米倚林，易南星，許曉彤，楊烙堅，李佳賓，陳樹源，鄺高艷，盧 敏

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙 410007）

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是常見的關節(jié)慢性退行性疾病，主要表現(xiàn)為關節(jié)軟骨退變、軟骨下骨硬化和滑膜炎癥［1］。隨著人口老齡化和肥胖人口的增加，KOA 的患病率正在上升，已成為中國乃至世界面臨的重要社會健康問題［2］。臨床主要以非甾體抗炎藥（NSAIDs）緩解KOA 癥狀。目前尚缺乏能夠有效治療KOA 的藥物，晚期的關節(jié)置換是唯一的治療方式［3］。因此，亟需研究治療KOA 的藥物。

中藥是藥物研究的寶庫，本研究擬基于網(wǎng)絡藥理分析結(jié)果和實驗驗證結(jié)合的方法探究山奈酚對KOA 的作用。已有研究表明多酚可能有益于骨關節(jié)炎，而黃酮類化合物是多酚家族的主要成員［4］。山奈酚是一種生物黃酮類化合物，廣泛存在于杜仲、牛膝、獨活等中藥中。研究證實山奈酚具有抗凋亡、抗炎和抗氧化等多種藥理活性［5］。有文獻證明山奈酚可通過抑制NF-κB 通路減輕IL-1β 誘導的軟骨細胞炎癥［6］；也能夠抑制MAPK 相關的ERK 和p38 信號通路及IL-1β 刺激的基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生［7］。

網(wǎng)絡藥理學是基于生物信息學和系統(tǒng)生物學發(fā)展起來的新型學科，為揭示中藥復雜機理的研究提供了新的方法［8］。本研究通過網(wǎng)絡藥理學探討山奈酚治療KOA 的分子機制，借助分子對接驗證山奈酚與其干預KOA 的關鍵靶基因（BCL-2、BAX和CASP3）的結(jié)合情況，并結(jié)合體內(nèi)實驗驗證山奈酚對膝關節(jié)組織形態(tài)學的影響以及對軟骨凋亡信號通路相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 山奈酚相關靶點篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）得到山奈酚藥物作用靶點，利用蛋白標準化Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對山奈酚相關靶點進行統(tǒng)一轉(zhuǎn)化。

1.2 KOA 相關靶點篩選

以“knee osteoarthritis”為檢索和篩選KOA 相關靶基因的關鍵詞，通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www. genecards. org/）、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫（https：//omim.org/）、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫（https：//www. pharmgkb. org）、TTD 數(shù) 據(jù) 庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Drugbank 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.drugbank.ca/）得到KOA 相關靶基因。合并5 個疾病數(shù)據(jù)庫靶點，刪除重復基因得到與KOA 相關的靶基因。

1.3 山奈酚-KOA 網(wǎng)絡構建

基于篩選出的山奈酚潛在靶點，借助Cytoscape3.8.0 構建山奈酚靶點網(wǎng)絡圖。利用R 4.0.3 Venn 工具包繪制山奈酚與KOA 相關靶點Venn 圖，取其交集，得到共同靶點，再利用Cytoscape3.8.0 構建山奈酚與KOA 的共有靶點網(wǎng)絡圖。

1.4 共同靶點GO 分析與KEGG 富集分析

為進一步了解得到的交集網(wǎng)絡在基因功能和相關信號通路上的具體作用，運用DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫對篩選出的靶點蛋白進行GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析（P值過濾條件及校正后的過濾條件均小于0.05），并借助R 4.0.3 中的clusterProfiler 包結(jié)合enrichplot包對富集分析結(jié)果及通路進行可視化處理。

1.5 分子對接

為進一步了解山奈酚和所篩選體內(nèi)受體靶點的結(jié)合模式和親和力，進入PubChem 數(shù)據(jù)平臺（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih，gov/）下載山奈酚的2D 結(jié)構，將其導入Chem3D 14.0.0.117 軟件進行結(jié)構優(yōu)化并轉(zhuǎn)換為3D 結(jié)構。利用RCSB 數(shù)據(jù)平臺（https：//www.rcsb.org/）下載靶點蛋白的3D PDB格式文件；運用PYMOL 2.5.0 對蛋白進行去水分子和小分子配體等處理后導入Auto Dock Tools1.5.6軟件對關鍵靶點進行加氫、計算電荷等處理。并加極性氫，加載電荷，構建活性口袋；利用Vina1.1.2 軟件將目標靶點與山奈酚進行分子對接，以結(jié)合能作為對接評價指標，導入PYMOL 2.5.0 軟件進行可視化處理。

