急性胰腺炎患者血漿內(nèi)皮細胞微粒水平的改變及其形成機制

王迪迪， 劉秋圓， 胡 翠， 王兵兵， 韋亞蓉， 丁 浩， 劉曉昌， 梅 俏

安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 合肥 230022

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是消化內(nèi)科常見的急腹癥，約20%的患者可發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)，引起嚴重的全身炎癥反應綜合征，SAP病死率高達30%，但其發(fā)病機制尚未完全闡明[1-2]。大量研究將AP的發(fā)病機制歸因于胰酶激活和胰腺自身消化，繼發(fā)免疫介導損傷和胰腺微循環(huán)障礙[3]。研究[4]表明，血管內(nèi)皮細胞功能損傷可能是AP微循環(huán)障礙的核心機制之一。近年來，高脂血癥導致的AP發(fā)病率逐年增加，其中三酰甘油代謝產(chǎn)生的游離脂肪酸和乳糜微粒引起胰腺毛細血管阻塞并誘發(fā)胰腺微循環(huán)障礙，游離脂肪酸通過刺激炎癥介質(zhì)合成，抑制線粒體功能，損傷胰腺血管內(nèi)皮細胞和腺泡細胞，導致胰腺炎的發(fā)生[5]。因此，內(nèi)皮細胞功能改變在AP發(fā)病過程中具有重要作用。

內(nèi)皮細胞微粒(endothelial microparticles，EMP)是內(nèi)皮細胞受到各種刺激時釋放直徑為0.1～1 μm的微囊泡，內(nèi)含大量mRNA、microRNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等，作為細胞間轉移炎癥信號物質(zhì)的載體，是近年來內(nèi)皮細胞功能研究的熱點[6]。研究[7-10]表明系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性腎臟病、急性冠狀動脈綜合征、糖尿病等患者中EMP水平均明顯升高，同時EMP通過加重機體的血管內(nèi)皮細胞損傷，促進組織炎癥反應過程。但是在胰腺炎的發(fā)病過程中機體EMP的水平變化尚不清楚。因此，本研究通過檢測不同嚴重程度AP患者血漿中EMP水平，以及通過體外實驗觀察AP患者血漿刺激EMP形成的初步機制，探討EMP在AP患者發(fā)病機制中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集本院2020年8月—2021年6月60例AP住院患者的血液標本，分為輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis，MAP)組(n=23)、中度重癥急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis，MSAP)組(n=23)和重癥急性胰腺炎(SAP)組(n=14)。AP診斷標準參考2012亞特蘭大分類新標準共識[11]，并選取20例健康體檢者作為對照組。

1.2 材料與儀器 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)購自美國ScienCell公司；BI血清購自以色列生物科技公司; PBS、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國 Hyclone公司; 青霉素-鏈霉素混合液、0.25% 胰蛋白酶購自北京索萊寶生物科技有限公司;LPS購自美國sigma公司(B5-L2880)；內(nèi)皮素(endothelin 1，ET-1)、血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、血管內(nèi)皮細胞黏附分子1(VCAM-1)ELISA 試劑盒均購自武漢新啟迪生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購自biosharp公司；RT-PCR 反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本 Takara 公司;GAPDH引物、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、VCAM-1、NADPH氧化酶及P-選擇素引物由上海生工生物工程股份有限公司設計與合成;ABI QuantStudio6 Flex qRT-PCR 儀(賽默飛世爾科技有限公司)。Transwell inserts(型號3413，美國康寧公司); CD31 APC、CD41PE(美國eBioscience 公司);Flow-Count Fluorspheres(美國Beckman公司);CytoFLEX 分析流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司);多功能酶標儀(美國PE公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 EMP分離 收集患者入院后(24 h內(nèi))次日晨血5 mL于檸檬酸鈉抗凝管中，采用差速離心法，以1500 r/min離心10 min獲取富血小板血漿，再以4000 r/min離心30 min，獲取貧血小板血漿(PPP)，于-80 ℃保存[6]。

1.3.2 EMP檢測 將PPP解凍，取50 μL PPP，加入5 μL CD31-APC、5 μL CD41-PE充分混合，室溫下避光孵育30 min，再加入400 μL Bindbuffer、40 μL Flow-CountTM熒光計數(shù)微球充分混合，采用流式細胞儀檢測 EMP，使用5 μL兔抗人PE-IgG1及5 μL PE-IgG1作為對照。CD31-APC陽性及CD41-PE陰性為 EMP，根據(jù)熒光計數(shù)微球計算 EMP 水平。

