呼靜，崔鵬月，雙全

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

人血清尿酸水平高于正常范圍時(shí)就會(huì)引發(fā)高尿酸血癥或痛風(fēng)[1]，治療與預(yù)防的關(guān)鍵是降低尿酸濃度，降低尿酸濃度可通過減少核苷的攝入量或抑制黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)活性來實(shí)現(xiàn)。高尿酸血癥的治療和預(yù)防手段為服用黃嘌呤抑制劑(別嘌呤醇、非布司他、托匹司他)[2]或排尿酸藥(苯溴馬隆、丙磺舒)[3]，并且輔以嚴(yán)格的飲食控制，盡可能減少外源性嘌呤類物質(zhì)攝入。許多研究表明乳酸菌對(duì)高尿酸血癥具有治療和預(yù)防作用，在腸道內(nèi)乳酸菌可以分解食物中的核苷，降低核苷的含量，進(jìn)而降低尿酸水平[4]。利用此原理，金方等[5]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌ZM15能夠降解核苷酸與核苷，顯著降低模型大鼠的血尿酸水平。牛春華等[6]在體外篩選出能降解肌苷和鳥苷的植物乳桿菌UA149，其可能通過降低血清XOD活性緩解大鼠高尿酸血癥。WANG等[7]檢測(cè)到乳桿菌DM9218能夠降低模型小鼠的血尿酸水平和XOD活性，對(duì)小鼠起到治療作用。YAMADA等[8]通過同位素標(biāo)記、體外HPLC測(cè)定和動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)加氏乳桿菌PA-3表現(xiàn)出較強(qiáng)的腺嘌呤、腺苷和腺嘌呤核糖核苷酸(adenosine monophosphate，AMP)吸收能力，繼而減少尿酸的合成。目前關(guān)于乳酸菌調(diào)節(jié)尿酸的研究還相對(duì)較少，乳酸菌在高尿酸血癥中的應(yīng)用前景還沒有得到廣泛的研究。因此，需要尋找高效的天然降尿酸乳酸菌，以輔助治療高尿酸血癥。

本研究旨在通過HPLC法和尿酸生成法評(píng)價(jià)乳酸菌對(duì)核苷的降解及對(duì)XOD的抑制作用，并通過耐酸、耐膽鹽、胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附性和抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)來研究其特性，最終優(yōu)選出可以輔助治療高尿酸血癥的乳酸菌，以豐富我國降尿酸乳酸菌的菌種庫。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

80株乳酸菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院民族特色食品研發(fā)團(tuán)隊(duì)提供。

1.1.2 藥品與試劑

MRS培養(yǎng)基、肌苷、鳥苷、牛膽鹽粉、藥敏紙片，安耐吉化學(xué)；KH2PO4、K2HPO4，國藥公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，Coolaber；黃嘌呤，Sigma；XOD、別嘌呤醇，Solarbio；PRMI 1640培養(yǎng)基，Gibco。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent LC1260液相色譜儀，美國安捷倫；KG-SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY；58108冷凍高速離心機(jī)，德國Eppendorf；FS-150超聲破碎儀，中國Ultrasonic processor公司；JY1002電子天平，上海蒲春計(jì)量儀器；細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Axygen。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 核苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取肌苷-鳥苷-中性磷酸鉀溶液(12.6 mmol/L肌苷-12.6 mmol/L鳥苷-0.1 mol/L K3PO4，pH=7.0)0.9 mL，加入0.1 mL 0.1 mol/L HC1O4振蕩混勻，吸取不同體積(20、15、10、5 μL)微濾膜過濾后用于進(jìn)樣分析。色譜條件：Agilent LC1260高效液相色譜儀；反相色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為等梯度50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4(pH=6.8)；柱溫35 ℃；體積流量1 mL/min。在260 nm處測(cè)定肌苷與鳥苷含量，并通過曲線插值法進(jìn)行定量[7]。