1.6 山奈酚干預KOA 驗證性實驗

1.6.1 實驗動物及分組 SPF 級8 周齡C57BL 雄性小鼠18 只，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。將小鼠隨機分為假手術組、模型組、山奈酚組。各組小鼠在相同條件下自由飲水、攝食，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)。本實驗方案由湖南中醫(yī)藥大學倫理委員會審核（倫理編號：LL2020 121601）。

1.6.2 造模及給藥 使用小動物呼吸麻醉機，2%異氟烷麻醉小鼠，右側(cè)膝關節(jié)脫毛膏脫毛，碘伏消毒小鼠膝關節(jié)部位，半月板內(nèi)側(cè)失穩(wěn)手術（destabilization of the medial meniscus，DMM）手術誘導KOA模型［9］。模型組：右膝關節(jié)內(nèi)側(cè)髕韌帶與內(nèi)側(cè)副韌帶間切約0.5 cm 切口，顯微鏡下用顯微剪切斷內(nèi)側(cè)半月板脛骨韌帶，縫合皮膚切口；假手術組：行假手術造模，在右膝關節(jié)內(nèi)側(cè)髕韌帶與內(nèi)側(cè)副韌帶中間開0.5 cm 切口，縫合皮膚切口。傷口處碘伏擦拭，放回籠內(nèi)，等待小鼠蘇醒。山奈酚組每日予以50 mg/kg 山奈酚灌胃［10］，假手術組和模型組每日予以同體積生理鹽水灌胃；持續(xù)8 周。

1.6.3 藥物、試劑、儀器 山奈酚（純度≥98.0%，HPLC 分析，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司），脫毛膏（利潔時公司，印度），異氟烷氣體麻醉劑（瑞沃德，Batch NO.217140901），多聚甲醛（國藥試劑有限公司，80096618），無水乙醇（國藥試劑有限公司，10009218），番紅O-固綠染液（北京雷根生物技術有限公司，生產(chǎn)批號DB0082），氨水（國藥試劑有限公司，10002118），二甲苯（國藥試劑有限公司，10023418），氫 氧 化 鈉（General-Reagent，G19852 H），世泰組織包埋盒（江蘇世泰實驗器材有限公司，REF31050102W），世泰黏附載玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）。全蛋白提取試劑盒（南京建成），BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（南京建成），兔抗小鼠CASP3 、BAX、BCL-2 抗體（Abcam，1∶500），HRP標記的山羊抗兔二抗IgG（CST，1∶1 000），小動物麻 醉 機（Matrx VMR 美 國），脫 水 機（LEICA，TP1020），包埋機（LEICA，EG1150C）等。

1.6.4 膝關節(jié)組織形態(tài)學觀察 持續(xù)灌胃8 周后使用小動物呼吸麻醉機，2%異氟烷深度麻醉小鼠后脫頸處死并取膝關節(jié)，4% 多聚甲醛固定；10%EDTA 脫鈣4 周，組織脫水，石臘包埋，5 μm 矢狀位連續(xù)切片，進行番紅O-固綠染色，并用國際骨關節(jié)炎研究協(xié)會（osteoarthritis research society international，OARSI）評分系統(tǒng)分析軟骨退變程度［11］，利用Image-J v1.50i 軟件統(tǒng)計小鼠脛骨軟骨面積。

1.6.5 Western blot 檢測 采用Western blot 法檢測軟骨中BCL-2、BAX、CASP3 蛋白水平。將軟骨組織與RIPA 裂解液混合，研磨10～15 min，在冰上攪拌30 min 收集上清。BCA 法測定蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉后，孵育相應一抗和二抗，顯影并采集圖像。

