TMEM9B-AS1對食管癌細胞增殖和侵襲影響及機制

孫永紅,別俊,何群育,郭奇遇

(南充市中心醫(yī)院,四川 南充 637000 1 腫瘤科； 2 口腔科)

食管癌侵襲性強，男性的估計發(fā)病率是女性的3倍，總體5年生存率僅為20%左右[1]。因此，仍需要探索有效篩查、診斷和治療食管癌的新方法。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種單鏈不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，其長度在200～100 000 nt之間[2]，如ELFN1-AS1、FAM83A-AS1等均可促進食管癌的進展[3-4]。轉(zhuǎn)錄因子7樣蛋白2(TCF7L2)是Wnt信號通路的關(guān)鍵分子，并可以調(diào)控β連環(huán)蛋白1(CTNNB1)的轉(zhuǎn)錄[5]，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TCF7L2-SATB1通路與食管癌病人不良預后有關(guān)[6-7]。環(huán)氧化酶-2(COX-2)是一種蛋白酶，研究表明約有82%的食管癌組織表達COX-2，并且參與食管癌的起源和發(fā)展[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)的一種新型的LncRNA TMEM9B-AS1，主要在結(jié)腸和腎臟表達[9]。但是，其對食管癌的影響和作用機制尚不清楚，目前仍無相關(guān)報道。因此，本研究旨在探討TMEM9B-AS1在體外對食管癌細胞侵襲和增殖能力的影響，以及介導TCF7L2-SATB1途徑對食管癌細胞COX-2和CTNNB1蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人食管癌細胞KYSE510(ATCC?CRL-9609)以及96孔和24孔組織培養(yǎng)板(康寧公司，美國)，DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司，美國)。TMEM9B-AS1過表達、沉默質(zhì)粒以及相應的陰性對照(NC)(吉瑪公司，中國)，Lipofectamine?2000(Invitrogen公司，美國)。Trizol試劑(Aidlab公司，中國)，RNAspin Mini試劑盒(GE Healthcare，美國)，BestarTMqPCR試劑盒(DBI Bioscience公司，德國)，PCR儀(ABI7900，ABI公司，美國)。一抗以及山羊抗免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶1 000稀釋，#ab6721，美國Abcam公司)，PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)，ECL 顯色試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)，Matrigel膠和Transwell裝置(Corning公司，美國)。光學顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 將KYSE510細胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)液中，內(nèi)含有體積分數(shù)0.10牛血清、0.1 g/L鏈霉素和100 kU/ L青霉素。細胞在含體積分數(shù)0.05 CO2、37 ℃和95%濕度下培養(yǎng)。將KYSE510分為對照組(A組)、TMEM9B-AS1組(B組)和siTMEM9B-AS1組(C組)，分別轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒、TMEM9B-AS1質(zhì)粒以及siTMEM9B-AS1質(zhì)粒。按試劑盒說明書利用Lipofectamine?2000進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件為7 ℃和體積分數(shù)0.05 CO2，48 h后收集細胞進行后續(xù)研究，分別進行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測、細胞計數(shù)(CCK-8)檢測、轉(zhuǎn)移小室(Transwell)實驗及蛋白質(zhì)印跡(Western blot)實驗。

1.2.2RT-qPCR檢測TMEM9B-AS1、TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1的mRNA表達 使用RNeasy Mini試劑盒提取細胞總RNA，然后將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用BestarTMqPCR預混液進行qPCR實驗，條件如下：95 ℃、2 min， 94 ℃、20 s，58 ℃、 20 s，72 ℃、20 s，40個循環(huán)，最后在72 ℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx 3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參對照，計算TMEM9B-AS1、TCF7L2、SATB1、COX-2以及CTNNB1的mRNA相對表達水平。

1.2.3CCK-8檢測細胞增殖活力 將100 μL的細胞懸浮液添加到96孔板中，孵育48 h和72 h后，將體積為10 μL的CCK-8溶液添加到每個孔中并孵育2 h。用酶標儀檢測450 nm波長處每個孔的光密度(OD)值。

1.2.4Transwell檢測細胞侵襲能力 將基質(zhì)膠Matrigel(1∶8稀釋)加入24 孔板-Transwell 裝置的上室，并在 37 ℃ 下孵育 30 min。 將 600 μL 完全培養(yǎng)液填充到裝置的下室。將細胞(密度為5×107/L)在無血清培養(yǎng)液中于37 ℃培養(yǎng) 24 h進行饑餓處理。消化后，向上室中加入 100 μL 細胞溶液(密度為5×108/L)。培養(yǎng)24 h后，洗去未侵入的細胞。滲入下室的細胞用體積分數(shù)0.95乙醇固定，1 g/L結(jié)晶紫室溫染色20 min。隨機取5個400倍視野進行細胞計數(shù)。

