趙志平,王向宇,賈斌,許應(yīng)星,王昌耀,王英振

(青島大學(xué),山東 青島 266071 1 醫(yī)學(xué)部； 2 附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科)

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)(TJA)被廣泛用于治療晚期關(guān)節(jié)疾病，可顯著緩解病人的疼痛并改善關(guān)節(jié)功能[1]。然而，磨損顆粒引起的假體周圍骨溶解引發(fā)的無菌性松動是導(dǎo)致假體失敗的主要原因[2]。盡管假體周圍骨溶解的病理生理機(jī)制仍不清楚，但越來越多的證據(jù)表明，從假體表面釋放的聚乙烯和鈦(Ti)等磨損顆粒能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和過度活化，并增強(qiáng)假體周圍的破骨細(xì)胞骨吸收功能，從而導(dǎo)致假體周圍骨溶解和隨后的無菌性松動[3-4]。大量的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳信號分子-溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(BRD4)通過調(diào)控破骨細(xì)胞的形成，參與破骨細(xì)胞相關(guān)的溶骨性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨肉瘤和骨質(zhì)疏松等發(fā)生和發(fā)展[5-7]。有研究結(jié)果表明，BRD4抑制劑JQ1對破骨細(xì)胞分化有抑制作用，可防止卵巢切除小鼠骨質(zhì)疏松[8]。我們先前的研究結(jié)果顯示，假體周圍骨溶解病人的界膜組織中BRD4蛋白的表達(dá)明顯增加，Ti顆粒處理小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞通過上調(diào)BRD4表達(dá)誘導(dǎo)溶骨性炎性因子的產(chǎn)生[9]。但是，關(guān)于BRD4蛋白參與調(diào)控磨損顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成、活化和骨吸收功能的確切機(jī)制不明。本文對BRD4在磨損顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和骨吸收功能中的作用進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞購自中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)液和青霉素/鏈霉素混合液購自以色列BI公司；胎牛血清購自武漢普諾賽生命科學(xué)有限公司；Ti顆粒(平均直徑為4 μm)購自美國Alfa Aesa；CCK8試劑盒和TRAP染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)購自美國R&D Systems；JQ1購自北京愛必信生物科技有限公司；骨吸收培養(yǎng)板購自美國康寧公司。

1.2 實驗方法

1.2.1Ti顆粒的準(zhǔn)備 Ti顆粒在180 ℃下烘烤6 h后，在體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇中洗滌48 h以去除內(nèi)毒素，然后懸浮在無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中,使用高壓滅菌器對Ti顆粒懸液進(jìn)行滅菌,制成0.1 g/L的Ti顆粒懸液4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo) 小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞以每孔1×104的密度接種于96孔板中，隨機(jī)分為3組培養(yǎng)：對照組中加入破骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素/鏈霉素混合液DMEM高糖培養(yǎng)液+100 μg/L RANKL+50 μg/L的M-CSF)，Ti組中加入破骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+0.1 g/L Ti顆粒，Ti+JQ1組中加入破骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+0.1 g/L Ti顆粒+200 nmol/L JQ1。3組細(xì)胞均培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、95%濕度和37 ℃的環(huán)境中，每2 d更新1次培養(yǎng)液。

1.2.3CCK8方法檢測細(xì)胞活力 小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞以每孔1×104的密度接種到96孔板中過夜，根據(jù)分組加入相應(yīng)試劑后培養(yǎng)48 h。然后按照CCK8試劑盒說明書將CCK8添加到96孔板中,每組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測定各孔吸光度。

