著降低烏鱧腸道IL-1βmRNA 表達(dá)水平（P＜0.05），TNF-αmRNA 表達(dá)水平有下降的趨勢(shì)，但差異不顯著；嗜水氣單胞菌肛灌處理組烏鱧腸道IL-1β和TNF-αmRNA 表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；嗜水氣單胞菌肛灌處理+乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥添加組烏鱧腸道IL-1β和TNF-αmRNA 表達(dá)水平下降，IL-1βmRNA表達(dá)水平與對(duì)照組差異不顯著，但TNFαmRNA表達(dá)水平仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥對(duì)烏鱧生長(zhǎng)的影響

眾多周知，腸道是魚(yú)類(lèi)消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，其消化、吸收能力與魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)休戚相關(guān)[8-9]。本試驗(yàn)條件下，嗜水氣單胞菌肛灌處理就顯著降低了烏鱧的末重、平均增重率和飼料效率。這是因?yàn)槟c道是病原菌的主要入侵點(diǎn)之一，一旦病原菌大量感染，就會(huì)造成不同程度的損傷，影響正常消化吸收功能，進(jìn)而抑制生長(zhǎng)。類(lèi)似的報(bào)道有很多，如在牙鲆（Paralichthys olivaceus）上的研究發(fā)現(xiàn)，鰻弧菌（Vibrio anguillarum）感染后腸黏膜和腸絨毛頂端出現(xiàn)脫落現(xiàn)象[10]。擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus）感染黃顙魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco）后，16 h 出現(xiàn)腸絨毛水腫，24～48 h可見(jiàn)腸上皮變性與灶性壞死[11]。同樣，嗜水氣單胞菌被報(bào)道可致使巖源鯉（Procypris rabaudi）腸道擴(kuò)張，充滿(mǎn)黏液[12]。以上研究均表明病原菌的感染可破壞腸道組織結(jié)構(gòu)的完整性，如何改善這一局面是當(dāng)前亟需解決的問(wèn)題。近年來(lái)益生菌發(fā)酵中草藥引起眾多學(xué)者的關(guān)注，這是因?yàn)橹胁菟幵谝志矫嬗泻芎玫寞熜13-15]，而益生菌在頡頏致病菌方面也有廣闊的發(fā)展前景[16-18]，兩者有機(jī)結(jié)合，不僅能夠抑制病原菌的侵襲，還能夠釋放更多的活性物質(zhì)改善腸道健康[19]。本試驗(yàn)條件下的結(jié)果就證明這點(diǎn)，即乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥添加不僅促進(jìn)健康烏鱧的生長(zhǎng)，同樣也改善了嗜水氣單胞菌肛灌帶來(lái)的生長(zhǎng)抑制。類(lèi)似的結(jié)果也出現(xiàn)在對(duì)其他魚(yú)的研究上，趙倩等[20]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加2‰、3‰的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵中藥能顯著提高鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）的生長(zhǎng)性能及抗嗜水氣單胞菌感染能力。戴旭平等[21]報(bào)道添加5‰～10‰枯草芽孢桿菌和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）發(fā)酵黃芪可有效提高雜交鱘（Acipenser schrenckii♀×Acipenser baerii♂）應(yīng)對(duì)鏈球菌菌液浸泡感染的成活率。李永娟等[22]研究結(jié)果也證明了飼料中添加發(fā)酵中草藥提高草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）抗嗜水氣單胞菌能力。由此可見(jiàn)，益生菌發(fā)酵中草藥在促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)和抗病力方面有很好的效果。

3.2 乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥對(duì)烏鱧腸道炎性損傷指標(biāo)的影響

腸道不僅是消化器官，還負(fù)責(zé)保護(hù)宿主免受各種毒素和病原體的侵害，在屏障功能方面也發(fā)揮巨大的作用[23]。腸道屏障主要由生物屏障、化學(xué)屏障、機(jī)械屏障和免疫屏障組成，一旦受損其通透性增加就會(huì)誘發(fā)多種疾病，且大多伴隨著炎癥反應(yīng)[24]。尤其是病原菌入侵極易誘發(fā)腸道炎性損傷，已有研究證明嗜水氣單胞菌可誘導(dǎo)草魚(yú)腸道炎癥[25]。評(píng)價(jià)腸道炎性損傷的指標(biāo)有很多，一般選用通透性指標(biāo)、免疫相關(guān)指標(biāo)以及促炎細(xì)胞因子[26]。這是因?yàn)槟c黏膜通透性增大，腸道中細(xì)菌生成的D-乳酸通過(guò)受損黏膜進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液中的D-乳酸水平迅速上升[27]。Na+K+-ATP酶是調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透的代謝酶，可為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收提供動(dòng)力[28]。C3、LZM和MPO作為機(jī)體非特異性免疫的作用分子，在防御外來(lái)微生物入侵中著扮演重要角色[29-31]。炎癥反應(yīng)常由細(xì)胞因子介導(dǎo)，IL-1β和TNF-α一般被認(rèn)定為促炎因子，可啟動(dòng)機(jī)體免疫反應(yīng)[32]。本試驗(yàn)條件下，嗜水氣單胞菌肛灌也對(duì)烏鱧腸道屏障造成了損傷，通透性增加，表現(xiàn)在血清D-乳酸水平顯著上升，腸道Na+K+-ATP酶活性顯著上升。同時(shí)，激活腸道免疫系統(tǒng)，血清C3和LZM水平和腸道MPO活性顯著上升，腸道AKP活性也有上升的趨勢(shì)。而且最終造成了炎性損傷，即腸道IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥添加則改善這種現(xiàn)象，本身不僅顯著降低Na+K+-ATP 酶和MPO 活性，還提升血清C3 和LZM水平，改善上述嗜水氣單胞菌肛灌帶來(lái)的炎性損傷，進(jìn)一步激活免疫系統(tǒng)，進(jìn)而維持腸道的健康。謝炎福[33]研究結(jié)果表明發(fā)酵中藥對(duì)嗜水氣單胞菌引起的鯽魚(yú)（Carassius auratus）出血病有明顯的預(yù)防和治療作用。譚曉晨等[34]對(duì)團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）的研究報(bào)道也發(fā)現(xiàn)，添加4%以黃芪為主的中草藥復(fù)方制劑可顯著提高血清中溶菌酶活性，且嗜水氣單胞菌攻毒后死亡率顯著下降。盡管益生菌發(fā)酵復(fù)方中草藥在改善腸道炎性損傷方面表現(xiàn)出巨大的潛力，但目前缺乏益生菌發(fā)酵中草藥改善魚(yú)類(lèi)具體調(diào)控腸道健康的報(bào)道，還需更多的學(xué)者進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，乳酸乳球菌發(fā)酵復(fù)方中藥添加不僅促進(jìn)烏鱧的生長(zhǎng)和腸道健康，還能改善嗜水氣單胞菌肛灌帶來(lái)的生長(zhǎng)抑制和腸道炎性損傷。