夏 燕， 練 冰， 孟 夏， 林丹換， 李仕芬， 王偉洪， 覃春容

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518000； 2. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院婦科，廣東 深圳 518000； 3. 深圳大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 深圳 518000)

Hippo信號(hào)通路是參與哺乳動(dòng)物器官發(fā)生[1-3]、細(xì)胞分化及血管生成[4-8]的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前研究表明，Hippo信號(hào)通路也參與胚胎發(fā)育及卵泡發(fā)育，與生殖內(nèi)分泌代謝異常關(guān)系密切[9-13]。Yes相關(guān)蛋白(Yes associated protein, YAP)基因作為Hippo信號(hào)通路中的重要核轉(zhuǎn)錄因子，可能也參與卵巢局部重要的生理及病理過程。YAP基因通常以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞漿，其上游激酶Lats1/2通過磷酸化YAP的絲氨酸位點(diǎn)而抑制YAP活性，磷酸化YAP在細(xì)胞漿經(jīng)過泛素-蛋白水解系統(tǒng)被降解[14]，而未被磷酸化的YAP進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)通過結(jié)合其下游的核轉(zhuǎn)錄因子TEAD完成后續(xù)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。由于YAP基因自身缺少DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此必須依賴下游的轉(zhuǎn)錄因子TEAD與目標(biāo)基因結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄。TEAD家族作為YAP基因下游重要的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，該家族成員的轉(zhuǎn)錄活化水平直接影響YAP基因?qū)ζ湎掠伟谢虻恼{(diào)控及一系列功能行使[15]。除TEAD家族外，Hippo信號(hào)通路下游基因RUNX-2、ErbB4、CTGF、Smads，p73等在卵巢局部顆粒細(xì)胞及卵泡發(fā)育中的作用研究甚少。有研究發(fā)現(xiàn)核內(nèi)YAP及下游結(jié)締組織生長因子(conne-ctive tissue growth factor, CTGF)的表達(dá)增加，小鼠竇卵泡及次級(jí)卵泡數(shù)目明顯增加[16]。小鼠體內(nèi)YAP磷酸化水平與原始卵泡活化程度有關(guān)，YAP磷酸化程度降低，原始卵泡活性增加[17]。YAP作為Hippo信號(hào)通路中的核轉(zhuǎn)錄共激活物，可能也參與卵巢早衰及多囊卵巢綜合征等生殖內(nèi)分泌異常疾病的發(fā)生。YAP基因上游的負(fù)調(diào)控激酶Lats1，通過調(diào)節(jié)FOXL2基因，參與卵巢早衰的發(fā)生[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，卵巢顆粒細(xì)胞瘤中YAP表達(dá)水平的下調(diào)能夠降低FSH誘導(dǎo)的芳香化酶基因Cyp19a1的表達(dá)[19]，前列腺素E2增強(qiáng)YAP基因的轉(zhuǎn)錄活性，使前列腺素內(nèi)過氧化物酶2(Ptgs2)基因表達(dá)水平升高[20]。

作為卵巢局部激素代謝的主要分子，卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone, LH)是調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和卵巢內(nèi)分泌功能的重要信號(hào)分子，二者在卵巢組織中引發(fā)的一系列復(fù)雜生理變化的分子路徑尚未闡明，這也是目前國際生殖生物學(xué)界的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本研究擬通過FSH誘導(dǎo)人原代卵巢顆粒細(xì)胞，明確卵巢顆粒細(xì)胞中Hippo信號(hào)通路的哪些激素代謝相關(guān)基因誘導(dǎo)后出現(xiàn)差異表達(dá)，以此初步確定卵巢局部Hippo信號(hào)通路的重要效應(yīng)分子中哪些參與FSH誘導(dǎo)的激素代謝調(diào)控，為揭示女性卵巢功能異常以及生殖內(nèi)分泌異常疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM-F12購自美國Gibico公司；青鏈霉素試劑購自美國Sigma公司；胎牛血清購自Hyclone公司；細(xì)胞培養(yǎng)板及細(xì)胞培養(yǎng)皿購自美國Costar公司；FSH購自瑞士默克雪蘭諾公司；所有引物均由TakaRa公司合成，引物序列見表3。RNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司；RNase Inhibitor、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶均購自Invitrogen公司；SYBR Green Ⅰ Mix購自Roche公司；anti-YAP/pYAP(1∶1 000)、anti-CTGF、anti-β-actin抗體均購自Cell Signaling公司?？笴yp19抗體(ab35604)、RUNX2抗體(ab114133)、抗TEAD1(ab133533)抗體購自Abcam公司。抗TEAD2(LS-C119063)抗體和抗TEAD3抗體(LS-30406)購自Lifespan Biosciences公司?？筎EAD4(ab97460)抗體購自Abcam公司。PCR儀購自Eppendorf公司；Real-time PCR儀購自Bio-Rad公司。