1.2.5Western blot檢測TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1蛋白的表達 細胞裂解后通過離心(4 ℃，12 000 r/min，5 min)收集總蛋白。采用SDS-PAGE分離每個樣品中等量(50 μg)的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下將膜浸入50 g/L脫脂牛奶中2 h，封閉非特異性抗原。隨后，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜，然后將膜與相應的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。使用化學發(fā)光試劑顯像，采用Quantum One軟件分析條帶灰度值并計算TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1蛋白相對于GAPDH的表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組食管癌細胞TMEM9B-AS1的表達

對照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組食管癌細胞TMEM9B-AS1的表達水平分別為1.00±0.08、4.27±0.45和0.32±0.03，差異具有統(tǒng)計學意義(F=38.035，P<0.001)。提示轉(zhuǎn)染實驗成功。

2.2 TMEM9B-AS1對食管癌細胞增殖活力影響

結(jié)果表明，各組食管癌細胞不同時間的增殖活力比較，差異有統(tǒng)計學意義(F48 h=7.391，F(xiàn)72 h=19.190，P<0.05)。析因設計的方差分析結(jié)果顯示，不同時間和不同組別對食管癌細胞增殖活力均有影響，且二者存在交互效應，差異均具有統(tǒng)計學意義(F時間=4.347，F(xiàn)組別=18.681，F(xiàn)時間×組別=6.528，P<0.001)。兩兩比較的結(jié)果顯示，TMEM9B-AS1組的細胞增殖活力顯著高于對照組(P<0.05)，而siTMEM9B-AS1組細胞增殖活力則顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 TMEM9B-AS1對食管癌細胞的增殖活力影響

2.3 TMEM9B-AS1對食管癌細胞侵襲能力影響

對照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組癌細胞的浸入數(shù)分別為186.45±8.75、314.79±15.42和96.21±7.38，差異有顯著性(F=30.268，P<0.001)。與對照組比較，TMEM9B-AS1組細胞的侵襲能力顯著升高，而siTMEM9B-AS1組則顯著降低(P<0.05)。見圖1。

A：對照組；B：TMEM9B-AS1組；C：siTMEM9B-AS1組。

2.4 TMEM9B-AS1對食管癌細胞TCF7L2以及SATB1表達影響

對照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組食管癌細胞TCF7L2、SATB1的mRNA和蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(FmRNA=42.658、49.318，F(xiàn)蛋白=35.154、37.489，P<0.001)。與對照組比較，TMEM9B-AS1組細胞TCF7L2、SATB1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，siTMEM9B-AS1組則顯著降低(P<0.05)。見圖2和表2。

A：對照組，B：TMEM9B-AS1組，C：siTMEM9B-AS1組。

表2 TMEM9B-AS1對食管癌細胞TCF7L2-SATB1途徑影響

2.5 TMEM9B-AS1對食管癌細胞CTNNB1和COX-2表達影響

對照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組食管癌細胞CTNNB1、COX-2的mRNA和蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(FmRNA=54.309、56.084，F(xiàn)蛋白=36.448、42.738，P<0.001)。與對照組比較，TMEM9B-AS1組細胞CTNNB1、COX-2的mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，而siTMEM9B-AS1組則顯著降低(P<0.05)。見圖3和表3。

A：對照組，B：TMEM9B-AS1組，C：siTMEM9B-AS1組。

表3 TMEM9B-AS1對食管癌細胞中CTNNB1、COX-2的mRNA和蛋白表達影響

3 討 論

食管癌發(fā)病率逐年升高，但是目前尚無治療食管癌的有效手段[10-11]。由于食管癌細胞早期可侵入黏膜下層或者轉(zhuǎn)移至遠處器官，許多病人在術(shù)后短時間內(nèi)就會出現(xiàn)腫瘤局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移[12-13]。由于食管癌病人術(shù)后生存率低、預期生存期短、預后差[14]，因此，探究食管癌發(fā)病機制具有重大意義。

LncRNA是近年來的研究熱點，參與腫瘤的發(fā)生和進展。LncRNA具有許多生物學功能，首先，作為轉(zhuǎn)錄因子的組成部分，可以通過調(diào)控原癌基因和抑癌基因的轉(zhuǎn)錄參與食管癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15-17]。在轉(zhuǎn)錄后水平上，LncRNA可以通過調(diào)節(jié)mRNA的剪切水平調(diào)控基因的表達，如LncRNA DGCR5通過SRSF1介導的Mcl-1選擇性剪接參與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生[18]。此外，LncRNA也可通過競爭性內(nèi)源RNA形式調(diào)控微小RNA，最終調(diào)控mRNA表達，如LINC00460通過靶向miR-1224-5p促進食管癌轉(zhuǎn)移潛能和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。本研究主要分析新LncRNA TMEM9B-AS1在食管癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。編碼LncRNA TMEM9B-AS1的基因位于11號染色體(NC_000011.10)，轉(zhuǎn)錄本為389個堿基，表達于多種組織和器官，以結(jié)腸和腎臟為主。本研究利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式分別構(gòu)建了TMEM9B-AS1沉默和過表達的細胞模型，結(jié)果顯示，在TMEM9B-AS1的水平升高后，食管癌細胞增殖和侵襲能力顯著升高；而TMEM9B-AS1的水平降低后，細胞食管癌增殖和侵襲能力顯著降低。本文體外水平研究顯示TMEM9B-AS1具有促進食管癌細胞增殖和遷移的作用，說明其可能參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展。