1.7 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism7.0 軟件處理，結(jié)果采用均數(shù)±標準差（±s）表示。滿足正態(tài)分布，且方差齊時用單因素方差分析（one-way ANOVA）；當方差不齊時，采用Dunnett's T3 檢驗。不滿足正態(tài)分布時，則采用非參數(shù)檢驗；兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 山奈酚干預KOA 的潛在靶點網(wǎng)絡圖

TCMSP 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)山奈酚共有作用靶點63個，包括BAX、PTGS2、MMP1 等，見圖1A。檢索Gene-Cards、OMIM、PharmGKB、TTD、Drugbank 5個疾病基因相關數(shù)據(jù)庫，共得到與KOA 疾病發(fā)生密切相關的1 637 個靶基因。其中，GeneCards 1 579 個、OMIM 6 個、PharmGKB 9 個、TTD 2 個、Drugbank 71 個，將5 個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果繪制Venn 圖，如圖1B 所示。將上述篩選得到的山奈酚63 個靶點與KOA 疾病相關的1 637 個靶點取交集，得到35 個共同靶點，其中包括BCL2、BAX、CASP3 等，如圖1C 所示。

圖1 山奈酚治療KOA 的潛在靶點網(wǎng)路圖Fig 1 Network of potential targets for the treatment of KOA with kaempferol

2.2 共同靶點GO 與KEGG 富集分析

借助DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫對山奈酚治療KOA 相關靶點進行信號通路與生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cell component，CC）和分子功能（molecular functions，MF）富 集 分 析，并 利 用R4.0.3 工具包制作氣泡圖。結(jié)果顯示：山奈酚主要參與的生物學過程包括外源性凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signaling pathway）、凋亡信號通路的負調(diào)控（negative regulation of apoptotic signaling pathway）、氧化應激反應（response to oxidative stress）等，見圖2A。參與的通路主要有細胞凋亡（apoptosis）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等，見圖2B。

圖2 山奈酚-KOA 靶點與通路的KEGG 與GO 富集分析Fig 2 GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis of kaempferol-KOA

2.3 山奈酚與BCL-2、BAX、CASP3 對接良好

通過分子對接來評估蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合潛能以進一步了解藥物與所篩選作用靶點的相關性。利用Auto Dock1.5.6 對山奈酚治療KOA 的3 個靶點（BCL-2、BAX、CASP3）進行結(jié)合能預測。根據(jù)參考文獻［12］表明配體與受體的結(jié)合能力為-7.0 kcal/mol 具有明顯結(jié)合活性，-5.0 kcal/mol 具有較好結(jié)合活性，-4.0 kcal/mol 有一定結(jié)合活性。結(jié)果表示，3 個靶點均存在較好結(jié)合能力，山奈酚與BCL-2 受 體 結(jié) 合 能 力 為-8.3 kcal/mol，與BAX 受體結(jié)合能力為-6.6 kcal/mol，與CASP3 受體結(jié)合能力為-6.8 kcal/mol，結(jié)合活性明顯。將山奈酚與BCL-2、BAX、CASP3 的 對 接 結(jié) 果 導 入PYMOL 2.5.0，如圖3 所示。

圖3 山奈酚與BCL-2、BAX、CASP3 的分子對接圖Fig 3 Visualization of kaempferol-targets（BCL-2，BAX，CASP3）docking

2.4 山奈酚能夠減輕關節(jié)軟骨損傷

通過番紅O-固綠染色發(fā)現(xiàn)，假手術組小鼠膝關節(jié)關節(jié)軟骨完整，軟骨表面光滑，無粗糙與缺損，半月板完整，無明顯病理表現(xiàn)。模型組與山奈酚組脛骨側(cè)關節(jié)軟骨厚度明顯降低，軟骨面粗糙、缺損。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，模型組小鼠膝關節(jié)關節(jié)軟骨OARSI 評分（5.20±0.57）顯著升高（P＜0.001），脛骨軟骨面積［（1 408.00±174.00）mm2］顯 著 減 少（P＜0.001）。山奈酚干預后，與模型組比較，山奈酚組小鼠關節(jié)軟骨OARSI 評分（3.00±0.61）明顯改善（P＜0.001），軟骨面積［（2 522.40±439.10）mm2］較 模 型 組 明 顯 增 加（P＜0.01）。 如 圖4所示。