PCR儀購自Eppendorf公司；Real-time PCR儀購自Bio-Rad公司。

1.2 顆粒細(xì)胞樣本收集

本研究所用的人原代卵巢顆粒細(xì)胞來源于深圳市婦幼保健院生殖中心行ICSI助孕的不孕患者廢棄卵泡液收集。納入標(biāo)準(zhǔn): (1) 因男方因素行ICSI助孕的不孕患者；(2) 女方年齡<36歲。排除標(biāo)準(zhǔn): 慢性基礎(chǔ)疾病，肝、腎功能不全；子宮畸形、宮腔粘連、卵巢手術(shù)史、夫妻任何一方內(nèi)分泌代謝異常。本研究通過南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并獲得患者知情同意(FSYLS[2020]069)。

1.3 顆粒細(xì)胞體外分離培養(yǎng)

取卵手術(shù)日收集ICSI助孕患者的卵泡液進(jìn)行無菌分離。顯微鏡下從卵泡液中找到卵冠丘復(fù)合物，用巴斯德管機(jī)械分離卵母細(xì)胞及卵丘顆粒細(xì)胞，將卵丘顆粒細(xì)胞用PBS洗2次，用透明質(zhì)酸酶消化成單細(xì)胞，離心用PBS洗2次，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，根據(jù)各自濃度計(jì)算加到培養(yǎng)皿中的細(xì)胞細(xì)胞懸液量，保證初始加入培養(yǎng)皿的細(xì)胞數(shù)均為1×106。12 h貼壁后計(jì)數(shù)，培養(yǎng)36 h后再次計(jì)數(shù)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)

1.4.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄 冰上配制gDNA Eraser反應(yīng)混合液。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。引物序列見表1。RNA反轉(zhuǎn)錄混合液42 ℃水浴中放置15 min，再于85 ℃水浴中放置5 s后立即置于冰上，獲得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)。cDNA可立即用于qPCR檢測(cè)，反應(yīng)條件如下: 預(yù)變性95 ℃，30 s；變性95 ℃，30 s；退火及延伸63 ℃，30 s；共30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。檢測(cè)樣本均重復(fù)至少3次。

表1 目的引物序列

1.5 Western印跡法檢測(cè)

通過含有1%蛋白酶抑制劑混合液的RIPA裂解液提取卵泡顆粒細(xì)胞總蛋白，使用BCA試劑測(cè)定蛋白濃度后確定上樣量。配制SDS-PAGE凝膠，通過PAGE凝膠轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白至膜上。上樣后進(jìn)行電泳(80 V 20 min，然后切換成120 V 70 min)，切去濃縮膠后放入轉(zhuǎn)膜槽中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(300 mA 90 min)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，室溫下5%脫脂奶粉在TBST中封閉2 h，洗膜液清洗1次，一抗4 ℃冰箱孵育過夜。將孵育過夜的膜用洗膜液洗滌3次(每次10 min)，二抗室溫孵育1 h，再用洗膜液洗滌4次(每次10 min)，最后使用凝膠成像儀(Bio-RAD)采集圖像。YAP/pYAP抗體(1∶1 000)、CTGF抗體(1∶500)、Cyp19抗體(1∶500)、TEAD1抗體(1∶1 000)、TEAD2抗體(1∶1 000)、TEAD3抗體(1∶500)、TEAD4抗體(1∶1 000)。所有Western印跡法相關(guān)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 人原代卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)

圖1 人的原代卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)(左: ×100，右: ×200)

2.2 FSH誘導(dǎo)Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因的RNA表達(dá)情況

將25 U FSH誘導(dǎo)劑加入原代卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，按照不同的時(shí)間收集細(xì)胞樣品進(jìn)行qPCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，YAP基因的上游調(diào)控基因Lats1/2基因在FSH不同的誘導(dǎo)時(shí)間均無明顯的表達(dá)差異，MST1/2基因的PCR檢測(cè)結(jié)果提示隨著FSH誘導(dǎo)時(shí)間的延長，MST基因有表達(dá)增強(qiáng)的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)于激素代謝重要的調(diào)控因素，F(xiàn)SH受體和LH受體在FSH誘導(dǎo)后差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 YAP上游基因及顆粒細(xì)胞受體表達(dá)的情況

