馬 俊， 沙 巍

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院上海市感染性疾病(結(jié)核病)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200433)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染引起的傳染病，是危害我國乃至世界人民生活健康的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題[1]。肺結(jié)核病原學(xué)診斷的傳統(tǒng)方法是抗酸涂片鏡檢和分枝桿菌培養(yǎng)，但是抗酸涂片鏡檢檢出率且敏感性較低；培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌雖然是診斷活動性結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但其陽性率也較低、培養(yǎng)時(shí)間長，不利于早期診斷[2-3]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)在《2021全球結(jié)核報(bào)告》[4]中提到： 中國新發(fā)病患者數(shù)約84.2萬，約占全球8.5%，居全球第2位，病原學(xué)檢出率為55%，高于去年的47%，但仍低于全世界的平均水平。因此，使用包括分子生物學(xué)新技術(shù)在內(nèi)的新的診斷策略是提高結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)檢出率的快速有效手段。2013年，WHO修訂了結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將其推薦的GeneXpert MTB/RIF和LAMP技術(shù)的陽性檢出結(jié)果視為等同于細(xì)菌學(xué)檢測陽性，作為病原學(xué)陽性結(jié)核的診斷依據(jù)[5]；我國也在肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行了相應(yīng)的修訂，將基于分子生物學(xué)檢測結(jié)果陽性作為結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)之一[6]。

根據(jù)診斷目的，目前分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核病中的應(yīng)用分為兩大類： 結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)檢測以及其耐藥性檢測。根據(jù)檢測原理，將現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)分類如下： (1) 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)；(2) 恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；(3) 探針-反向雜交技術(shù)；(4) 探針-熔解曲線；(5) 基因測序技術(shù)。本文將就這5類分子生物學(xué)檢測的代表技術(shù)(表1)對結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)及其耐藥性的診斷效能和最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

表1 各種分子生物學(xué)檢測技術(shù)的比較(以培養(yǎng)及表型藥敏為金標(biāo)準(zhǔn))

1 結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)及其耐藥性檢測的分子生物學(xué)技術(shù)

1.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理是通過熒光基團(tuán)標(biāo)記特異性探針，對基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，利用DNA聚合酶5′→3′外切酶活性，在PCR擴(kuò)增過程中切下探針中熒光基因，使其遠(yuǎn)離淬滅基因，產(chǎn)生熒光檢測信號[7]。

GeneXpertMTB/RIF(簡稱Xpert)是目前熒光定量PCR技術(shù)的典型代表，以半巢式實(shí)時(shí)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的快速全自動核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)。通過半巢式PCR擴(kuò)增rpoB基因的192 bp結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特異性序列，其中包含了81 bp的利福平耐藥決定區(qū)域(RRDR)序列，該區(qū)域用5個(gè)分子信標(biāo)(探針A到E)進(jìn)行探測，探針為寡核苷酸，可在2 h內(nèi)完成MTB檢測和利福平耐藥檢測。一項(xiàng)國外多中心研究報(bào)道，共納入6 648例患者，其中1 033例痰培養(yǎng)陽性患者，Xpert法檢測敏感性為90.3%；以痰培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert法在菌陰肺結(jié)核患者中的敏感性76.9%，特異性為99.0%[8]。另一項(xiàng)國內(nèi)雙中心研究共納入190例患者，以痰培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xper法檢測敏感性72.1%，特異性為96.6%[9]，與國外報(bào)道相接近。Xpert技術(shù)不僅可直接用于檢測呼吸道樣本，還能檢測其他類型標(biāo)本，包括腦脊液、淋巴結(jié)組織、胸腹腔積液、尿液、透析液和膿液等，但其敏感性不盡相同，對于檢測淋巴結(jié)組織、膿液、尿液標(biāo)本更具優(yōu)勢[10-11]。

該技術(shù)的另一優(yōu)勢為對利福平耐藥的快速診斷。一項(xiàng)國外多中心研究報(bào)道，1 060例患者以表型藥敏為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert法對利福平耐藥的檢測敏感性為94.4%，特異性為98.3%[8]，為早期診斷耐利福平肺結(jié)核提供了有力保障，尤其在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)且經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的，該技術(shù)發(fā)揮的作用更為明顯[12-13]。