1.3.2 篩選高效降解核苷的乳酸菌

采用HPLC法測(cè)定反應(yīng)液中的肌苷和鳥苷含量[9]。將菌株以3%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃厭氧條件下活化兩代。取乳酸菌培養(yǎng)液2 mL，在4 ℃條件下，5 000 r/min 離心10 min。然后用1 mL PBS洗滌2次，用無菌PBS調(diào)整菌懸液濃度為1×109CFU/mL，重懸于750 μL肌苷-鳥苷-中性磷酸鉀溶液，37 ℃條件下、120 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。將所得菌液在4 ℃條件下、5 000 r/min 離心10 min，所得上清液與HClO4按體積比 9∶1 混合均勻后，取20 μL 用微濾膜過濾后HPLC分析。各菌株對(duì)核苷的降解率按照公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：C1，初始鳥苷(肌苷)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mmol/L；C2，剩余鳥苷(肌苷)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mmol/L。

1.3.3 乳酸菌對(duì)XOD的抑制作用

將活化好的菌株于10 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用無菌PBS洗滌2次，用無菌PBS調(diào)節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL，在37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，過濾得到細(xì)胞代謝物。1×109CFU/mL的菌液，在超聲破碎條件下(200 W、工作5 s停5 s)進(jìn)行10 min的脈沖破碎，所得液體于10 000 r/min離心10 min，過濾上清液后獲得細(xì)胞內(nèi)容物。

利用尿酸生成法[10]測(cè)定目的菌株抑制XOD活性作用，XOD可催化黃嘌呤氧化生成尿酸，尿酸在295 nm處有特征吸收峰，以每分鐘295 nm處吸光度的增加來計(jì)算酶活性，共記錄10 min。反應(yīng)體系為1 mL，黃嘌呤200 μL，XOD 200 μL，PBS(pH 7.5)600、550、500、450、400、350 μL，相同濃度的菌體細(xì)胞代謝物與內(nèi)容物0、50、100、150、200、250 μL，別嘌呤醇為陽性對(duì)照。計(jì)算樣品對(duì)XOD的抑制率。各菌株的抑制率按照公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：A，空白組吸光度；B，樣品組吸光度。

1.3.4 酸耐受性測(cè)定

參考李堯等[11]的方法，將菌株以3%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下活化兩代。分別在pH為6.2(對(duì)照組)、2和3的酸性MRS液體培養(yǎng)基中接種1%活化后的菌株，37 ℃下培養(yǎng)3 h，在0、3 h時(shí)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。各菌株的存活率按照公式(3)計(jì)算：

(3)

1.3.5 膽鹽耐受性測(cè)定

參考任大勇等[12]的方法，將菌株活化好后，按照1%的接種量將菌株分別接種于牛膽粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%(對(duì)照組)、0.3%的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下處理0、3 h后，在0、3 h時(shí)進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。存活率計(jì)算同1.3.4。

1.3.6 胃腸道耐受能力測(cè)定

參考SON等[13]的方法，將菌株活化好后，取1 mL 該菌液后加入到9 mL模擬胃液(pH=3.0，3.5 g/L胃蛋白酶)中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)0、3 h后分別取樣，3 h時(shí)取1 mL上述培養(yǎng)液加入到9 mL模擬腸液(pH=6.8，1.0 g/L胰蛋白酶、0.3%膽鹽)中，37 ℃ 條件下培養(yǎng) 0、3 h，在0、3 h時(shí)分別取樣并采用MRS平板計(jì)數(shù)測(cè)定活菌總數(shù)。

1.3.7 黏附HT-29細(xì)胞能力測(cè)定

參考秦雅莉等[14]的方法，將菌株活化好后，離心收集菌體沉淀，用細(xì)胞完全培養(yǎng)基(PRMI 1640)培養(yǎng)液將菌體重懸至5×108CFU/mL備用，將傳代5次后的HT-29細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞長至單層后，加入1 mL供試菌株，培養(yǎng)2 h后，PBS沖洗2次，用300 μL的胰蛋白酶消化3 min，加入700 μL含有10%(體積分?jǐn)?shù))牛血清的1640培養(yǎng)液終止反應(yīng)，并將所得溶液收集至無菌EP管中，計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)空白組的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。黏附比按照公式(4)進(jìn)行計(jì)算：