2.3 FSH誘導(dǎo)YAP及其下游基因TEAD家族的RNA水平表達(dá)

在不同劑量的FSH誘導(dǎo)下，Hippo信號(hào)通路關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子YAP基因表達(dá)均有明顯升高，以12.5 U 組最明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。YAP基因下游的TEAD家族基因在不同劑量FSH誘導(dǎo)下均未出現(xiàn)顯著性變化。除此之外，本研究還檢測(cè)了YAP下游重要的細(xì)胞代謝增殖調(diào)控基因CTGF基因的表達(dá)，通過檢測(cè)結(jié)果可以看到，CTGF基因在FSH誘導(dǎo)后明顯下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩種不同誘導(dǎo)劑量之下CTGF基因的表達(dá)下調(diào)程度相似，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 Hippo信號(hào)通路基因及其下游靶基因的表達(dá)情況

2.4 FSH誘導(dǎo)YAP下游相關(guān)激素代謝靶基因的RNA表達(dá)情況

除了上述Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因，本研究檢測(cè)了與Hippo信號(hào)通路相關(guān)的激素代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況。Cyp19基因在FSH誘導(dǎo)后的表達(dá)水平均明顯升高，不管FSH劑量12.5 U還是25 U處理，Cyp19基因的表達(dá)水平較無FSH處理細(xì)胞組升高近70倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)于Ptgs2基因的表達(dá)情況，Ptgs2基因在FSH誘導(dǎo)后的表達(dá)水平也明顯升高，12.5 U處理組表達(dá)水平較不用FSH處理細(xì)胞組升高近200倍，25 U處理組表達(dá)水平較FSH未處理組升高近150倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Errb4基因在對(duì)FSH誘導(dǎo)后也出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是與其他幾個(gè)相關(guān)基因表達(dá)水平相比，其上調(diào)程度較小。Hippo信號(hào)通路的另一個(gè)重要基因RUNX2基因，12.5 U處理組的表達(dá)水平較FSH未處理組升高數(shù)倍，25 U處理組表達(dá)水平較FSH未處理組也略有升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)于Has2基因和Itgb2基因，F(xiàn)SH處理前后的表達(dá)均無顯著性差異，見圖4。

圖4 與Hippo信號(hào)通路相關(guān)的其他基因及激素代謝相關(guān)基因在不同F(xiàn)SH誘導(dǎo)劑量的表達(dá)情況

2.5 FSH誘導(dǎo)YAP下游相關(guān)激素代謝靶基因的蛋白表達(dá)情況

用FSH體外處理卵巢顆粒細(xì)胞，48 h后收集卵巢顆粒細(xì)胞行Western印跡法檢測(cè)。如圖5A所示: 在使用不同劑量的FSH處理細(xì)胞48 h后YAP基因的表達(dá)無明顯差異，磷酸化YAP的表達(dá)在25 U明顯低于12.5 U處理組。CTGF的蛋白表達(dá)和RNA水平的表達(dá)情況相似，分別出現(xiàn)了表達(dá)下降，且在25 U 的表達(dá)明顯下降，見圖5A。雖然YAP磷酸化水平有所下降，但是YAP下游的重要基因家族TEAD家族的4種亞型的表達(dá)無明顯差異,見圖5B。與激素代謝相關(guān)的基因表達(dá)情況，RUNX-2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是Cyp19的表達(dá)在25 U 水平出現(xiàn)明顯表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5C。

圖5 Hippo信號(hào)通路關(guān)鍵基因及其下游靶基因的蛋白表達(dá)情況

3 討 論

FSH作為下丘腦-垂體-性腺軸的主要激素之一，促進(jìn)女性卵巢局部卵泡發(fā)育及排卵，顆粒細(xì)胞的增殖分化以及性激素的合成[21-23]。竇前卵泡期的顆粒細(xì)胞開始表達(dá)卵泡刺激素受體(follicle stimu-lating hormone receptor, FSHR)。在FSH的刺激下，排卵前成熟卵泡的顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞能合成大量性激素[24]。FSH通過體內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)分化相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞分化。FSH能促進(jìn)血清糖皮質(zhì)激素酶、抑制素α、原癌基因c-fos、黃體生成激素受體、芳香酶、3β-羥化類固醇脫氫酶(3β-HSD)等的基因表達(dá)。上述這些基因的表達(dá)標(biāo)志著顆粒細(xì)胞已分化。FSH激活FSHR后的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和多種信號(hào)分子相互作用，在顆粒細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮重要作用[25]。Hippo信號(hào)通路是近年研究較多的參與哺乳動(dòng)物器官發(fā)育大小的調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。YAP作為該信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)錄共激活因子，可能參與了卵巢局部激素代謝調(diào)控[19]。但目前卵巢局部Hippo信號(hào)通路與FSH以及相關(guān)激素代謝調(diào)控基因之間的表達(dá)關(guān)聯(lián)如何尚不明確。