另外，國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)使用Xpert檢測肺泡灌洗液來診斷肺結(jié)核時(shí)，174例對照組中出現(xiàn)了28例假陽性結(jié)果，其中7例檢測結(jié)果為“低”，21例為“非常低”，因此對于Xpert結(jié)果為“非常低”這一半定量陽性結(jié)果的解讀需充分結(jié)合臨床，考慮到存在假陽性的可能性，不能完全作為確診依據(jù)[14]。

1.2 恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)其最大特點(diǎn)是基因擴(kuò)增過程中不需要檢測溫度梯度循環(huán)，溫度保持恒定，臨床主要應(yīng)用于呼吸道標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢測，包括痰液及肺泡灌洗液。目前代表技術(shù)主要包括環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)和實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(simultaneous amplification and testing, SAT)。

LAMP是一種獨(dú)特的DNA恒溫?cái)U(kuò)增方式，經(jīng)過2 h反應(yīng)即可完成核酸擴(kuò)增，可肉眼目測檢測結(jié)果，對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和生物安全要求較低。LAMP技術(shù)擴(kuò)增的靶基因是多樣化的，包括IS6110、hspX、mpb64、gyrB、rrs、rimM或sdaA基因。其中，IS6110基因是最多被使用的，因?yàn)樗@示出更高的敏感性和特異性[5]。一項(xiàng)薈萃分析對26項(xiàng)研究中的9 330份痰樣本檢測結(jié)果進(jìn)行了匯總，以痰培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，LAMP法的敏感性為89.6%，特異性為94.0%[15]。另有兩項(xiàng)研究均提示LAMP法與Xpert法具有相似的敏感性，且顯著高于涂片法[16-17]。但需要認(rèn)識到高溫、高濕度、試劑量不足和樣品之間的交叉污染是出現(xiàn)假陽性結(jié)果的主要原因[15]。

SAT原理是通過設(shè)計(jì)特異性的結(jié)核分枝桿菌核糖體16SrRNA擴(kuò)增引物及優(yōu)化探針技術(shù)，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及T7RNA多聚酶來同時(shí)實(shí)現(xiàn)核酸恒溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測，由于RNA在環(huán)境中極易降解，且MTB死亡后RNA也會降解，因此認(rèn)為此技術(shù)不僅能有效避免污染，還能監(jiān)測肺結(jié)核的活動性[18]。沙巍等[19]報(bào)道在156例肺結(jié)核中，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，SAT法診斷結(jié)核的敏感度為58.3%,特異度為100.0%，對于痰菌陽性肺結(jié)核患者,SAT法陽性率為84.9%;對于痰菌陰性患者,其陽性率為19.0%。Fan等[20]提出建立培養(yǎng)法+Xpert法+SAT法的平行試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?lián)合檢測258例菌陰肺結(jié)核患者痰液及肺泡灌洗液標(biāo)本，其敏感性達(dá)到85.7%，是較為有效的輔助檢測方法。

1.3 探針-反向雜交技術(shù)

探針-反向雜交技術(shù)原理是利用特殊標(biāo)記的探針和靶DNA序列在一定條件下形成雙鏈分子，熒光基團(tuán)標(biāo)記這種雙鏈分子顯影的檢測方法，該方法一次可以完成多個(gè)耐藥相關(guān)基因位點(diǎn)的檢測。線性探針和基因芯片是基于該技術(shù)的兩種檢測方法，能檢測利福平相關(guān)的耐藥基因rpoB及與異煙肼相關(guān)的耐藥基因katG及ihnA。國外一項(xiàng)報(bào)道利用線性探針技術(shù)，對痰菌陽性患者敏感性達(dá)到96.4%，特異性為100%，對痰菌陰性患者敏感性為77.8%，特異性為97.2%[21]。國內(nèi)一項(xiàng)研究以痰培養(yǎng)及表型藥敏為金標(biāo)準(zhǔn)，使用基因芯片法對異煙肼耐藥的檢測敏感度為86.7%，特異度為96.5%，對利福平耐藥的檢測敏感度為93.8%，特異度為97.0%。上述結(jié)果均表明該項(xiàng)技術(shù)有助于耐多藥結(jié)核病的早期診斷[22]。

1.4 探針-熔解曲線技術(shù)