1.2.4熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)方法檢測基因表達(dá) Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，參照說明書進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，將獲得的cDNA稀釋并用作PCR模板，使用SYBR Green PCR預(yù)混液配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃、10 min，變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、10 s，延伸72 ℃、15 s,共進(jìn)行40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照基因，采用2-ΔΔCt法分別計算BRD4、組織蛋白酶K(CK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、活化T細(xì)胞核因子1(NFATc1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)等目的基因的mRNA表達(dá)。上述每個樣本均設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.5TRAP染色法檢測破骨細(xì)胞形成 將小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞以每孔1×104的密度接種到96孔板中過夜，根據(jù)分組加入相應(yīng)試劑。每2 d更換1次培養(yǎng)液，直到第5天觀察到成熟的破骨細(xì)胞。然后將各組細(xì)胞用PBS洗滌3次，用40 g/L多聚甲醛固定20 min，并根據(jù)TRAP試劑盒說明書進(jìn)行TRAP染色。具有≥3個核TRAP染色陽性的細(xì)胞為破骨細(xì)胞，并使用Image Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行計數(shù)。

1.2.6骨吸收培養(yǎng)板(OAP)檢測破骨細(xì)胞骨吸收功能 將小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞以每孔1×105的密度接種到24孔OAP中，根據(jù)分組加入相應(yīng)試劑。每2 d更換1次培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d，然后超聲處理直至細(xì)胞完全從OAP中移出。使用倒置顯微鏡拍攝骨吸收凹坑的圖像，并使用Image Pro-Plus 6.0軟件量化骨吸收的面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞存活率比較

對照組、Ti組和Ti+JQ1組的細(xì)胞存活率分別為1.01±0.02、1.04±0.04、0.99±0.05，3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.629,P>0.05)。表明加入Ti顆粒、RANKL和M-CSF以及JQ1對細(xì)胞生長活性無影響。

2.2 各組BRD4基因和破骨細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)比較

Ti組BRD4mRNA表達(dá)明顯高于對照組，而Ti+JQ1組BRD4mRNA表達(dá)與Ti組相比顯著降低(F=128.241，P<0.05)。與對照組相比較，Ti組破骨細(xì)胞相關(guān)基因CK、TRAP、TRAF6、NFATc1、c-Fos的mRNA表達(dá)均明顯升高；與Ti組相比，Ti+JQ1組破骨細(xì)胞相關(guān)基因CK、NFATc1、TRAF6、TRAP和c-Fos的mRNA表達(dá)均明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.575～336.704，P<0.05)。見表1。

表1 各組BRD4基因和破骨細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)比較

2.3 各組破骨細(xì)胞形成比較

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞可以分化為特征性TRAP陽性多核破骨細(xì)胞，與對照組相比，Ti組破骨細(xì)胞數(shù)增多；與Ti組相比，Ti+JQ1組TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=165.941，P<0.05)。見圖1A～C和表2。

A～C：各組細(xì)胞培養(yǎng)5 d后破骨細(xì)胞觀察。TRAP染色，200倍。D～F：各組細(xì)胞培養(yǎng)5 d后骨吸收面積觀察。OAP，100倍。A、D：對照組；B、E：Ti組；C、F：Ti+JQ1組。

表2 各組破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收面積比較

2.4 各組破骨細(xì)胞骨吸收功能比較

在RANKL和M-CSF誘導(dǎo)下，3組均可觀察到骨吸收凹坑。與對照組相比，Ti組的骨吸收面積顯著增加；與Ti組相比，Ti+JQ1組的骨吸收面積顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.879，P<0.05)。見圖1D～F和表2。

3 討 論

TJA可以明顯緩解晚期關(guān)節(jié)疾病病人的疼痛、改善關(guān)節(jié)功能、提高生活質(zhì)量，曾被評為“世紀(jì)性的手術(shù)”[1]。但是隨著TJA手術(shù)的廣泛開展以及假體使用年限的延長，越來越多的病人需要進(jìn)行關(guān)節(jié)翻修手術(shù)，這給病人造成了極大的心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。DOBZYNIAK等[10]對關(guān)節(jié)翻修手術(shù)的原因分析發(fā)現(xiàn)，75%的翻修手術(shù)是由假體的無菌性松動引起。而磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解是假體無菌性松動的病理基礎(chǔ)[11]。因此，預(yù)防和治療假體無菌性松動的關(guān)鍵在于對磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解進(jìn)行防治。這就要求我們了解磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的發(fā)病機(jī)制。