EGF家族受體屬酪氨酸激酶家族，主要包括ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4。EGF家族因子中EGF、HB-EGF、TGF-α、EREG、BTC和雙調(diào)蛋白均可與其結(jié)合。EGFR不僅表達(dá)于排卵前卵泡的顆粒細(xì)胞內(nèi)，在卵丘顆粒細(xì)胞及黃體內(nèi)也均有表達(dá)。本研究中檢測(cè)了人顆粒細(xì)胞EGF家族受體因子ErbB-4的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在外源性FSH誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)，提示在排卵前后FSH可能誘導(dǎo)EGF表達(dá)增強(qiáng)，參與介導(dǎo)細(xì)胞增殖分化等功能。人芳香化酶基因位于15號(hào)染色體長臂，雖然不同組織表達(dá)的芳香化酶蛋白結(jié)構(gòu)相似，但其轉(zhuǎn)錄情況和蛋白結(jié)構(gòu)存在組織差異。本研究證實(shí)了卵巢顆粒細(xì)胞局部外源性FSH能夠誘導(dǎo)芳香化酶蛋白Cyp19的表達(dá)，并且兩種不同誘導(dǎo)劑量下的表達(dá)水平均相似。CTGF作為參與增殖與凋亡調(diào)控的YAP基因下游重要靶基因，它與卵巢局部生理過程的作用已有研究。近年的研究表明，CTGF通過直接結(jié)合microRNA促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖抑制調(diào)亡的機(jī)制，參與卵巢局部的生理病理過程的調(diào)節(jié)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過FSH誘導(dǎo)后的卵巢顆粒細(xì)胞中CTGF的表達(dá)明顯下調(diào)，但不同F(xiàn)SH誘導(dǎo)劑量之間并無差異。這個(gè)結(jié)果提示FSH可能誘導(dǎo)激素代謝相關(guān)基因高表達(dá)的同時(shí)，觸發(fā)顆粒細(xì)胞局部的調(diào)亡調(diào)控機(jī)制，CTGF明顯表達(dá)明顯下調(diào)。本研究也發(fā)現(xiàn)，卵巢顆粒細(xì)胞中激素代謝相關(guān)基因RUNX-2、ITGB2在FSH誘導(dǎo)后也出現(xiàn)非常顯著的差異性表達(dá)，激素代謝基因Ptgs2的表達(dá)均明顯上調(diào)。上述結(jié)果提示，外源性給予適量的FSH可能增加Cyp19和Ptgs2等激素代謝相關(guān)基因的合成和表達(dá)，可能通過YAP的調(diào)節(jié)參與顆粒細(xì)胞激素調(diào)控，影響顆粒細(xì)胞增殖和凋亡影響局部激素合成釋放。

本研究利用人原代卵巢顆粒細(xì)胞，初步探索了Hippo信號(hào)通路在卵巢顆粒細(xì)胞局部的激素代謝調(diào)節(jié)。由于本研究進(jìn)行Hippo通路相關(guān)基因以及顆粒細(xì)胞激素代謝相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)，存在一定的局限性，僅僅報(bào)道卵巢顆粒細(xì)胞中FSH可誘導(dǎo)Hippo信號(hào)通路激素代謝相關(guān)基因的表達(dá)改變，得到了初步結(jié)論，但本研究并未涉及機(jī)制的深入探討。因此，下一步將圍繞卵巢局部顆粒細(xì)胞的增殖與調(diào)亡調(diào)控機(jī)制的探討，進(jìn)一步通過細(xì)胞水平以及在體相關(guān)研究，進(jìn)行Hippo信號(hào)通路的激素調(diào)控機(jī)制的深入探討，重點(diǎn)圍繞Hippo通路中的關(guān)鍵分子與上述激素代謝相關(guān)基因在增殖與凋亡相互作用的關(guān)系，找到Hippo通路參與卵巢局部激素代謝調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。