(4)

1.3.8 抗生素敏感性測(cè)定

在MRS固體平板上涂布200 μL菌體培養(yǎng)液，在每個(gè)平板上放置3片抗生素藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)24 h[15]，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.9 乳酸菌的鑒定

將純化好的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，用試劑盒提取菌體基因組，并用PCR擴(kuò)增其16S rDNA的基因片段。擴(kuò)增引物序列為：27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R:CRGYTACCTTGTTACGACTT，擴(kuò)增產(chǎn)物由上海凌恩生物進(jìn)行測(cè)定，測(cè)序結(jié)果在NCBI中比對(duì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用Origin繪制圖形，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳥苷與肌苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

肌苷在本色譜條件下的保留時(shí)間為13.379 min，鳥苷的保留時(shí)間為10.105 min。以溶液濃度和峰面積進(jìn)行線性回歸，肌苷和鳥苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Aino=4.75E7Cino+12 809，R2=1；Agua=4.70E7Cgua-171 597，R2=0.999 8。

2.2 篩選高效降解核苷乳酸菌

對(duì)從奶豆腐中分離出的80株乳酸菌的核苷降解能力進(jìn)行測(cè)定，菌株均具有不同程度的核苷降解能力(80株乳酸菌的核苷降解能力結(jié)果省略)。表1列出了7株乳酸菌的核苷降解率，菌株的肌苷和鳥苷降解率均在74%以上。菌株NL02和NL07的核苷降解率最強(qiáng)，均在99%以上。本試驗(yàn)篩選出的菌株NL02、NL07、NL27和NL37對(duì)核苷的降解率高于麻菊美[9]篩選出的菌株彎曲乳桿菌5-1，菌株NL46、NL59和NL68對(duì)核苷的降解率略低于菌株彎曲乳桿菌5-1。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，菌株對(duì)肌苷和鳥苷的降解能力呈正相關(guān)，可能是由于鳥苷和肌苷可被同一種酶催化降解，這表明在所測(cè)試的菌株中可能含有肌苷或鳥苷的水解酶。肌苷和鳥苷在人體中最終代謝為尿酸，當(dāng)肌苷和鳥苷攝入量過多時(shí)就會(huì)導(dǎo)致尿酸水平超標(biāo)，進(jìn)而導(dǎo)致疾病發(fā)生。而在微生物和植物中存在尿囊素酶、尿囊酸酶和脲酶，這些酶可以把尿酸分解為對(duì)人體無毒性作用的CO2和NH3排除體外。

表1 菌株對(duì)肌苷和鳥苷的降解作用Table 1 Degradation of inosine and guanosine by strains

2.3 乳酸菌細(xì)胞代謝物對(duì)XOD的抑制作用

抑制XOD活性，能有效減少次黃嘌呤形成黃嘌呤并且抑制黃嘌呤形成尿酸，進(jìn)而減少尿酸生成[10]。乳酸菌細(xì)胞代謝物對(duì)XOD的抑制作用如圖1所示，隨著樣品添加量的增加，樣品對(duì)XOD的抑制率也隨之增加。當(dāng)添加量最大時(shí)，別嘌呤醇對(duì)XOD的抑制率為35.31%，菌株NL02、NL07、NL27、NL37和NL46細(xì)胞代謝物對(duì)XOD的抑制率均在25%以上，而菌株NL59和NL68細(xì)胞代謝物對(duì)XOD的抑制率較低，分別為12.15%和15.75%。孫瑋[16]研究樺褐孔菌提取物降尿酸功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，高劑量的水提物(多糖)和醇提物與模型組相比均能顯著降低模型大鼠血清XOD活性。推測(cè)本文中乳酸菌的細(xì)胞代謝物中可能也含有活性多糖以及其他活性物質(zhì)，可以抑制XOD活性，減少尿酸的生成。

圖1 乳酸菌細(xì)胞代謝物對(duì)XOD的抑制作用Fig.1 Inhibition of XOD by metabolites of lactic acid bacteria cells