探針-熔解曲線技術(shù)原理是探針與特異性擴(kuò)增產(chǎn)物形成雙鏈，再檢測解鏈溫度，完成針對于靶序列的分析[23]，可檢測呼吸道標(biāo)本及肺外標(biāo)本，并通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線的分析判斷，從序列中檢測是否存在基因突變而實(shí)現(xiàn)耐藥性檢測。其中有代表性的XpertMTB/RIF Ultra(簡稱Ultra)技術(shù)，采用的是高分辨率熔解曲線技術(shù)，用時(shí)更短；同時(shí)在rpoB基因的基礎(chǔ)上，增加檢測IS6110和IS1081兩個(gè)多拷貝的靶基因，敏感性更高。國外一項(xiàng)針對Ultra技術(shù)的多中心研究共納入1 439例患者，基于培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，使用該檢測方法診斷肺結(jié)核的敏感性高于Xpert法(63%vs46%)，但特異性有所下降(96%vs98%)[24]?；赨ltra技術(shù)的高敏感性，2017年WHO推薦由Ultra技術(shù)替代Xpert法[25]，但是需要充分考慮到特異性下降的情況[26]。

Ultra技術(shù)另一項(xiàng)優(yōu)勢是對肺外結(jié)核的診斷效率更高，盡管針對不同肺外結(jié)核標(biāo)本檢測的敏感性各不相同，但特異性均較高。一項(xiàng)基于Ultra技術(shù)對結(jié)核性腦膜炎診斷的研究顯示，對于疑似結(jié)核腦膜炎的患者，其敏感性達(dá)到47.2%，而Xpert法為39.6%，特異性均為100%[27]；另一項(xiàng)針對于結(jié)核性胸膜炎診斷的研究顯示，基于綜合診斷模型為金標(biāo)準(zhǔn)，Ultra技術(shù)的敏感性高于Xpert(44.2%vs19.2%),特異性均為98.7%[28]；一項(xiàng)薈萃分析對于縱隔肺門淋巴結(jié)結(jié)核的診斷，基于綜合診斷模型為金標(biāo)準(zhǔn)，Ultra技術(shù)的敏感性為70.0%，特異性為100%，Xpert法的敏感性為81.6%，特異性為96.4%[29]。

Ultra技術(shù)在利福平耐藥性的快速檢測能力方面同樣具有優(yōu)勢。國外一項(xiàng)研究報(bào)道，551例痰培養(yǎng)陽性患者基于表型藥敏為金標(biāo)準(zhǔn)，該法檢測利福平耐藥的敏感性為95%，特異性為98%，與Xpert法相接近[24]。另一項(xiàng)研究報(bào)道了Ultra技術(shù)對肺外標(biāo)本檢測利福平耐藥情況，基于表型藥敏為金標(biāo)準(zhǔn)，敏感性和特異性均為100%，而Xpert法敏感性為96.5%，特異性為99.1%。Ultra技術(shù)和Xpert法，兩者對利福平耐藥的檢測能力較為接近[29]，均為早期診斷耐利福平肺結(jié)核及肺外結(jié)核提供了更好的保障。

1.5 基因測序技術(shù)

從1977年第一代Sanger測序技術(shù)發(fā)展以來，基因測序技術(shù)取得了長足的進(jìn)步，目前已經(jīng)發(fā)展到了第四代[30]。該方法是通過對MTB靶基因中序列的測定，與數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列做對比，從而精確測定病原的檢測方法。宏基因組二代測序技術(shù)(meta-genomicnext-generation sequencing, mNGS)是一項(xiàng)能對微生物脫氧核糖核酸含量進(jìn)行高通量測序的代表技術(shù)，通過對呼吸道標(biāo)本及肺外標(biāo)本的DNA或RNA進(jìn)行測序，可以同時(shí)檢測多種病原微生物，對包括結(jié)核病在內(nèi)的感染性疾病的診斷有一定價(jià)值[31]。一項(xiàng)回顧性研究顯示466例被納入患者中，感染性病變敏感度為50.7%，特異度為85.7，其中診斷結(jié)核病的敏感度為45.7%，高于培養(yǎng)法[32]。有報(bào)道認(rèn)為，對于外周型肺部感染性疾病，進(jìn)行肺部病灶相對應(yīng)的支氣管肺泡灌洗液檢測并送檢mNGS，可以獲得更高的檢測敏感性[33]。