圖4 小鼠膝關節(jié)番紅O-固綠染色（40×，200×）、OARSI 評分和軟骨面積Fig 4 Mice knee joints stained with safranin O-fast green and determination of OARSI score and cartilage area

2.5 山奈酚能夠調(diào)控BCL-2、BAX、CASP3 蛋白表達

Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠膝關節(jié)軟骨中BAX、CASP3 蛋 白 表 達 量［（0.46±0.04），（0.54±0.06）］較假手術組［（0.15±0.02），（0.24±0.08）］顯著升高（P＜0.01～0.001），而BCL-2 表達則顯著降低［（0.05±0.01），（P＜0.001）］；經(jīng)山奈酚干預，小鼠軟骨BAX、CASP3 蛋白表達量顯著降低［（0.31±0.04），（0.37±0.06）（P＜0.05～0.01）］，而BCL-2 蛋白表 達則顯著升高［（0.17±0.02），P＜0.05］。表明山奈酚對軟骨細胞凋亡具有顯著抑制作用，見圖5。

圖5 小鼠膝關節(jié)軟骨的BAX、BCL-2、CASP3 表達Fig 5 BAX，BCL-2 and CASP3 protein expression by Western blot assay

3 討論

KOA 是中老年人常見的關節(jié)疾病，不僅可以導致關節(jié)疼痛、畸形和功能障礙，還可顯著升高心血管事件、下肢深靜脈血栓栓塞、髖部骨折以及全因死亡率的風險［13］。中華醫(yī)學會骨科學分會［13］、國際骨關節(jié)炎研究協(xié)會（OARSI）［14］等均推薦首選基礎治療。本研究擬尋求治療KOA 的潛力藥物，山奈酚是一種廣泛存在于天然藥品中的黃酮醇，被證實是重要的天然抗炎化合物之一，在關節(jié)炎、癌癥、心血管等疾病中均發(fā)揮改善病情的作用，這與其降低炎癥相關疾病的風險密切相關［15，16］。山奈酚廣泛存在于多種中草藥和復方制劑中，已有報道說明山奈酚等黃酮醇類化合物是經(jīng)典名方獨活寄生湯的有效化學成分之一，獨活寄生湯多年來廣泛應用于臨床治療KOA 等骨科疾病，并且取得了較好療效［17］。本課題組前期已證實加味獨活寄生合劑含藥血清能通過調(diào)控Wnt 信號通路改善IL-1β 誘導的軟骨細胞病理表現(xiàn)［18］，并且該藥可以通過降低OA 患者關節(jié)液中IL-1，TNF-α 及NO 水平改善關節(jié)功能及疼痛［19］。本研究首次系統(tǒng)地闡述了山奈酚通過調(diào)控BAX、BCL-2、CASP3 干預KOA 的作用機制。

作為天然食品藥品的化學活性成分，山奈酚的副作用較小而作用廣泛，受到了越來越多的關注，此前已有多項研究證實山奈酚對KOA 有積極作用。已有研究發(fā)現(xiàn)山奈酚通過調(diào)控NF-κB 和MAPK 通路表現(xiàn)出很強的抗炎和抗關節(jié)炎作用［6，7］。此外，Jiang 等［20］的研究發(fā)現(xiàn)山奈酚可能通過下調(diào)miR-146a、抑制Decorin 的表達而干預脂多糖誘導的軟骨ATDC5 細胞凋亡和炎癥反應。近期研究發(fā)現(xiàn)山奈酚可通過調(diào)節(jié)軟骨細胞XIST/miR-130a/STAT3 軸抑制炎癥和細胞外基質(zhì)降解［21］。也有臨床試驗證實山奈酚在減輕KOA 疼痛和癥狀方面療效顯著［22］。網(wǎng)絡藥理學作為藥物研究的一種方法，融合了藥理學和生物學的多重優(yōu)勢，以藥物-成分-靶點-通路的網(wǎng)絡模式為特點，為藥物與疾病之間的聯(lián)系提供研究方法，并能反映藥物多靶點、多通路的作用關系［8］。本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法闡述山奈酚治療KOA 的作用機制。筆者通過挖掘山奈酚和KOA 疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關的靶基因，并構建了山奈酚與KOA 之間靶基因的網(wǎng)絡關系，發(fā)現(xiàn)BCL2、BAX、CASP3、NOS2 和JUN 等是山奈酚干預KOA 的重要靶點。通過GO 和KEGG 富集分析，山奈酚參與外源性凋亡信號通路、凋亡信號通路的負調(diào)控和氧化應激反應等生物學過程干預KOA，且與細胞凋亡、腫瘤壞死因子信號通路等通路有關。細胞凋亡是一種受基因調(diào)控的程序性細胞死亡方式［23］，對軟骨發(fā)育和維持適當?shù)膭討B(tài)平衡至關重要［24］。軟骨退變是KOA 的關鍵特征，許多實驗研究均表明軟骨細胞凋亡在KOA 的進展中起著關鍵作用［25］。在KOA 病程中，軟骨細胞在多種原因?qū)е碌难装Y微環(huán)境刺激下發(fā)生凋亡，導致軟骨功能受損［26］。因此，抑制軟骨細胞凋亡可作為治療KOA的重要方法。細胞凋亡機制非常復雜，與一系列的信號分子相關，其中BCL-2、BAX 和CASP3 是細胞凋亡通路中3 個關鍵的分子［27］。本實驗分子對接驗證了山奈酚與BCL-2、BAX 和CASP3 的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)其不僅具有明顯的結(jié)合能力，而且結(jié)合活性強。