2.4 乳酸菌細(xì)胞內(nèi)容物對(duì)XOD的抑制作用

乳酸菌細(xì)胞內(nèi)容物對(duì)XOD的抑制作用如圖2所示，當(dāng)樣品添加量為250 μL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)容物對(duì)XOD抑制作用的總體趨勢(shì)為別嘌呤醇>NL02>NL46>NL07>NL37>NL27>NL68>NL59。這與王家彬等[17]研究一致，他發(fā)現(xiàn)短乳桿菌LB1lac20也具有黃嘌呤抑制能力。OOI等[18]研究發(fā)現(xiàn)楊梅素對(duì)XOD具有抑制作用，楊梅素被歸類為具有超氧化物清除活性的XOD抑制劑。推測(cè)本文中乳酸菌的細(xì)胞代謝物和內(nèi)容物均具有一定的抗氧化活性，對(duì)超氧化物具有一定的清除能力，所以可以抑制XOD的活性。結(jié)合菌株對(duì)核苷的降解率、菌株細(xì)胞代謝物、菌株內(nèi)容物對(duì)XOD的抑制率，優(yōu)選菌株NL02、NL07、NL27、NL37和NL46進(jìn)行后續(xù)特性分析。

圖2 乳酸菌細(xì)胞內(nèi)容物對(duì)XOD的抑制作用Fig.2 Inhibition of XOD by lactic acid bacteria cell contents

2.5 酸耐受性

一般情況下人體胃酸pH值為3.0，食物通過胃的時(shí)間一般為1～2 h[11]。乳酸菌能夠在人體內(nèi)發(fā)揮生理功能的前提是要耐受酸性條件。菌株在pH為6.2、3.0、2.0 酸性培養(yǎng)基中耐受能力如圖3所示，pH為3.0 的條件對(duì)菌株的存活率影響較小，菌株的存活率均在84%以上。但pH為2.0的條件對(duì)菌株的存活率影響較大，菌株NL02、NL07、NL27、NL37的存活率在50%以上，顯著高于菌株NL46，說明這4株乳酸菌在此條件下有一定的耐受能力，而菌株NL46的耐受能力較差。這與李堯等[11]的研究結(jié)果一致，酸度越低，菌株的耐受性越差。

圖3 菌株酸耐受結(jié)果Fig.3 Acid tolerance result of strains注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.6 膽鹽耐受性

人體正常膽鹽的質(zhì)量濃度為0.3～3 g/L[12]，乳酸菌能夠在腸道中存活、生長和發(fā)揮功效的另一個(gè)重要特性是耐受膽鹽。圖4為菌株在未添加膽鹽和膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%條件下培養(yǎng)3 h后的存活率，菌株NL02、NL27和NL37在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%下的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后，存活率在56%以上，顯著高于菌株NL07，說明菌株NL02、NL27和NL37在膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%下有一定的耐受能力，滿足了在腸道存活的基本要求，而菌株NL07的耐受性較差。這與任大勇等[12]研究結(jié)果一致，乳酸菌在有膽鹽存在的培養(yǎng)基中生長，其存活率會(huì)下降。

圖4 菌株膽鹽耐受結(jié)果Fig.4 Bile salt tolerance result of strains

2.7 胃腸道耐受能力

乳酸菌能到達(dá)并存活于消化道是其發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵。菌株的存活狀況可通過模擬人體胃腸道后的存活率來反映。菌株在人工胃液中的耐受結(jié)果如表2所示，菌株NL02、NL27和NL37在人工胃液中的活菌數(shù)都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但所有菌株的活菌數(shù)都達(dá)107CFU/mL，存活率皆在52%以上。在人工胃液處理3 h后進(jìn)入人工腸液，結(jié)果如表3所示，菌株NL02和NL27的活菌數(shù)在106CFU/mL以上，存活率也可達(dá)到42%以上，而菌株NL37的活菌數(shù)下降到106CFU/mL以下，乳酸菌在胃腸道內(nèi)存活并發(fā)揮作用的活菌數(shù)需達(dá)到106CFU/mL以上，所以菌株NL02和NL27可以通過胃在腸道中存活一段時(shí)間，從而發(fā)揮其益生功能，而菌株NL37耐人工胃腸液的能力較差。