1.3.3 內(nèi)皮細胞功能相關因子檢測 AP患者血漿中ET-1、vWF、NO、VCAM-1水平，按照ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.3.4 HUVEC細胞培養(yǎng)和實驗分組 HUVEC細胞復蘇，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，使用 10% BI血清、1% 青霉素-鏈霉素溶液進行培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀況2～3 d更換1次培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察細胞匯合程度達到 80% 時，用0.25% 的胰蛋白酶消化細胞，重懸細胞并計數(shù)，以5×104個/孔的密度接種于24孔(0.4 μm)的 Transwell inserts中。將接種于Transwell inserts中的HUVEC細胞，培養(yǎng)24 h，饑餓處理12 h后，另各取MAP、MSAP、SAP患者的PPP，采用超速離心法(100 000×g)4 ℃離心2 h以去除AP患者血漿中的EMP[12]，取上清，分別加入到Transwell的下室，與上室的HUVEC共培養(yǎng)6 h，10 μg/mL的LPS作為陽性對照組，CCK-8法檢測HUVEC細胞活力。

1.3.5 HUVEC上清液中EMP檢測 收集Transwell inserts中上室的細胞培養(yǎng)液，再以4000 r/min離心30 min，流式細胞儀檢測方法同AP患者血漿中EMP的檢測。

1.3.6 HUVEC中eNOS、iNOS、ICAM-1、VCAM-1、NADPH氧化酶及P-選擇素的mRNA表達水平 用Trizol提取Transwell inserts中HUVEC細胞的總RNA，用Takara公司的逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為 cDNA，采用 QuantiNova SYBR Green PCR 試劑盒進行定量 PCR 反應，反應條件為 95 ℃、2 min 1個循環(huán); 95 ℃、5 s，60 ℃、15 s，72 ℃、20 s 共 40 個循環(huán)。所用qRT-PCR引物序列見表1。用 2-ΔΔCt方法計算eNOS、iNOS、ICAM-1、VCAM -1、NADPH氧化酶及P-選擇素的mRNA的相對表達量。

1.3.7 DCFH-DA法檢測HUVEC中的細胞活性氧(ROS)含量 收集Transwell inserts中HUVEC，500×g離心5 min,加入1 mL無血清培養(yǎng)液稀釋的終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min；用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，500×g離心5 min,重懸于400 μL無血清培養(yǎng)液，立即采用流式細胞儀檢測。

1.3.8 JC-1染色法檢測HUVEC的線粒體膜電位 收集Transwell inserts中HUVEC，PBS洗滌細胞，500×g離心5 min,分別加入1 mL 細胞培養(yǎng)液和1 mL JC-1染色工作液，混勻，37 ℃孵育20 min；用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，500×g離心5 min,重懸于400 μL細胞培養(yǎng)液，立即采用流式細胞儀檢測。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers of qRT-PCR

2 結果

2.1 一般資料 60例AP患者中膽源性28例，高脂血癥型20例，混合型3例，酒精性1例，其他8例。各組WBC、中性粒細胞、CRP、Alb、ALT、AST、ALP、LDH、BUN、CRE、鉀、鈉、鈣、血糖水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；與MAP組比較，MSAP和SAP組的APACHEⅡ評分、BISAP評分、Ranson評分、CT評分均有統(tǒng)計學差異(P值均<0.05)(表2)。

2.2 AP患者血漿中EMP水平的檢測 與對照組相比[(188.09±17.20)個/μL]，MAP組[(369.41±156.78)個/μL]、MSAP組[(997.29±186.24) 個/μL]、SAP組[(1 769.00±274.62)個/μL]EMP水平明顯升高(P值均<0.05)。與MAP組、MSAP組比較，SAP組EMP水平明顯升高(P值均<0.05)(圖1)。

2.3 不同嚴重程度的AP患者血漿中EMP水平與臨床特征的關聯(lián)分析 AP患者EMP水平與APACHEⅡ、BISAP評分、Ranson評分、CT評分、CRP均呈正相關(r值分別為0.686 2、0.777 3、0.713 8、0.771 8、0.473 9，P值均<0.01)。