然而受mNGS自身技術(shù)、測序成本及相關(guān)數(shù)據(jù)庫等影響，常規(guī)mNGS常無法獲得樣本中所有微生物的序列，且對于真菌和分枝桿菌等厚壁細(xì)菌需要破壁前處理，臨床標(biāo)本中低濃度致病微生物可能會漏檢[34]?！陡咄亢昊蚪M測序技術(shù)檢測病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專家共識》[35]建議： 傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法未能給出明確病原學(xué)結(jié)果從而影響患者準(zhǔn)確診療的感染性疾病、新發(fā)突發(fā)傳染病、驗(yàn)證常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果或排除其他發(fā)熱疾病，可考慮使用mNGS技術(shù)；對于危急重癥、疑難感染、群體性感染事件等，可考慮作為一線檢測方法，不盲目使用mNGS技術(shù)。

2 最新的分子生物學(xué)診斷技術(shù)

目前結(jié)核病分子生物學(xué)仍在高速發(fā)展中，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，一部分處于研發(fā)早期階段，一部分屬于小樣本臨床研究，但均展現(xiàn)出良好的診斷效能和應(yīng)用前景。

2.1 Xpert MTB/XDR

2.2 聚集的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列系統(tǒng)(the clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)

1987年，日本科學(xué)家Yoshizumi Ishino于最先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)CRISPR并根據(jù)其特征命名[38]。2002年，Jansen等[39]在原核生物中發(fā)現(xiàn)了與這段重復(fù)序列緊密相關(guān)的保守基因——Cas(CRISPR-asso-ciated systems)，Cas基因可以編碼具有核酸相關(guān)的功能性Cas蛋白，作為抵抗入侵病毒和噬菌體的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)由CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein)和CRISPR RNA(crRNA)組成。Cas和crRNA可以形成有效的核蛋白(ri-bonu-cleoprotein, RNP)復(fù)合物，感知和降解與crRNA序列互補(bǔ)的外源核酸[40]。CRISPR診斷系統(tǒng)具有快速、靈敏度高、特異性好、方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)已有報(bào)道基于CRISPR-Cas12的平臺建立了結(jié)核分枝桿菌DNA檢測方法[41]，利用該法在肺結(jié)核患者的痰液或肺泡灌洗液標(biāo)本中的檢測敏感性為86.8%，其中針對菌陰肺結(jié)核患者的檢測敏感性更是高達(dá)80.5%，明顯高于涂片法及Xpert方法[42]。然而該研究尚屬于小樣本臨床研究，還需要通過進(jìn)一步大量本的研究結(jié)果來進(jìn)一步證明其檢測優(yōu)越性。

2.3 全基因組測序(whole-genome sequencing, WGS)

3 展 望

雖然分子生物學(xué)技術(shù)極大地推動了結(jié)核病的診斷，但也必須清楚地認(rèn)識分子生物學(xué)檢測技術(shù)有其局限性，一方面對儀器設(shè)備、操作人員技術(shù)水平等有較高要求，另一方面檢測結(jié)果也可能出現(xiàn)假陰性和假陽性的情況。一部分臨床醫(yī)生沒有把握好檢查適應(yīng)證，對患者的病情造成延誤甚至誤診，還極大加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。針對結(jié)核病的診斷，建議可以進(jìn)行以下選擇[50-51]： (1) 當(dāng)患者疑似結(jié)核病時(shí)，可行PCR法進(jìn)行相關(guān)檢測，包括GeneXpert MTB/RIF 、LAMP及CRISPR等檢查；(2) 在耐藥高危結(jié)核患者中，應(yīng)同時(shí)完善一線及二線分子藥敏檢測，必要時(shí)進(jìn)行全基因組測序；(3) 必須再次強(qiáng)調(diào)不能忽略經(jīng)典的結(jié)核病微生物學(xué)檢查，需要兩者緊密結(jié)合，取長補(bǔ)短。作為臨床醫(yī)務(wù)人員需要與時(shí)俱進(jìn)，充實(shí)精準(zhǔn)醫(yī)療理念，需根據(jù)不同患者的病情選擇更合理、經(jīng)濟(jì)的檢測手段，而不應(yīng)盲目地尋求新方法、撒網(wǎng)式檢查，扎實(shí)提高結(jié)核病診療水平。