表2 菌株在人工胃液中的耐受性Table 2 Tolerance of strains in artificial gastric juice

表3 菌株在人工腸液中的耐受性Table 3 Tolerance of strains in artificial intestinal fluid

2.8 黏附HT-29細(xì)胞能力

降尿酸乳酸菌要在人體內(nèi)發(fā)揮良好的生理功能的前提是要能耐受不利于其生存的體內(nèi)環(huán)境(胃酸、膽鹽和胃腸道消化液)。在有一定耐受能力的前提下，還要保證在定植位點(diǎn)具有一定的數(shù)量和增殖能力，才能發(fā)揮益生作用。體外細(xì)胞黏附模型可評(píng)價(jià)乳酸菌的黏附能力[19]。由圖5可知，菌株NL02、NL27和NL37的黏附比分別為(5.56±1.61)、(3.91±1.05)和(1.31±1.34) CFU/cells，菌株NL02和NL27黏附于HT-29細(xì)胞的能力顯著高于菌株NL37，菌株NL02黏附力高于秦雅莉等[14]篩選出的發(fā)酵乳桿菌SS-17。說明菌株NL02可以定植于腸道上皮，從而發(fā)揮其益生作用，菌株NL27和NL37黏附于HT-29細(xì)胞的能力較差。

圖5 菌株對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附作用Fig.5 Adhesion of strain to HT-29 cells

2.9 抗生素敏感性

目前，抗生素耐藥性是全球公共衛(wèi)生問題，有研究表明乳酸菌可通過食物轉(zhuǎn)移抗生素抗性[20]。因此，在篩選益生菌時(shí)，評(píng)價(jià)其對(duì)臨床相關(guān)抗生素的耐藥性至關(guān)重要。本試驗(yàn)選用10種抗生素，對(duì)菌株NL02進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，根據(jù)CLSI的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)菌株的抗生素敏感性進(jìn)行判斷。形成的抑菌圈越大，表明菌株對(duì)抗生素越敏感。菌株NL02的藥物敏感性結(jié)果如表4所示，菌株NL02對(duì)四環(huán)素和環(huán)丙沙星呈中度敏感，對(duì)其余8種抗生素敏感，說明菌株NL02不具備耐藥性。

表4 菌株抗生素敏感性結(jié)果Table 4 Results of antibiotic susceptibility of the strain

2.10 菌株的鑒定

將菌株NL02的16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)菌株NL02(NMDCN0000Q89)的16S rDNA與Lactobacillusreuteristrain 1509的同源性高達(dá)99.93%。采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6，由此可以判斷菌株NL02屬于羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)。

圖6 基于16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of isolate and sequences of relating species

3 結(jié)論

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)的L.reuteriNL02對(duì)鳥苷的降解率為100%，對(duì)肌苷的降解率為99.32%，其細(xì)胞代謝物對(duì)XOD的抑制率為31.18%，細(xì)胞內(nèi)容物對(duì)XOD的抑制率為28.18%，具有較好的潛在降尿酸能力，其降尿酸效果雖然不及合成藥物，但具有低成本和高安全性的特點(diǎn)。L.reuteriNL02耐酸、耐膽鹽、可在人體胃腸道內(nèi)存活，可在人體腸道上皮黏附，并且對(duì)10中常見的抗生素不具備耐藥性，對(duì)人體健康不存在潛在威脅，具有較好的益生潛力。

開發(fā)具有益生功能的乳酸菌是當(dāng)前乳酸菌的一大研究趨勢(shì)。L.reuteriNL02具有很大的降尿酸和益生潛力，后續(xù)可以進(jìn)一步研究L.reuteriNL02在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的功效，以得到更直接準(zhǔn)確的調(diào)控尿酸能力，并參與到高尿酸血癥的預(yù)防和治療中。