表2 AP患者臨床資料Table 2 Clinical data of acute pancreatitis patients

2.4 AP患者血漿中ET-1、vWF、NO、VCAM-1水平的檢測 與對照組相比，MAP組、MSAP組、SAP組的ET-1、vWF、VCAM-1水平明顯升高，NO水平明顯降低(P值均<0.05)(圖2)。

2.5 AP患者血漿對HUVEC中EMP合成水平的影響 與對照組相比，MAP組患者血漿對HUVEC中EMP水平影響不大(P>0.05)，MSAP和SAP組血漿可促進HUVEC中EMP大量釋放(P值均<0.05)，提示AP患者血漿中含有致內(nèi)皮細胞損傷炎性介質(zhì)，加重HUVEC損傷和EMP生成(圖3)。

2.6 AP患者血漿對HUVEC中eNOS、iNOS、ICAM-1、P-選擇素、VCAM -1、NADPH氧化酶的mRNA表達水平的影響 用10 μg/mL的LPS作陽性對照，分別用正常人的血漿和不同嚴重程度AP患者的血漿刺激HUVEC 6 h，CCK-8檢測提示HUVEC活力為76.90%。eNOS、iNOS、ICAM-1、VCAM -1、NADPH氧化酶及P-選擇素的mRNA表達水平均增加，與對照組比較，除MAP組的VCAM-1和eNOS外，其余各組的eNOS、iNOS、ICAM-1、P-選擇素、VCAM -1、NADPH氧化酶的mRNA表達水平均顯著升高(P值均<0.05)(圖4)。

注：P1，EMP所在區(qū)域；P2，藻紅蛋白(PE)和別藻藍蛋白(APC)雙陽性區(qū)域；P3，陰性顆粒所在區(qū)域；P4，藻紅蛋白(PE)陽性區(qū)域。圖1 不同嚴重程度AP患者的EMP水平檢測Figure 1 EMP level of AP patients with different severity

圖2 AP患者血漿中ET-1、vWF、NO、VCAM-1水平改變

2.7 AP患者血漿對HUVEC中ROS水平的影響 與對照組ROS水平(4.57%±0.19%)相比，MAP組(5.70%±0.38%)、MSAP組(7.40%±0.10%)、SAP組(12.95%±0.26%)、LPS組(63.00%±0.55%)患者HUVEC中的ROS水平均升高明顯(P值均<0.05)。

2.8 AP患者血漿對HUVEC中線粒體膜電位的影響 與對照組線粒體膜電位下降率(0.54%±0.39%)相比，MAP組(2.24%±0.30%)、MSAP組(7.48%±2.49%)、SAP組(12.90%±1.61%)、LPS組(63.17%±1.65%)HUVEC中的線粒體膜電位下降更明顯(P值均<0.05)。

3 討論

AP發(fā)生過程中，胰腺微血管在組胺、白三烯、緩激肽等炎癥介質(zhì)的作用下促進血管內(nèi)皮細胞收縮,同時IL-1β、IL-6、IL-18、TNFα等細胞因子通過內(nèi)皮細胞骨架的重構，導致血管內(nèi)皮通透性增加，胰腺微循環(huán)血管屏障受到破壞[13]。另一方面血管內(nèi)皮細胞活化或受到刺激時EMP釋放增加。EMP是一種內(nèi)皮功能障礙的血漿標志物，由內(nèi)皮細胞在激活、損傷或凋亡時釋放，可將大量的生物活性分子，如生長因子、蛋白酶、黏附分子、DNA和microRNA轉移到受體細胞，加重炎癥損傷[14]。因此胰腺微血管內(nèi)皮細胞結構及功能受損是AP過程中的重要發(fā)病機制。

EMP水平升高是炎癥性疾病的臨床特征，Parker等[7]研究表明系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)與內(nèi)皮細胞損傷和功能障礙有關，活動性SLE患者EMP水平明顯升高，降低EMP水平有助于改善SLE患者的心血管風險,改善炎癥疾病活動度同時可改善EMP水平，表明抑制炎癥是影響EMP變化的關鍵因素。Pernomian等[15]研究表明糖尿病患者高血糖通過氧化應激反應，促使EMP釋放增加，誘導促炎途徑并發(fā)心血管功能障礙，導致心血管事件的發(fā)生，表明EMP在糖尿病疾病發(fā)展過程中起到關鍵作用。本研究采用CD31、CD41檢測EMP[定義CD31(+)CD41(-)為EMP]，結果發(fā)現(xiàn)，AP患者EMP水平升高，且SAP組患者的EMP水平明顯高于MAP組和MSAP組，EMP水平與疾病的嚴重程度呈正相關，表明EMP可作為評估AP炎癥程度的生物學指標。