隨著表觀遺傳學(xué)的興起，BRD4作為表觀遺傳信號分子逐漸被人們所熟知。BRD4蛋白主要與乙?；慕M蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合，然后募集其他轉(zhuǎn)錄因子，繼而形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞周期、細(xì)胞生長、炎癥和癌癥等調(diào)節(jié)[12-13]。有研究結(jié)果表明，磨損顆粒主要通過激活破骨細(xì)胞形成和骨吸收功能誘導(dǎo)假體周圍骨溶解[14-17]。大量研究顯示，表觀遺傳信號分子BRD4與破骨細(xì)胞相關(guān)的溶骨性疾病有關(guān)[7,18-19]，而抑制BRD4可以顯著抑制破骨細(xì)胞的形成以及破骨細(xì)胞的骨吸收功能[20]。BRD4選擇性抑制劑JQ1可通過阻斷BRD4蛋白與乙?；M蛋白之間的相互作用，競爭性地占據(jù)溴結(jié)構(gòu)域的識別口袋，并取代染色質(zhì)的BRD4蛋白，發(fā)揮針對靶基因治療劑的作用。LAMOUREUX等[7]的研究顯示，JQ1可抑制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化，延緩骨腫瘤的發(fā)展。KLEIN等[21]研究表明，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中可檢測到BRD4蛋白，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均有BRD4表達(dá)，抑制BRD4可抑制破骨細(xì)胞的形成和活化而緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理過程。我們之前的研究結(jié)果也表明，BRD4在假體周圍骨溶解病人界膜組織中的表達(dá)上調(diào)；當(dāng)用Ti顆粒處理小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞時，BRD4表達(dá)上調(diào)并且促進(jìn)溶骨性炎癥因子的產(chǎn)生；在JQ1存在時，BRD4和溶骨性炎癥因子產(chǎn)生顯著減少，表明BRD4可能在Ti顆粒誘導(dǎo)溶骨性炎癥因子產(chǎn)生的機(jī)制中起作用[9]。本研究旨在進(jìn)一步探討B(tài)RD4在Ti顆粒體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞骨吸收功能中的作用。

本文研究Q-PCR結(jié)果顯示，在Ti顆粒誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中BRD4表達(dá)上調(diào)，與相關(guān)研究結(jié)果一致[9]；并且伴隨著破骨細(xì)胞相關(guān)基因CK、TRAP、TRAF6、NFATc1以及c-FosmRNA表達(dá)升高，而BRD4抑制劑JQ1可以顯著降低Ti顆粒誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中破骨細(xì)胞相關(guān)基因CK、TRAP、TRAF6、NFATc1和c-FosmRNA的表達(dá)，說明BRD4參與了Ti顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。本文進(jìn)一步探討了BRD4對Ti顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和骨吸收功能的影響，TRAP染色結(jié)果顯示，Ti顆粒可促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和分化，而抑制BRD4則減弱了Ti顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和分化；此外，OAP結(jié)果表明，Ti顆?？纱龠M(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收功能，而JQ1能顯著抑制Ti顆粒體外誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞骨吸收功能。

綜上所述，Ti顆粒處理RAW264.7巨噬細(xì)胞可通過上調(diào)BRD4的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞骨吸收功能，抑制BRD4表達(dá)可抑制Ti顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞骨吸收的功能，但其具體分子調(diào)控機(jī)制仍有待研究。應(yīng)用動物模型進(jìn)一步研究BRD4在Ti顆粒誘導(dǎo)骨溶解中的作用，從表觀遺傳學(xué)的角度對磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的發(fā)病機(jī)制提供了新的補(bǔ)充，同時也為預(yù)防和治療磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解和假體無菌性松動找到了新的治療靶點和理論依據(jù)。