為進一步分析TMEM9B-AS1在食管癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機制，我們檢測了TCF7L2-CTNNB1途徑以及COX-2和SATB1蛋白的表達。TCF7L2蛋白參與Wnt信號通路，并通過序列特異性方式與其啟動子結(jié)合來調(diào)節(jié)下游MYC基因的表達，其可調(diào)控CTNNB1的轉(zhuǎn)錄激活[5,20-21]。BAHRAMIAN等[22]收集腫瘤組織和鄰近組織研究發(fā)現(xiàn)，TCF7L2在食管癌和胃癌中顯著表達，可能在功能上參與癌癥細胞的增殖、凋亡和血管生成通路。TCF7L2在食管鱗狀細胞癌細胞中通過ERK1/2依賴性途徑調(diào)控促癌基因轉(zhuǎn)錄，參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展[23-24]。以上研究表明TCF7L2過表達可能對食管癌的發(fā)生具有促進作用。而CTNNB1基因是編碼β-catenin蛋白的基因，其是促進食管癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移的重要細胞內(nèi)信號通路，抑制該通路也是治療食管癌的重要思路[25-27]。在哺乳動物中，TCF7L2可以和β-catenin通過DNA結(jié)合位點進行結(jié)合，共同控制和調(diào)控Wnt信號通路。此外，SATB1是一種核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合蛋白，參與調(diào)控染色質(zhì)的合成，在哺乳動物細胞中，SATB1直接與β-catenin相互作用，并通過與其啟動子結(jié)合來調(diào)節(jié)Wnt靶標的表達[28-30]。并通過調(diào)控全局染色質(zhì)調(diào)節(jié)眾多基因的表達，研究已經(jīng)顯示SATB1通過上調(diào)FN1和PDGFRB在食管癌中發(fā)揮原癌基因的作用[31]。同時，COX-2蛋白對食管癌也具有促進作用，研究顯示miR-128的甲基化沉默通過提高COX-2的表達促進食管癌的發(fā)展[32]。以上4種分子TCF7L2-SATB1途徑，COX-2和CTNNB1均對食管癌細胞增殖、遷移以及發(fā)生發(fā)展具有促進作用。本研究結(jié)果顯示，在食管癌細胞內(nèi)過表達TMEM9B-AS1，可以明顯促進食管癌細胞中TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1的mRNA和蛋白表達，而抑制TMEM9B-AS1在食管癌細胞內(nèi)過表達則可以促進上述指標的mRNA和蛋白表達水平。Wnt/β-catenin信號通路在各種類型的癌癥中通過調(diào)節(jié)COX-2基因的表達來影響疾病的發(fā)展[33]。因此，COX-2是Wnt/β-catenin信號通路下游的分子。

本文研究結(jié)果表明，TMEM9B-AS1很可能是通過TCF7L2-SATB1途徑來抑制或者促進下游分子COX2的表達以及減少CTNNB1與TCF7L2的結(jié)合，從而影響食管癌細胞的增殖和侵襲能力，參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展。CARROSSINI等[34]研究結(jié)果顯示，COX-2表達和食管癌病人異位脂肪量呈顯著正相關(guān)，并在腺癌中檢測到共定位，但在食管鱗狀細胞癌中未檢測到。CONG等[35]在食管鱗狀細胞癌中檢測到48.3%的SATB1表達量，而正常組織只有7.8%，但分析結(jié)果顯示SATB1表達與臨床病理學特征沒有顯著相關(guān)性。但SATB1高表達病人的生存期明顯短于SATB1低表達者，因此，高SATB1表達是食管鱗狀細胞癌病人的獨立預后因素，并且可作為其靶向治療的潛在分子。后續(xù)臨床研究應關(guān)注到COX-2和SATB1表達在兩種類型癌癥中的差別。

綜上所述，上調(diào)TMEM9B-AS1表達可以通過TCF7L2-SATB1途徑，提高COX-2和CTNNB1的表達，并增強食管癌細胞增殖和侵襲的能力。但目前研究僅僅在體外細胞水平驗證了TMEM9B-AS1在食管癌中的作用，仍缺乏組織水平和動物模型的體內(nèi)驗證，尤其是在轉(zhuǎn)基因工具鼠中的驗證效果更有說服力。其次，食管癌呈現(xiàn)出兩種主要的組織學亞型(腺癌和鱗狀細胞癌)，兩種亞型在病理學和分子機制方面均存在很大差異，因此應研究分子以及信號通路在不同類型食管癌中的表達差異。再者關(guān)于4種分子TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1在食管癌細胞里互相作用機制仍未探究，因此未來研究應重點關(guān)注和解決TMEM9B-AS1在食管癌機制和治療中的臨床意義，其促癌的作用仍需要進行體內(nèi)研究，調(diào)控TCF7L2-SATB1途徑的分子機制也需要進一步研究和探索。