注：Q2-UL,EMP所在區(qū)域；Q2-UR,藻紅蛋白(PE)和別藻藍蛋白(APC)雙陽性區(qū)域； Q2-LL,陰性顆粒所在區(qū)域； Q2-LR,藻紅蛋白(PE)陽性區(qū)域。

圖4 AP患者血漿對HUVEC中eNOS、iNOS、ICAM-1、VCAM -1、NADPH氧化酶及P-選擇素 mRNA表達的影響

內(nèi)皮細胞損傷和功能障礙在炎癥反應中的作用逐漸被認識，是近年來內(nèi)皮細胞功能研究的熱點[14]。TNFα作為炎癥反應過程中最早出現(xiàn)的炎癥因子，可激活中性粒細胞釋放彈性蛋白酶，增加血管內(nèi)皮細胞的通透性[16]。內(nèi)皮細胞以TLR4依賴的方式響應LPS，導致隨后促炎細胞因子的釋放和黏附分子的表達增強，進一步刺激炎癥級聯(lián)反應[17]。因此，在AP的病理生理過程中，以TNFα為主要代表的炎癥細胞因子和LPS等均具有損傷血管內(nèi)皮細胞的作用。在AP的發(fā)病過程中，研究表明炎癥反應與內(nèi)皮損傷之間存在一定的相互作用關系，且同時伴隨著EMP水平的改變。本研究發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，MAP組、MSAP組、SAP組的內(nèi)皮細胞功能標志物ET-1、vWF、VCAM-1水平明顯升高，表明AP中存在內(nèi)皮細胞損傷及功能障礙，同時與EMP水平改變呈現(xiàn)同步趨勢。

氧化損傷機制在EMP的形成中具有重要作用。線粒體功能障礙在誘導ROS合成和內(nèi)皮功能障礙等方面起促進作用。研究[18]表明,高葡萄糖刺激可以增加EMP的形成，ROS水平增加，促氧化活性提高，EMP形成又可導致糖尿病患者更嚴重的血管功能障礙。有研究[3,19]表明在L-精氨酸誘導的SAP實驗模型中血管內(nèi)皮細胞受損，細胞內(nèi)儲存的Ca2+瞬間釋放，Ca2+與鈣調(diào)蛋白結合激活一氧化氮合酶，一氧化氮合酶和NADPH氧化酶是細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的主要來源，引起氧化應激，降低線粒體膜電位，引起內(nèi)皮細胞氧化損傷和促進內(nèi)皮功能障礙。鐵超載可引起內(nèi)皮細胞ROS和Ca2+內(nèi)流增加，線粒體功能損傷，膜電位喪失，導致EMP水平顯著增加[20]。糖尿病患者通過增強腎素-血管緊張素系統(tǒng)，引起血管氧化應激和NADPH氧化酶活性，產(chǎn)生的ROS激活EMP生成[15]。Chen等[21]研究表明糖尿病患者晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)加速形成，AGE通過NADPH氧化酶激活ROS途徑釋放EMP。上述研究表明，ROS增加和線粒體功能障礙是EMP形成的重要機制之一。因此，在體外實驗中，使用含有炎癥介質(zhì)的AP患者的血漿刺激HUVEC，結果發(fā)現(xiàn)EMP水平明顯升高，eNOS、iNOS、ICAM-1、VCAM -1、NADPH氧化酶及P-選擇素的mRNA表達增加，細胞中ROS的水平升高，線粒體膜電位下降明顯，從細胞水平證明AP患者血漿中含有致內(nèi)皮損傷炎性介質(zhì)，通過ROS增加和線粒體功能障礙，加重內(nèi)皮細胞損傷和EMP形成，是AP發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)。

綜上所述，AP發(fā)病過程中炎癥介質(zhì)通過氧化機制和線粒體功能障礙損傷血管內(nèi)皮細胞，形成大量 EMP并與AP嚴重程度相關，表明 EMP可作為 AP 疾病嚴重程度評估的指標。但EMP在AP發(fā)病過程中的具體作用機制和EMP形成的精確機制尚不明確，均需要進一步的臨床和基礎研究加以探討。

倫理學聲明：本研究于2019年10月15日經(jīng)安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，批號：PJ2018-12-17，所有研究對象均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：王迪迪、劉秋圓負責課題設計，資料分析，撰寫論文；胡翠、王兵兵、韋亞蓉、丁浩參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉曉昌、梅俏負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。