Caspase 家族作為細胞凋亡的核心，最早發(fā)現(xiàn)于1985 年［28］，根據(jù)其結(jié)構和功能可分為啟動型和執(zhí)行型，其中啟動型Caspases 可以激活執(zhí)行型CASP3，放大凋亡信號通路，激活的CASP3 可觸發(fā)凋亡的級聯(lián)反應，導致細胞快速死亡［29］。BCL-2 蛋白家族調(diào)節(jié)線粒體膜通透性，既可以促進凋亡又可以抗凋亡，其中抗凋亡蛋白包括BCL-2、BCL-X、BAG 等，促凋亡蛋白包括BAX、BCL-10、BID 等，這些蛋白具有特殊的意義，因為它們可以決定細胞凋亡還是終止凋亡［30］。因此抑制BAX、CASP3 的表達，促進BCL-2 的表達對降低軟骨細胞凋亡至關重要［27］。研究表明，氧化應激與細胞凋亡密切相關，是機體內(nèi)自由基產(chǎn)生的一種負面效應，在KOA 的發(fā)展中起著重要作用，活性氧的積累會對軟骨細胞合成代謝的相關進程產(chǎn)生干擾，導致軟骨細胞功能紊亂和變性，進而導致細胞凋亡［31］。而細胞外激刺激可通過TNF 受體基因家族激活外源性凋亡途徑［32］。這些生物學過程和信號通路與本研究的GO和KEGG 富集結(jié)果一致，因此，細胞凋亡是山奈酚治療KOA 的潛在分子機制。

本研究還對山奈酚治療KOA 的療效以及其對細胞凋亡關鍵靶點BCL-2、BAX 和CASP3 的調(diào)控進行了實驗驗證。實驗結(jié)果表明，番紅O-固綠染色發(fā)現(xiàn)DMM 誘導的小鼠膝關節(jié)軟骨的退變，而山奈酚對軟骨退變有明顯的改善作用，且調(diào)控了軟骨中BCL-2、BAX 和CASP3 蛋 白 水 平，與GO 和KEGG富集結(jié)果一致，本研究表明山奈酚組軟骨凋亡水平受到抑制，通過降低KOA 小鼠軟骨BAX、CASP3和增加BCL-2 蛋白水平發(fā)揮了延緩KOA 疾病進程的作用。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡藥理學及動物實驗對山奈酚治療KOA 潛在分子機制進行研究。研究結(jié)果證實山奈酚是一種潛在的治療KOA 的有效藥物，而抑制細胞凋亡是其可能的機制。

作者貢獻度說明：

論文設計：盧敏，鄺高艷；文獻檢索：米倚林，許曉彤；數(shù)據(jù)統(tǒng)計：米倚林，易南星，許曉彤，楊烙堅；圖表制作：米倚林，易南星，李佳賓，陳樹源；文稿撰寫：米倚林，易南星；基金獲取：盧敏，鄺高艷。